水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用。

背景技术

赭曲霉毒素是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素，其中，毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)。OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。世界各国均重视对OTA的检测和控制，制定了相关限量标准，以便于确保食品安全和消除国际贸易中的技术壁垒。因此，开展赭曲霉毒素的抑制与去除技术研究，对于保护人类和动物健康，确保国家食品安全和粮食安全具有重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种水解酶NUDIX，能够降解赭曲霉毒素A，减少解赭曲霉毒素A对动物及人类健康的危害。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了水解酶NUDIX，编码所述水解酶NUDIX的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，还包括氨基酸序列SEQ ID NO.1中的至少一个氨基酸突变形成的氨基酸序列。

本发明提供了编码所述的水解酶NUDIX的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了包括所述基因的重组载体。

本发明提供了水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用。

优选的是，所述的应用包括降解饲料或食品中的赭曲霉毒素A。

本发明至少包括以下有益效果：

本申请提供的水解酶NUDIX够降解赭曲霉毒素A，减少解赭曲霉毒素A对动物及人类健康的危害。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为水解酶NUDIX的SDS-PAGE纯化图；

图2为水解酶NUDIX在不同温度下的活性图；

图3为水解酶NUDIX在不同pH下的活性图。

其中，图1中1：蛋白marker；2：水解酶NUDIX；3：对照组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本申请的实施例提供了水解酶NUDIX，编码所述水解酶NUDIX的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，SEQ ID NO.1为：MAQGAFVIIQNDGRDILLVKRKHSLMGFARRRDRRRNTSRSRQRGLRRNRLRDHHKKSRVKAGIRYTARFHRSHYRRNSADERAGNRRLTLVFPKPAAAVHGAEQKTANKRRTQWGGKSGSPRPESVIHPSAKKKAESI；

其中，该酶基因编码139个氨基酸和一个终止密码子，没有信号肽，因此，成熟的水解酶NUDIX的理论分子量为17kDa。

本申请的实施例提供了编码所述的水解酶NUDIX的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2为：atggcacaaggcgcttttgtcatcatacaaaatgacgggcgggacatattgctcgtaaaacgaaaacattcccttatgggatttgcccggcggcgggatcgcagaaggtgaaacacctgaagccgcagccgtcagagaggccttcgaagaaaccggttataacgtgaccatcataaaaaaagccggtgagtatgaaaggccggcatttgaagatacacagcacgttttcatcggagccattaccggaggaactccgctgatgaacgggccggaaaccgccgccttacgctggttttccccaaaccggctgccgctgttcatggtgccgaacagaaaacagcaaataaaagacggactcaatggggcggcaaatcataaggcagtccttaaagaccggaatctgttatccatccttgatctgctaagaaaaaagctgagagtatag；

其中，本申请通过全基因合成的方法获得了本申请的成熟的水解酶NUDIX基因，DNA全序列分析结果表明，水解酶NUDIX结构基因全长445bp。将水解酶NUDIX序列及其氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，其氨基酸序列与来源于贝莱斯芽孢杆菌NUDIX氨基酸序列一致性为86％，说明本发明的水解酶NUDIX是一种新的OTA解毒酶。

本申请提供了包括所述基因的重组载体，本申请优选的重组载体命名为pET28a-NUDIX。将本发明的水解酶NUDIX基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的水解酶NUDIX基因插入到质粒pET28a上的BamHI和HindIII限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET28a-NUDIX。

示例性地，本申请优选的水解酶NUDIX的重组菌株为大肠杆菌。

示例性地，水解酶NUDIX的制备方法，包括以下步骤：

1.用包含编码水解酶NUDIX的基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2.培养重组菌株，诱导水解酶NUDIX表达；

3.分离纯化获得的水解酶NUDIX。

通过上述方法制备的水解酶NUDIX的最适温度37℃，最适pH为7.0，在pH6.0-7.0范围内仍保持60％以上的活性。在最适温度和最适pH下，本发明的水解酶NUDIX对OTA的降解率为66％。

本申请提供了水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用。

在另一种技术方案中，所述的应用包括降解饲料或食品中的赭曲霉毒素A。

该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少OTA对动物及人类健康的危害。

实施例

一、试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET28a及大肠杆菌菌株Bl21(DE3)；

2、培养基：

大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCL,pH7.0)。

二、编码水解酶NUDIX的基因的获取

利用人工化学合成的方法获得来源于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)水解酶NUDIX的基因片段，并在5’端引入内切酶位点BamHI，在3’端引入内切酶位点HindIII。

三、水解酶NUDIX的制备

将表达载体pET28a进行双酶切(BamHI+HindIII)，同时将编码成熟水解酶NUDIX的基因双酶切(BamHI+HindIII)，切出编码水解酶NUDIX的基因片段与表达载体pET28a连接，获得含有水解酶NUDIX的重组质粒pET28a-NUDIX，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/NUDIX。

取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株，接种于100mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养2-3h后，当培养液的OD

四、水解酶NUDIX的性质测定

用高效液相色谱检测水解酶NUDIX的酶活，具体方法如下：

A、OTA标准储备液：称1mg标品，用10mL甲醇溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准液，-20℃保存。

B、样品的制备：取纯化好的水解酶NUDIX酶液900μL，加入100μL的OTA标准储备液，使OTA的终浓度为10μg/ml，37℃，220rpm，避光培养48h。

C、样品衍生化：取待测样品100μL，加入400μL 50％乙腈水，500μL OPA衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与OTA的标品的峰图对比，来确定水解酶NUDIX的酶活性。

D、测定水解酶NUDIX的最适温度

在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下，以OTA为底物，终浓度为1μg/mL，取100μL底物并加入900μL的水解酶NUDIX酶液，反应20min，然后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待HPLC检测。

如图2所示，本发明的水解酶NUDIX的最适温度为37℃。

E、检测水解酶NUDIX的最适pH

选择不同的缓冲溶液：100mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH3.0–8.0)，100mM的Tris-Hcl(pH8-9)，在上述不同的pH缓冲液下进行酶促反应，以测定其最适pH。

如图3所示，本发明的水解酶NUDIX的最适pH为7.0。

同时，本发明还对水解酶NUDIX的温度稳定性和pH稳定性进行测定，结果表明水解酶NUDIX具有较好的温度稳定性和pH稳定性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。