具有用于处理细胞材料的插入件的装置

技术领域

本发明涉及一种用于处理细胞的装置，该用于处理细胞的装置用于医疗、环境、食品应用和基于生物的工业(包括酵母、乳杆菌、藻类和细胞组织生成系统)，特别包括靶向灭活、生物活性化合物的提取和细胞生长和/或细胞化合物的刺激，其中，所述处理在插入件中提供的处理空间中进行，并且涉及一种用于在这样的装置中处理细胞的方法。

背景技术

众所周知，原核细胞和真核细胞会受到电场施加的影响。根据所施加的电场强度，可发生细胞生长的刺激以及细胞死亡、微生物的灭活或细胞成分的特异性提取(例如Buchmann L和Mathys A(2019)的Perspective on Pulsed Electric Field Treatment inthe Bio-based Industry，《生物工程与生物技术前言》7:265，doi:10.3389/fbioe.2019.00265)。

EP-2 308 969B1描述了一种脉冲电场(PEF)方法，其中通过暴露1个至100个电场强度脉冲，细胞材料悬浮在导电液体中，该细胞材料位于两个电极之间，使得在0.1ns至100ns的时段内，在两个电极之间的发生的电压增加为电场强度脉冲的目标电压的10％至90％，电场强度脉冲具有5ns至5000ns的脉冲持续时间，并且在达到目标电压时，电场强度脉冲具有0.5kV/cm至50kV/cm的电场强度，这表示细胞增殖加速和/或细胞成分形成增加。

在EP 2 308 969 B1中使用的用于处理细胞材料的装置中，将具有上述细胞材料悬浮液的电穿孔试管通过布置两个电极进行连续泵送，并暴露于导电液体中的电场(EP-2308 969B1的[0020]段)。

作为替代方案，已经建议在容器(也称为生物反应器)中提供待处理的材料，并且为了进行处理，在与所述容器的出口连接的管线中传送材料。所述管线的另一端与进入所述容器的入口连接，使得该容器和该管线形成流体回路。所述管线也被称为旁路，参见例如Buchmann L和Mathys A(2019)的Perspective on Pulsed Electric Field Treatment inthe Bio-based Industry，《生物工程与生物技术前言》7:265,doi:10.3389/fbioe.2019.00265(图1)；Galván-D′Alessandro等人，Fermentation Assisted by PulsedElectric Field and Ultrasound:A Review，Fermentation 2018，4，1；doi:10.3390(图2)；DE 10 2010 019 937 A1)。

作为另一种替代方案，已经建议在生物反应器中用电脉冲进行细胞材料的处理。为此，将用于发射电脉冲的电极直接布置在生物反应器中，任选地与混合单元一起布置(例如US-9,096,847，用于诱导经处理的细胞材料的代谢活性)。然而，这种装置存在工艺条件不均匀的问题。混合单元不能在整个生物反应器中提供可靠的均匀条件，并且还干扰由电极发射的电脉冲。这是一个问题，因为如上所述影响细胞增殖取决于对工艺条件的精确遵守。使用US-9,096,847的装置，不可能在整个反应容器中获得均匀的工艺条件，因此也不能获得均匀处理的细胞材料。此外，由于必须持续地操作混合单元，该装置具有高能量需求。

在US-2012/0040428A1中，描述了类似的装置。在此，建议电极设置在具有开口的壳体中。待处理材料流过这些开口并且在相邻电极之间具有高电阻的路径中被处理。具有电极的壳体永久地布置在生物反应器中。

特别是对于进行在线分析方法，上述装置不是最佳的。

因此，本发明的目的是提供一种用于以有效且成本有效的方式处理细胞的装置和方法。

发明内容

本发明已经解决了上述问题。

详细地，本发明涉及用于处理细胞的装置的插入件，其中所述插入件包括用于发射电脉冲的电极并且具有电连接件，其特征在于，在所述插入件中提供有处理空间，其中所述处理空间能够被由所述电极发射的电脉冲和由此产生的电场穿透。

根据本发明，提供了用于处理细胞的装置的插入件，其中所述插入件可通过装置中的开口插入到装置的内部空间中。在该装置的内部空间中，可以提供细胞材料，该细胞材料然后在移动穿过该装置的开口时与该插入件接触。

根据本发明，装置和插入件是分开的部件，它们在操作期间彼此组合。这允许例如在高压釜中对插入件进行简单可靠的清洁或灭菌。

与装置的内部空间相比，在插入件中提供的处理空间相对小，使得在细胞处理操作期间在处理空间中建立均匀条件。

在操作结束后，经处理的细胞可以通过装置的取样口(例如入口)从装置中取出，或者在下述实施方案中通过将细胞保持在插入件中的处理空间中并将插入件从装置移除而取出。以这种方式，可以容易地分析经处理的材料。

插入件可以具有适合于本发明的目的的任何形状，例如圆柱形形状或立方体形状。圆柱形形状是优选的。

插入件可由适于本发明目的的任何材料制成，例如由金属材料或塑料材料制成。

根据本发明的优选实施方案，插入件是静态插入件。这意味着一旦插入件被定位在下面描述的本发明的装置中，插入件就不移动。

本发明的插入件设置有处理空间。根据本发明，所述处理空间是待处理材料可以进入其中并且所述材料可以用电脉冲处理的区域。

根据本发明的一个实施方案，所述处理空间是设置在插入件的一个端部处的在电极之间的开放区域。换句话说，电极和优选地两个电极优选地彼此平行地从插入件的端部突出，从而在这些电极之间形成区域。所述区域是开放的，并且仅由电极和电极从其突出的插入件的端部限定。因此，在该实施方案中，处理空间可被待处理材料完全接近。优选地，处理空间被限制在电极之间的区域，并且电极本身被隔离(例如，用非导电材料)。

根据本发明的另一个实施方案，所述处理空间是在插入件的一个端部处的腔室，优选为圆柱形腔室。插入件具有开口，待处理材料可通过该开口进入设置在所述插入件内的所述处理空间中。优选地，允许进入所述腔室的开口设置在插入件的端面(顶面或底面)中。最优选地，所述插入件的整个端面是开放的，允许良好地接近构成处理空间的腔室。

在根据本发明的该实施方案中，插入件中通向(在插入件的一个端部处的腔室中)处理空间的开口可通过常用装置(例如，门或挡板或盖)封闭。

根据本发明的插入件还包括两个或更多个、优选两个用于将电脉冲发射到处理空间中的电极。或者，例如电容器的两块板可以用于该目的。电极和处理空间布置成使得所述处理空间可被由所述电极发射的电脉冲和由此产生的电场穿透。

根据本发明的优选实施方案，所述处理空间布置在所述电极或板之间，使得所述处理空间可以被所发射的电脉冲和由此产生的电场穿透。根据该实施方案，例如电容器的所述电极或板彼此平行布置，彼此相对，具有适于产生足够电场的距离。这种布置是众所周知的，不需要在这里进行详细解释。

根据优选实施方案，如上所述，所述处理空间是在插入件的一个端部处的腔室，并且例如电容器的电极或板在所述处理空间的底表面和顶表面处彼此平行地布置。

根据本发明的另一优选实施方案，所述处理空间是在电极之间的开放区域，所述电极优选地彼此平行地从插入件的端部突出，从而在这些电极之间形成区域。

例如电容器的所述电极或板与用于产生电脉冲的单元电连接。为此，根据本发明的插入件包括电连接件，来自所述用于产生电脉冲的单元的电线可连接到该电连接件。这种电连接件是已知的，在此不必详细讨论。

优选地，在所述插入件的一个端部处提供电连接件，并且在所述插入件的另一个端部处提供所述处理空间。

根据本发明的另一优选实施方案，所述插入件是传感器。根据该实施方案，插入件的未被处理空间占据的部分包括相应的已知传感器的必要部件。典型的传感器是pH传感器、电导率传感器、温度传感器或离子传感器。根据本发明，可以使用任何传统的传感器类型。

如上所述，本发明的插入件可容易地附接到用于处理细胞的装置上或从用于处理细胞的装置上移除。在这样的装置中，通常培养和/或增殖细胞。在具有上述插入件的装置中，使用电脉冲在所提供的处理空间中处理细胞。

因此，本发明还涉及一种装置，该装置包括入口和内部空间，并且还包括开口和用于产生电脉冲的单元，其特征在于，该装置还包括根据本发明的插入件，该插入件可插入所述开口中。

根据本发明，该装置可以是具有可储存流体的内部空间的任何单元。利用本发明的装置，通常处理悬浮液形式的生物材料。因此，该装置可以是用于吸收和储存这种悬浮液的单元。例如，所述装置可以是具有适于插入(和排出)悬浮液的至少一个入口的圆柱形罐。

优选地，所述装置可以是生物反应器。生物反应器通常是本领域已知的。生物反应器是支持生物活性环境的装置或系统。优选地，生物反应器是可以在其中进行(生物)化学过程的容器，该(生物)化学过程涉及生物体或来源于这样的生物体的生物化学活性物质。该过程可以是需氧的或厌氧的，例如发酵。常规生物反应器的尺寸从升到立方米不等，并且通常由不锈钢制成。

根据本发明的优选实施方案，所述装置可以包括布置在所述装置处的一个或多个管线。根据本发明，可以使用通常用于输送流体的任何管线。优选地，管线是例如由不锈钢制成的管道、管子或软管。

根据本发明，所述装置具有用于允许流体插入所述装置的入口。根据优选实施方案，装置的顶面被设计成可打开或关闭的盖或阀，从而允许将流体插入装置或从装置排出流体。在该实施方案中，引入到装置中的材料通过搅拌器或混合器或通过外部致动装置(诸如在已知的波混合生物反应器中)在装置内循环。

根据本发明的另一个实施方案，所述装置可以包括在所述装置的顶面中的入口以及出口，所述入口可以连接到用于将流体传送到所述装置的一个管线，所述出口形成在所述装置的底面中并且可以连接到用于将流体传送离开所述装置的另一个管线。尽管原则上可以在所述装置的侧壁中设置所述用于吸收流体的装置的入口和/或出口，但优选在所述单元的顶面和底面中提供所述入口和所述出口以建立闭合回路，待处理的生物材料可在该闭合回路中循环。

优选地，在所述入口和/或所述出口处可以设置用于调节流量的单元。作为示例，可以提及常规使用的阀门或锁。

所述装置包括开口，根据本发明的插入件可插入到该开口中，使得插入件与装置的内部空间和存在于所述内部空间中的任何流体接触。所述开口具有与本发明的插入件的形状相对应的形状。可以提供已知的标准固定元件，诸如夹子或螺纹，用于防止插入件与装置的不期望的分离。当插入件没有定位在开口中时，开口应该被密封以防止流体从内部空间通过开口的任何泄漏。

根据本发明的装置包括用于产生电脉冲的单元。这种单元通常是已知的。例如，可以是电缆脉冲发生器、基于半导体的脉冲发生器或张弛振荡器。

所生成的电脉冲被发射到处理空间中。这优选地通过例如如上所述的电容器的两个或更多个电极或板来完成，所述电极或板与用于产生电脉冲的所述单元电连接。

待施加到处理空间的电场必须表征为使得其提供所需的效果，例如刺激被处理的细胞的生长。现有技术中已知相应的电场，例如EP-2 308 969B1中所述的电场。根据本发明，可以使用由这种电脉冲产生的电场，使得在0.1ns至1000ns的时段内，在装置的电容器的两个电极或板之间发生的电压增加为电脉冲的目标电压的10％至90％，电脉冲具有5ns至50000ns的脉冲持续时间，并且在达到该目标电压时，电脉冲具有0.5kV/cm至100kV/cm的电场强度。

根据本发明，所述装置适用于医疗、环境、食品应用和基于生物的工业(包括酵母、乳杆菌、藻类和细胞组织生成系统，特别包括靶向灭活、生物活性化合物的提取和细胞生长和/或细胞化合物的刺激)。这些应用的描述参见Buchmann L和Mathys A(2019)的Perspective on Pulsed Electric Field Treatment in the Bio-based Industry，《生物工程与生物技术前言》7:265，doi:10.3389/fbioe.2019.00265。

根据本发明，将电脉冲施加到位于根据本发明的插入件的处理空间中的细胞材料。由此，对细胞材料施加电脉冲而进行处理。

根据本发明，基本上任何由至少一种细胞，即真核细胞和原核细胞组成的材料都可用作待处理的细胞材料。细胞材料可以是单细胞或多细胞生物体。例如，可以是细菌、酵母、微藻、植物细胞和真菌细胞或它们的孢子、菌丝体、种子或幼苗以及动物体细胞或者生殖细胞和哺乳动物细胞。此外，可处理多细胞组织，诸如植物中的分生组织和人或动物中的上皮或结缔组织。

在根据本发明进行处理之前，通常(但不是必须)以已知方式对细胞材料进行分离和/或纯化。优选地，在根据本发明的处理之前，细胞材料已经能够以已知的方式在合适的和已知的培养基中增殖至所需的程度。

在根据本发明的处理之前，优选地将细胞材料悬浮在导电液体中。导电液体是众所周知的。根据本发明，必须使用不会对细胞存活力产生不利影响的(即特别是无毒的)导电液体。根据本发明，优选地使用水作为导电液体，其中，可以通过合适的和已知的添加剂将水调节至所需的pH值。根据本发明，优选pH值为6.0至14.0，优选7至12。根据本发明的另一个优选实施方案，可以添加大量和微量营养素以及微量元素来支持细胞的培养和/或增殖。此类大量和微量营养素以及微量元素是已知的并且可以由本领域技术人员根据细胞的种类进行选择。

根据本发明，上述悬浮液能够以常规方式制备并储存直至处理。然而，也可以在提供悬浮液后立即进行根据本发明的处理。

细胞材料或含有细胞材料的悬浮液通过所述处理空间的开口，该开口位于根据本发明的插入件内部。这可以通过存在于本发明的所述装置的内部空间中的流体通过所述开口的被动扩散来实现，或者优选地借助于将流体均匀地分布在本发明的装置的内部空间中的混合单元来实现。

根据本发明，可以考虑在本发明领域中常规使用的任何混合单元。

尽管混合单元可主要手动操作，但优选混合单元由马达操作。根据本发明，可以考虑在本发明的领域中常规使用的任何马达。

根据本发明的优选实施方案，本发明的装置可包括一个或多个附加传感器。典型的传感器是pH传感器、电导率传感器、温度传感器、介电常数传感器或离子传感器。根据本发明，可以使用任何传统的传感器类型。

如上所述，设置在根据本发明的插入件中的处理空间与装置的内部空间相比相对较小，使得在细胞处理操作期间在处理空间中建立均匀条件。根据本发明的优选实施方案，设置在所述插入件中的处理空间的体积在所述装置的内部空间的体积的0.1％至10％、优选地1％至5％的范围内。

本发明还涉及在本发明的装置中进行的用于处理细胞以刺激细胞生长的方法，其包括以下步骤：

a)通过该装置的入口将细胞材料引入该装置的内部空间，

b)使细胞材料通入处理空间并使其经受穿透处理空间的电脉冲。

该方法可以按照如上所述进行。

如上所述，优选以在导电液体中的悬浮液的形式提供细胞材料。

如上所述，进一步优选的是，用这样的电场强度脉冲施加电场，使得在0.1ns至1000ns的时段内，在两个电极(6a,6b)或板之间发生的电压增加为电场强度脉冲的目标电压的10％至90％，电场强度脉冲具有5ns至50000ns的脉冲持续时间，并且在达到目标电压时，电场强度脉冲具有0.5kV/cm至100kV/cm的电场强度。

本发明的处理过程可以连续进行或分批进行。在后一种情况下，本发明的装置和插入件可以在另一个处理周期开始之前清空。

可选地，灭菌/消毒步骤可以在另一处理周期开始之前进行。根据本发明可以使用已知的灭菌/消毒过程，诸如基于蒸汽的过程。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明的插入件被在线灭菌(高压灭菌)，即在其已经被定位在本发明的装置的开口中之后。为了防止任何污染，插入件不应在所述插入件的所述灭菌步骤之后更换。

在插入件已经定位和固定在装置的开口中并且可选地已经在线灭菌之后，装置的内部空间填充有待处理的材料，如上所述。装置的内部空间中的细胞材料可通过混合单元分布，如上所述。所述细胞材料的一部分进入插入件中的处理空间并在其中进行处理，如上所述。

在处理/培养/生产已经终止之后，将细胞材料从装置中排出，并且移除插入件或在线灭菌/消毒。

本发明还涉及本文所述的根据本发明的装置或设备用于医疗、环境、食品应用和基于生物的工业(包括酵母、细菌、微藻以及植物或动物细胞和细胞组织生成系统，特别是靶向灭活、生物活性化合物的提取和/或细胞生长和/或细胞化合物的刺激)的用途。这些应用的描述参见Buchmann L和Mathys A(2019)的Perspective on Pulsed Electric FieldTreatment in the Bio-based Industry，《生物工程与生物技术前言》7:265，doi:10.3389/fbioe.2019.00265。

特别地，本发明的插入件和装置可用于分析目的，其中仅少量细胞材料将被处理。

下面通过非限制性示例和附图解释本发明。

附图说明

图1示出了本发明的装置的一个实施方案的示意图。

图2示出了本发明的插入件的第一实施方案的示意图。

图3示出了本发明的插入件的第二实施方案的示意图。

具体实施方式

在附图中，相同的附图标记表示相同的部件。

在图1中，示出了本发明的装置1的实施方案的示意图。所述装置1包括用于产生电脉冲的单元2，所述电脉冲借助于电极2a、2b(见图2)被发射到设置在插入件4的一个端部处的处理空间3中。所述插入件定位在装置1的开口5中并且因此与装置的内部空间7接触。

入口6(此处为可打开或关闭的盖的形式)提供通向装置的内部空间7的入口。在所述内部空间中，例如可以提供细胞材料悬浮液8。

图1的装置还包括用于分布细胞材料悬浮液8的混合单元9。混合单元9用马达10(例如电动马达)操作。

图1的装置还包括传感器11，例如温度传感器。

在图2中，示出了本发明的插入件4的第一实施方案的示意图。

图2的插入件4具有圆柱形形状并且在其一个端面处包括用于将插入件与用于产生电脉冲的单元2电连接的电连接件4a。在所述插入件4中，设置有电线(未示出)，其将电脉冲从电连接件4a引导至电极2a、2b。

图2的插入件包括在插入件4的远离电连接件4a的端部处的腔室形式的处理空间3。所述处理空间设置在将插入件4的剩余部分与处理空间3分开的壁(用虚线表示)与插入件4的另一端面4b之间。在图2的实施方案中，所述端面4b构成允许进入处理空间3的开口。

在所述处理空间内，在图2的实施方案中，在其底面和顶面处设置有电极2a、2b。电极2a、2b平行布置，并且处理空间3设置在所述电极2a、2b之间，使得其可以被从所述电极发射的电脉冲和由此产生的电场穿透。

在图3中，示出了本发明的插入件4的第二实施方案的示意图。

图2的插入件4具有圆柱形形状并且在其一个端面处包括用于将插入件与用于产生电脉冲的单元2电连接的电连接件4a。在所述插入件4中，设置有电线(未示出)，其将电脉冲从电连接件4a引导至电极2a、2b。

图2的插入件包括设置为电极2a、2b之间的开放区域的处理空间3，电极2a、2b从插入件4的远离电连接件4a的端部突出。电极2a、2b平行布置，并且处理空间3设置在所述电极2a、2b之间，使得其可以被从所述电极发射的电脉冲和由此产生的电场穿透。