水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用
文献发布时间:2023-06-19 19:33:46
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体地,涉及一种水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用。
背景技术
赭曲霉毒素是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素,其中,毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(OchratoxinA,OTA)。OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性,以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性,对动物和人体健康有很大的潜在危害。世界各国均重视对OTA的检测和控制,制定了相关限量标准,以便于确保食品安全和消除国际贸易中的技术壁垒。因此,开展赭曲霉毒素的抑制与去除技术研究,对于保护人类和动物健康,确保国家食品安全和粮食安全具有重大的意义。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种水解酶NUDIX,能够降解赭曲霉毒素A,减少解赭曲霉毒素A对动物及人类健康的危害。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,本发明提供了水解酶NUDIX,编码所述水解酶NUDIX的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的,还包括氨基酸序列SEQ ID NO.1中的至少一个氨基酸突变形成的氨基酸序列。
本发明提供了编码所述的水解酶NUDIX的基因,所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提供了包括所述基因的重组载体。
本发明提供了水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用。
优选的是,所述的应用包括降解饲料或食品中的赭曲霉毒素A。
本发明至少包括以下有益效果:
本申请提供的水解酶NUDIX够降解赭曲霉毒素A,减少解赭曲霉毒素A对动物及人类健康的危害。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为水解酶NUDIX的SDS-PAGE纯化图;
图2为水解酶NUDIX在不同温度下的活性图;
图3为水解酶NUDIX在不同pH下的活性图。
其中,图1中1:蛋白marker;2:水解酶NUDIX;3:对照组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本申请的实施例提供了水解酶NUDIX,编码所述水解酶NUDIX的氨基酸序列如SEQID NO.1所示,SEQ ID NO.1为:MAQGAFVIIQNDGRDILLVKRKHSLMGFARRRDRRRNTSRSRQRGLRRNRLRDHHKKSRVKAGIRYTARFHRSHYRRNSADERAGNRRLTLVFPKPAAAVHGAEQKTANKRRTQWGGKSGSPRPESVIHPSAKKKAESI;
其中,该酶基因编码139个氨基酸和一个终止密码子,没有信号肽,因此,成熟的水解酶NUDIX的理论分子量为17kDa。
本申请的实施例提供了编码所述的水解酶NUDIX的基因,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,SEQ ID NO.2为:atggcacaaggcgcttttgtcatcatacaaaatgacgggcgggacatattgctcgtaaaacgaaaacattcccttatgggatttgcccggcggcgggatcgcagaaggtgaaacacctgaagccgcagccgtcagagaggccttcgaagaaaccggttataacgtgaccatcataaaaaaagccggtgagtatgaaaggccggcatttgaagatacacagcacgttttcatcggagccattaccggaggaactccgctgatgaacgggccggaaaccgccgccttacgctggttttccccaaaccggctgccgctgttcatggtgccgaacagaaaacagcaaataaaagacggactcaatggggcggcaaatcataaggcagtccttaaagaccggaatctgttatccatccttgatctgctaagaaaaaagctgagagtatag;
其中,本申请通过全基因合成的方法获得了本申请的成熟的水解酶NUDIX基因,DNA全序列分析结果表明,水解酶NUDIX结构基因全长445bp。将水解酶NUDIX序列及其氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对,其氨基酸序列与来源于贝莱斯芽孢杆菌NUDIX氨基酸序列一致性为86%,说明本发明的水解酶NUDIX是一种新的OTA解毒酶。
本申请提供了包括所述基因的重组载体,本申请优选的重组载体命名为pET28a-NUDIX。将本发明的水解酶NUDIX基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间,使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案,优选为将本发明的水解酶NUDIX基因插入到质粒pET28a上的BamHI和HindIII限制性酶切位点之间,使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控,得到重组大肠表达质粒pET28a-NUDIX。
示例性地,本申请优选的水解酶NUDIX的重组菌株为大肠杆菌。
示例性地,水解酶NUDIX的制备方法,包括以下步骤:
1.用包含编码水解酶NUDIX的基因的重组载体转化宿主细胞,得到重组菌株;
2.培养重组菌株,诱导水解酶NUDIX表达;
3.分离纯化获得的水解酶NUDIX。
通过上述方法制备的水解酶NUDIX的最适温度37℃,最适pH为7.0,在pH6.0-7.0范围内仍保持60%以上的活性。在最适温度和最适pH下,本发明的水解酶NUDIX对OTA的降解率为66%。
本申请提供了水解酶NUDIX在降解赭曲霉毒素A中的应用。
在另一种技术方案中,所述的应用包括降解饲料或食品中的赭曲霉毒素A。
该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业,减少OTA对动物及人类健康的危害。
实施例
一、试验材料和试剂
1、菌株及载体:大肠杆菌表达载体pET28a及大肠杆菌菌株Bl21(DE3);
2、培养基:
大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCL,pH7.0)。
二、编码水解酶NUDIX的基因的获取
利用人工化学合成的方法获得来源于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)水解酶NUDIX的基因片段,并在5’端引入内切酶位点BamHI,在3’端引入内切酶位点HindIII。
三、水解酶NUDIX的制备
将表达载体pET28a进行双酶切(BamHI+HindIII),同时将编码成熟水解酶NUDIX的基因双酶切(BamHI+HindIII),切出编码水解酶NUDIX的基因片段与表达载体pET28a连接,获得含有水解酶NUDIX的重组质粒pET28a-NUDIX,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/NUDIX。
取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株,接种于100mL LB培养液中,37℃220rpm振荡培养2-3h后,当培养液的OD
四、水解酶NUDIX的性质测定
用高效液相色谱检测水解酶NUDIX的酶活,具体方法如下:
A、OTA标准储备液:称1mg标品,用10mL甲醇溶解,配制成浓度为100μg/mL的标准液,-20℃保存。
B、样品的制备:取纯化好的水解酶NUDIX酶液900μL,加入100μL的OTA标准储备液,使OTA的终浓度为10μg/ml,37℃,220rpm,避光培养48h。
C、样品衍生化:取待测样品100μL,加入400μL 50%乙腈水,500μL OPA衍生液,混匀30s,衍生2min内进样,过滤膜待测。通过与OTA的标品的峰图对比,来确定水解酶NUDIX的酶活性。
D、测定水解酶NUDIX的最适温度
在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下,以OTA为底物,终浓度为1μg/mL,取100μL底物并加入900μL的水解酶NUDIX酶液,反应20min,然后沸水煮10min,让酶失活。冷却至室温后过膜,待HPLC检测。
如图2所示,本发明的水解酶NUDIX的最适温度为37℃。
E、检测水解酶NUDIX的最适pH
选择不同的缓冲溶液:100mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH3.0–8.0),100mM的Tris-Hcl(pH8-9),在上述不同的pH缓冲液下进行酶促反应,以测定其最适pH。
如图3所示,本发明的水解酶NUDIX的最适pH为7.0。
同时,本发明还对水解酶NUDIX的温度稳定性和pH稳定性进行测定,结果表明水解酶NUDIX具有较好的温度稳定性和pH稳定性。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
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