对冠状病毒蛋白具有特异性的有蹄类动物源性多克隆免疫球蛋白和其用途

相关申请交叉引用

本申请要求于2021年4月28日提交的美国申请第63/180,935号、于2021年2月2日提交的美国申请第63/144,784号、于2020年9月9日提交的美国申请第63/076,121号和于2020年8月31日提交的美国申请第63/072,683号的优先权，所述美国申请中的每一个通过引用以其整体并入本文。

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技术领域

本发明涉及用于治疗冠状病毒的多克隆免疫球蛋白产物。

背景技术

如康复血浆等免疫球蛋白产物以及从血浆中纯化的人源性和动物源性免疫球蛋白可以用于治疗各种传染病。目前正在评估用康复血浆对COVID-19进行的治疗，并且所述治疗显示出前景。这种医疗干预的广泛使用将需要充足供应来自受感染的患者的血浆；人源性产物的使用产生了疾病的供体-受试者传输的风险。已知动物源性免疫球蛋白引起严重的过敏反应和血清疾病，并且可能由于包括人免疫球蛋白和动物免疫球蛋白的抗体的结构差异而不太有效。

因此，需要用于在患有冠状病毒病或有患冠状病毒病的风险的患者体内治疗性使用的免疫球蛋白产物。

发明内容

诸位发明人已开发了一种在有蹄类动物(例如，牛)体内制备的用于治疗冠状病毒病(例如，COVID-19)的多克隆人免疫球蛋白产物，所述有蹄类动物被基因工程化为产生具有人多肽序列的多克隆人免疫球蛋白。除了证明了转染色体牛(TcB)系统产生具有人多肽序列的免疫球蛋白之外，诸位发明人已确定根据本文所述的方法的实施例产生的多克隆人免疫球蛋白可以具期望的糖基化谱和/或效应功能，在一些情况下优于类似的人源性产物。

一方面，本文提供了一种有蹄类动物源性多克隆人免疫球蛋白组合物，其包括人免疫球蛋白群体，其中所述人免疫球蛋白群体与冠状病毒蛋白特异性结合，所述冠状病毒蛋白选自冠状病毒S蛋白、冠状病毒M蛋白、冠状病毒E蛋白或冠状病毒核衣壳蛋白或其组合。

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体与冠状病毒S蛋白特异性结合。在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体包括与所述人免疫球蛋白共价连接的聚糖。

在一些实施例中，所述聚糖包括至少约70％、至少约80％或至少约90％的携带N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的聚糖。

在一些实施例中，所述组合物中总免疫球蛋白的0.5％至20％与所述冠状病毒蛋白结合。

另一方面，本文提供了一种多克隆人免疫球蛋白组合物，其是通过用冠状病毒蛋白或其抗原片段对转基因有蹄类动物进行免疫产生的，其中所述组合物包括人免疫球蛋白群体。

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体与冠状病毒蛋白特异性结合，所述冠状病毒蛋白选自冠状病毒S蛋白、冠状病毒M蛋白、冠状病毒E蛋白或冠状病毒核衣壳蛋白或其抗原片段。在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体与冠状病毒S蛋白特异性结合。

在一些实施例中，所述聚糖包括至少约70％、至少约80％或至少约90％的携带N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的聚糖。

在一些实施例中，所述有蹄类动物为牛。

另一方面，本文提供了一种多克隆人免疫球蛋白组合物，其包括人免疫球蛋白群体，其中所述人免疫球蛋白群体与冠状病毒蛋白特异性结合，所述冠状病毒蛋白任选地选自冠状病毒S蛋白、冠状病毒M蛋白、冠状病毒E蛋白或冠状病毒核衣壳蛋白。其中所述人免疫球蛋白群体包括与所述人免疫球蛋白共价连接的聚糖，并且其中所述聚糖包括至少约70％、至少约80％或至少约90％的携带N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的聚糖。

在一些实施例中，所述聚糖包括至少约70％的岩藻糖基化聚糖。

在一些实施例中，所述聚糖包括至少约80％的岩藻糖基化聚糖。

在一些实施例中，所述聚糖包括至少约90％的岩藻糖基化聚糖。

在一些实施例中，所述聚糖包括至少约94％的岩藻糖基化聚糖。

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体以15nM或更大的K

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体以500nM或更大的K

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体以1μM或更大的K

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体以1μM或更大的K

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体以1nM或更大的K

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体以与参考产物至多大约相同的亲和力与一种或多种人Fcγ受体结合。

在一些实施例中，在CDC测定中，所述组合物的效力至多大约与参考产物的效力相同。

在一些实施例中，在ADCC测定中，所述组合物的效力至多大约与参考产物的效力相同。

在一些实施例中，所述参考产物为人源性多克隆免疫球蛋白产物。

另一方面，本文提供了一种制备用于治疗冠状病毒病的多克隆人免疫球蛋白的方法，所述方法包括向转基因有蹄类动物施用包括冠状病毒蛋白或其抗原片段的抗原或编码所述抗原的多核苷酸，所述冠状病毒蛋白选自冠状病毒S蛋白、冠状病毒M蛋白、冠状病毒E蛋白或冠状病毒核衣壳蛋白，其中所述转基因有蹄类动物包括包含人免疫球蛋白基因座的基因组或包含人免疫球蛋白基因座的人工染色体，其中所述转基因有蹄类动物产生与所述冠状病毒S蛋白特异性结合的人免疫球蛋白群体。

在一些实施例中，施用所述抗原或所述编码所述抗原的多核苷酸3次、4次、5次或更多次。

在一些实施例中，所述方法包含从所述转基因有蹄类动物采集血清或血浆。

在一些实施例中，所述血清或所述血浆包括完全人免疫球蛋白群体。

在一些实施例中，冠状病毒为SARS-CoV2。

在一些实施例中，所述抗原包括所述冠状病毒S蛋白的重组胞外结构域。

在一些实施例中，所述重组胞外结构域包括S1/S2切割位点(残基682至685)中的碱性氨基酸对非碱性残基的一个或多个氨基酸取代。

在一些实施例中，所述重组胞外结构域包括一个或多个使所述重组胞外结构域稳定的氨基酸取代。

在一些实施例中，所述一个或多个使所述重组胞外结构域稳定的氨基酸取代包括K986P和/或V986P。

在一些实施例中，所述方法包括施用疫苗初免剂，所述疫苗初免剂包括编码所述冠状病毒S蛋白的多核苷酸。

在一些实施例中，所述编码所述冠状病毒S蛋白的多核苷酸为质粒DNA分子(pDNA)。

在一些实施例中，所述方法包括在疫苗初免剂施用的位点处共同施用包括Montanide ISA-206和/或Quil A的佐剂。

在一些实施例中，所述抗原以包括Montanide ISA-206和/或Quil A的药物组合物的形式施用。

在一些实施例中，所述方法包括a)施用第一疫苗初免剂，所述第一疫苗初免剂包括所述编码所述冠状病毒S蛋白的多核苷酸；b)三周至四周后施用第二疫苗初免剂，所述第二疫苗初免剂包括编码所述冠状病毒S蛋白的多核苷酸；c)四周后施用第一抗原，所述第一抗原包括所述冠状病毒S蛋白的所述重组胞外结构域；d)四周后施用第二抗原，所述第二抗原包括所述冠状病毒S蛋白的所述重组胞外结构域；以及e)四周后施用第三抗原，所述第三抗原包括所述冠状病毒S蛋白的所述重组胞外结构域。

在一些实施例中，所述方法包括对所述人免疫球蛋白进行纯化以产生根据本公开的有蹄类动物源性多克隆免疫球蛋白组合物。

另一方面，本文提供了一种药物组合物，其包括如本文所公开的组合物以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。

另一方面，本文提供了一种治疗或预防患有冠状病毒病(COVID)或有风险患上COVID的受试者的COVID的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的组合物或如本文所公开的所述药物组合物。

本发明的另外的实施例、特征和优点将从以下具体实施方式并通过本发明的实践显而易见。

附图说明

图1A-1H示出了isHAC和isKcHACΔ载体的构建。

图1A示出了isHAC和isKcHACΔ载体构建的流。牛化载体pCC1BAC-isHAC为基于BAC的载体(骨干为pCC1BAC载体)，其由分别作为长组和短组的10.5kb和2kb基因组DNA、覆盖牛I

图1B示出了关于靶向载体pCC1BAC-isHAC的详细信息。通过使用人I

图1C示出了牛化的I

图1D示出了在FLP-FRT缺失后neo盒的基因分型。

图1E示出了用于isHAC载体的基因分型的广泛基因组PCR。每个基因组PCR引物对的位置关于isHAC载体结构进行描绘。

图1F示出了含有isHAC载体的三种不同CHO克隆之中的CGH分析。将来自isC1-133的DNA用作参考。三种细胞系之中的isHAC不存在明显结构差异。

图1G示出了用于isKcHACΔ载体的基因分型的广泛基因组PCR。每个基因组PCR引物对的位置关于isKcHACΔ载体结构进行描绘。

图1H示出了含有isKcHACΔ载体的三种不同CHO克隆之中的CGH分析。将来自isKCDC15-8的DNA用作参考。三种细胞系之中的isKcHACΔ不存在明显结构差异。

图2A示出了相比于由人血浆

图2B示出了相比于由人血浆

图3示出了TcB源性产物的尺寸排除色谱图。

图4示出了将TcB源性产物与人源性多克隆免疫球蛋白产物进行比较的补体测定。

图5A示出了相比于人源性产物TcB源性产物中的CD16A介导的信号传导的条形图。

图5B示出了相比于人源性产物TcB源性产物中的CD32A介导的信号传导的条形图。

图6A示出了TcB源性产物或人源性产物与FcγRI(CD64)的浓度依赖性结合的图。

图6B示出了TcB源性产物或人源性产物与FcγRIIa(CD32)的浓度依赖性结合的图。

图6C示出了TcB源性产物或人源性产物与FcγRIIIa(CD16)的浓度依赖性结合的图。EMABLig为低糖单克隆抗体，并且TG-REVO为乙二醇修饰的单克隆抗体，这两种抗体都被工程化为相比于人免疫球蛋白与FcyRIIIa的结合增加。

图6D示出了TcB源性产物或人源性产物与FcγRn的浓度依赖性结合的图。

图7A示出了IL-2产生测定的图像表示。

图7B示出了通过TcB源性免疫球蛋白(“SAB-301”)或人源性的免疫球蛋白(“IVIG”)对IL-2产生的浓度依赖性抑制的图。

图8A-8C：通过多克隆抗体中和VSV-SARS-CoV-2突变体。测试了(图8A)三个批次的SAB-185pAb和阴性对照对野生型和(图8B)突变体VSV-SARS-CoV-2(n＝4)的中和。误差条表示SEM。数据表示四次独立实验。图8C是相同数据的热图。

图9A-9B：选择SAB-185pAb逃逸。图9A，使用1的MOI对SAB-185pAb的针对VSV-SARS-CoV-2的中和活性进行了测试。对SAB-185pAb从用刺突蛋白抗原进行免疫的转染色体(Tc)牛进行了纯化并且通过针对SARS-CoV-2的蚀斑减少中和测试(PRNT)滴度进行验证。数据描绘于图9A：误差条表示SEM。数据表示四次独立实验。图9B，进行了蚀斑测定以在覆盖物中存在所指示pAb的情况下在Vero E6 TMPRSS2细胞上分离VSV-SARS-CoV-2-S逃逸突变体。覆盖物中添加的SAB-185pAb的浓度完全抑制病毒感染(参见图9A-9B)。在对照mAb实验(由箭头示出)中发现逃逸突变体，而在SAB-185pAb中不存在逃逸突变体(图9B)。这表示作为pAb的SAB-185优于针对逃逸突变体的mAb。示出了八次独立实验的代表性图像。

图10示出了对于来自SAB-185对mAb的VSV-SARS-CoV-2E484K逃逸突变的选择。在对4个6孔板进行测试的情况下：从mAb中发现逃逸突变体。从SAB-185批次1中未发现逃逸克隆，这证实了作为pAb的SAB-185优于针对逃逸突变体的mAb。

图11A-11B示出了来自在鼻内SARS-CoV-2激发之前12小时施用高(3.75mg)和低(1.75mg)剂量的SAB-185的小鼠的液滴数字RT-PCR(ddRT-PCR)结果。黑色三角形表示低剂量处理的动物，红色正方形表示高剂量处理的动物，并且蓝色圆圈表示盐水处理的对照小鼠。X轴表示安乐死和尸检日，并且Y轴表示RNA拷贝数。线表示所述组中的三只动物的几何平均RNA拷贝数。(A)按组和安乐死日呈现的数据。(B)按组呈现的数据；****＝P<0.0001。

图12A-12B显示了来自在鼻内SARS-CoV-2激发后6小时(红色正方形)或24小时(黑色三角形)施用高剂量的SAB-185的小鼠的液滴数字RT-PCR结果。X轴表示安乐死和尸检日，并且Y轴表示RNA拷贝数。线表示所述组中的三只动物的几何平均RNA拷贝数。(A)按组和安乐死日呈现的数据。(B)按组呈现的数据；****＝P<0.0001。

图13A-13F示出了来自未经处理的K18转基因小鼠或给予SAB-185的小鼠的肺组织的H&E(A、C、E)和免疫组织化学(B、D、F)染色的实例。A和B是来自在SARS-CoV-2鼻内激发之前12小时给予SAB-185的动物的正常肺组织的实例。C和D来自在激发后第6天实施安乐死的动物，其示出肺中的轻度1+至2+组织病理学变化和免疫组织化学反应性。E和F是来自未经治疗的对照动物的肺组织的实例，其示出了与中度至重度肺炎一致的组织病理学变化和免疫组织化学染色。黑色箭头表示阳性免疫组织化学染色(图13D和图13F)；并且红色箭头表示血管周浸润(图13E)。

图14A-14B示出了总抗SARS-CoV-2IgG抗体。(A)总抗体表示为在用SARS-CoV-2激发之前12小时用高剂量和低剂量的SAB-185处理的动物中任意单位(AU)/ml。(B)总抗体表示为在用SARS-CoV-2鼻内激发之后六小时或24小时用SAB-185处理的动物中AU/ml。

图15示出了在用致死剂量的SARS-CoV-2进行鼻内激发之前12小时或之后6小时施用SAB-185的动物的Kaplan Meier图。(A)死亡率端值。(B)至疾病的时间端值。

具体实施方式

诸位发明人已开发了一种用于冠状病毒病的人免疫球蛋白产物，所述人免疫球蛋白产物克服了人和动物源性免疫球蛋白产物的限制。具有被编码人Ig基因座的人人工染色体替代的内源性Ig基因座的转基因动物表达完全人多克隆抗体。用重组冠状病毒刺突(S)蛋白或其抗原片段和/或用编码抗原的多核苷酸对此转基因动物进行免疫生成了具有使得此产物能够用于医疗应用的产率、纯度和抗原特异性的多克隆免疫球蛋白。本发明的各个实施例在以下描述中提供。

定义

所引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。在本申请内，除非另有说明，否则所使用的技术可以在如下若干个众所周知的参考文献中的任何参考文献中找到：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(Sambrook等人,1989,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))、《基因表达技术(GeneExpression Technology)》(《酶学方法(Methods in Enzymology)》,第185卷,D.Goeddel编辑,1991.加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,San Diego,Calif.))、《酶学方法》中的“蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification)”(M.P.Deutshcer编辑,(1990)学术出版社公司)；《PCR协议：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications)》(Innis等人1990.加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社)、《动物细胞培养：基本技术指南(Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique)》,第2版(R.I.Freshney.1987.纽约州纽约的利斯有限公司(Liss,Inc.NewYork,N.Y.))、《基因转移和表达方案(Gene Transfer and Expression Protocols)》第109-128页,编辑：E.J.Murray,新泽西州克利夫顿的胡马纳出版社公司(The Humana PressInc.,Clifton,N.J.)以及Ambion 1998目录(德克萨斯州奥斯汀的Ambion公司(Ambion,Austin,Tex))。

如本文所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数个提及物。除非另有明确说明，否则本文中使用的“和”可与“或”互换使用。

除非上下文另外明确指出，否则可以组合使用本发明的任何方面的所有实施例。

除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”等应被理解为是包含性或开放性的，而不是排他性或穷尽性的；也就是说，其意义为“包含但不限于”。使用单数或复数的词语也分别包含复数和单数。另外，当在本申请中使用时，词语“本文中”、“以上”、“以下”和类似倒入的词语应指代本申请整体，而不是本申请的任何特定部分。

术语“有蹄类动物”是指任何合适的有蹄类动物，包含但不限于牛、猪、马、驴、斑马、鹿、公牛、山羊、绵羊和羚羊。

术语“转基因”意指有蹄类动物的细胞包括一种或多种编码外源基因(例如，免疫球蛋白基因座)的多核苷酸。如多核苷酸可以是人工染色体的一部分。可替代地，或除了人工染色体之外，一种或多种编码外源基因的聚多核苷酸可以整合到有蹄类动物的细胞的基因组中。

术语“多克隆”或“多克隆血清”或“多克隆血浆”或“多克隆免疫球蛋白”是指具有共有恒定区但具有不同可变区的免疫球蛋白群体。然而，术语多克隆不包括衍生自单个B细胞前体或单个重组事件的免疫球蛋白，在显性免疫应答生成时的情况也是如此。多克隆血清或血浆含有可溶性形式(例如IgG)的免疫球蛋白群体。术语“经纯化的多克隆免疫球蛋白”是指通过血清或血浆纯化的多克隆免疫球蛋白。对多克隆免疫球蛋白进行纯化的方法包含但不限于用红细胞(RBC)进行的辛酸分馏和吸附。

与具有单个免疫球蛋白的多个拷贝的样品相反，免疫球蛋白“群体”是指具有不同序列的免疫球蛋白。类似规定的，术语群体不包括从培养中的单个B细胞、浆细胞或杂交瘤分泌的或来自用编码重链和轻链免疫球蛋白序列的单个对的重组多核苷酸转导或转化的宿主细胞的免疫球蛋白。

术语“免疫球蛋白”是指1:1比率的至少两条重链和至少两条轻链的蛋白质复合物，包含以下五种类别的免疫球蛋白中的任何免疫球蛋白，即IgM、IgG、IgA、IgD、IgE。在变异中，免疫球蛋白以本领域已知的或前瞻性发现的各种方式中的任何方式被工程化，所述方式包含但不限于用于改变糖基化模式和/或增加或减少补体依赖性细胞毒性的突变。

当免疫球蛋白的蛋白质序列与天然人免疫球蛋白的序列足够相似时，免疫球蛋白是“完全人的或基本上人的”，在施用于受试者时，免疫球蛋白生成与对天然人免疫球蛋白的免疫反应相似或不明显更差的抗免疫球蛋白免疫应答。完全人免疫球蛋白将包括对可变区中的缺失进行的与免疫球蛋白序列的重组、选择和亲和力成熟一致的一个或多个取代、插入。在变异中，完全人或基本上人免疫球蛋白以本领域已知的或前瞻性发现的各种方式中的任何方式被工程化，所述方式包含但不限于用于改变糖基化模式和/或增加或减少补体依赖性细胞毒性的突变。

术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果其天然存在的话，则为自然环境)中去除。例如，存在于活动物中的天然存在的核酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的共存材料中的一些或全部共存材料分开的相同核酸或多肽是分离的。此类核酸可以是载体的一部分和/或此类核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞裂解物)的一部分，并且仍然可以是分离的，因为此类载体或组合物不是所述核酸或多肽的天然环境的一部分。本公开的组合物中的任何组合物可以是分离的组合物。

“按总免疫球蛋白的质量计”免疫球蛋白(例如，与人冠状病毒特异性结合的免疫球蛋白)的百分比是指目标免疫球蛋白群体的浓度除以样品中总免疫球蛋白的浓度乘以100。目标免疫球蛋白的浓度可以通过例如目标免疫球蛋白的亲和力纯化(例如，在包括冠状病毒或胸腺细胞膜的亲和柱上)以及之后的浓度确定来确定。

术语“约”或“大约”意指在本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于值是如何测量或确定的，例如，测量系统的局限性。例如，“约”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指至多20％、至多10％或至多5％的正或负范围。

术语“免疫(immunization)”和“免疫(immunizing)”是指以足以在一个或多个施用步骤之后引发期望的免疫应答(例如，对冠状病毒具有特异性的多克隆免疫球蛋白应答)的量向受试者(例如，转基因有蹄类动物)施用组合物。施用可以通过肌内注射、静脉内注射、腹膜内注射或任何其它合适的途径进行。免疫可以包括一次至十次或更多次施用(例如注射)组合物，如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次施用。首次施用可能不会引发可检测的免疫应答，因为通常每个子序列施用将增强通过先前施用生成的免疫应答。

术语“靶抗原”是指用于引发期望的免疫应答的任何抗原用途。用于生成用于冠状病毒病的免疫球蛋白产物的靶抗原可以是重组刺突(S)蛋白或其抗原片段，或编码此类蛋白质(例如RNA、线性DNA或质粒DNA)的核酸。

术语“纯化”是指将靶细胞或分子(例如免疫球蛋白群体)与存在于组合物中的其它物质分开。免疫球蛋白可以通过血浆的分馏、通过亲和力(例如蛋白质A或蛋白质G结合或其它捕获分子)、通过电荷(例如离子交换色谱法)、通过尺寸(例如尺寸排除色谱法)或以其它方式进行纯化。对免疫球蛋白群体进行纯化可以包括用酸、碱、盐、酶、热、冷、凝血因子或其它合适的试剂中的一种或多种处理包括免疫球蛋白群体的组合物。纯化可以进一步包含将包括靶细胞或分子和杂质的组合物吸附到非靶细胞或分子(例如，红细胞)上以部分或完全去除杂质。纯化可以进一步包含对血清或血浆进行预处理，例如，辛酸分馏。

术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指缓解、减轻、延迟、减少、逆转、改善或管理受试者的病状的至少一种症状中的一种或多种。术语“治疗”还可以意指阻止、延迟发作(即，病状临床表现之前的时间段)或降低患上病状或使病状恶化的风险中的一种或多种。

术语“药学上可接受的”是指对于在动物或人体内使用是生物学或药理学上可相容的，并且可以意指被联邦或州政府的管理机构批准或者在美国药典或其它普遍认可的药典中列出用于动物并且更特别地用于人类。

术语“高免疫”是指在由受试者产生的免疫球蛋白稀释之后，对受试者生成大于产生期望滴度(例如结合滴度)所需的免疫应答的免疫方案。例如，如果期望的滴度为1:100，则可以通过初免剂免疫以及之后的一次、两次、三次或更多次增强剂接种来对动物进行高免疫，以在受试者体内产生1:1,000滴度或更大的滴度，使得通过受试者产生的免疫球蛋白可以在生物治疗剂的产生中进行稀释，以便提供生物治疗剂的期望的滴度。

免疫球蛋白对于靶标(例如，冠状病毒或胸腺细胞抗原)“具有特异性”或与靶标“特异性结合”是本领域众所周知的术语，并且用于确定此类特异性或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定细胞或物质比其与替代性细胞或物质更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应或缔合，则所述分子被称为表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果免疫球蛋白与特定蛋白质或物质以比其与替代性特定蛋白质或物质结合更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述免疫球蛋白与所述特定蛋白质或物质“特异性结合”。例如，与冠状病毒S蛋白特异性或优先结合的免疫球蛋白是与冠状病毒S蛋白以比其与其它蛋白结合更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或持续时间更长地结合的免疫球蛋白。与第一蛋白质或物质特异性结合的免疫球蛋白可以与或可以不与蛋白质细胞或物质特异性或优先结合。如此，“特异性结合”不一定需要(但是其可以包含)排他性结合。通常，但不是必然地，提及结合是指特异性结合。

术语“HAC载体”意指包括至少一个人染色体源性着丝粒序列、端粒序列和复制起点的载体，并且可以含有给定应用期望的任何其它序列。当存在于宿主细胞中时，HAC载体独立于细胞核中的宿主细胞染色体存在。可以使用任何合适的方法以制备HAC载体并将所关注的核酸插入到HAC中，包含但不限于以下实施例中所述的那些。HAC载体为双链DNA载体，如本领域的技术人员已知的。

实施例

提供了制备用于治疗冠状病毒病的人多克隆免疫球蛋白的方法，所述方法包括向转基因有蹄类动物施用包括冠状病毒S蛋白或其抗原片段的抗原或编码所述抗原的多核苷酸，其中所述转基因有蹄类动物包括包含人免疫球蛋白基因座的基因组或包含人免疫球蛋白基因座的人工染色体，其中所述转基因有蹄类动物产生与所述冠状病毒S蛋白特异性结合的人免疫球蛋白群体。

在一种变化中，使用非人冠状病毒S蛋白或编码其的多核苷酸(例如，家养动物，如犬、猫、绵羊等的冠状病毒)。转基因有蹄类动物在此类情况下可以包括编码非人物种的Ig基因座的人工染色体，使得生成了所述物种的抗体。

在一些实施例中，在施用一种或多种佐剂之前、期间或之后施用冠状病毒S蛋白或编码其的多核苷酸(即，“抗原”)。在一些实施例中，抗原和一种或多种佐剂一起以单一组合物的形式施用，所述单一组合物任选地包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。

说明性佐剂包含铝盐佐剂、水包油乳剂(例如包括角烯的水包油乳剂，如MF59或AS03)、TLR7激动剂(如咪唑喹啉或咪喹莫特(imiquimod))或其组合。合适的铝盐包含氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟磷酸盐、正磷酸盐)(例如参见《疫苗设计(VaccineDesign.)》的第8章和第9章(1995)版.Powell和Newman.ISBN：030644867X：普莱南出版社(Plenum))和/或其混合物。另外的说明性佐剂包含但不限于：Adju-Phos、Adjumerlm、白蛋白肝素微粒、藻葡聚糖、Algammulin、明矾、抗原调配物、AS-2佐剂、自体树突状细胞、自体PBMC、Avridine

免疫可以通过将抗原与例如完整的弗氏佐剂或如氢氧化铝凝胶等适当的佐剂和百日咳细菌疫苗一起皮下、静脉内或腹膜内施用于转基因有蹄类动物体内来进行。在一个实施例中，免疫包括高免疫。在各个实施例中，在首次施用后每1周至4周施用抗原一次至10次。从每次施用起1天至14天后，从动物中采集血液以测量血清的抗体值。

在一些实施例中，抗原施用3次、4次、5次、6次或更多次。人冠状病毒的施用可以例如每1-2周、2-3周、3-4周、4-5周、5-6周或6-7周或更长的间隔进行，例如每1周、2周、3周、4周、5周或6周进行。在每次免疫后，可以从转基因有蹄类动物一次或多次收获血清和/或血浆。例如，所述方法可以包含以约7-14天的间隔进行两次或三次对照放血。

在一些实施例中，用于生成用于冠状病毒病的免疫球蛋白产物的抗原可以是通过从活病毒中分离或通过重组方法产生的冠状病毒的任何其它抗原部分或编码冠状病毒的此类抗原部分的核酸(例如RNA、线性DNA或质粒DNA)，而不是冠状病毒S蛋白。

在本公开的方法的实施例中，转基因有蹄类动物的基因组包括人免疫球蛋白基因座。说明性方法在美国专利第9,902,970号；美国专利第9,315,824号；美国专利第7,652,192号；以及美国专利第7,429,690号；以及美国专利第7,253,334号中提供，所述专利的公开内容出于所有目的通过引用并入本文。另外的说明性方法由Kuroiwa,Y.等人(2009)《自然生物技术(Nat Biotechnol)》27(2):173-81和Matsushita等人(2015)《科学图书馆：综合(PLoS ONE)》10(6):e0130699提供。

本公开提供了一种人人工染色体(HAC)载体，其包括编码以下基因：

(a)一条或多条人抗体重链，其中每个编码抗体重链的基因与类别开关调节元件操作性地连接；

(b)一条或多条人抗体轻链；以及

(c)一条或多条人抗体替代轻链和/或有蹄类动物源性IgM重链恒定区；

其中编码一条或多条人抗体重链的基因的至少一个类别开关调节元件被有蹄类动物源性类别开关调节元件替代。

本公开的HAC载体可以例如用于通过转基因动物大规模生产完全人抗体，如针对本发明的方法所述的。本公开的HAC载体包括一个或多个编码人抗体重链的基因。任何人抗体重链或组合的人抗体重链的组合可以由HAC上的一个或多个核酸编码。在各个实施例中，人抗体重链IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE和IgD中的1者、2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者或全部9者可以在HAC上以一个或多个拷贝编码。在一个实施例中，HAC包括单独的编码人IgM抗体重链的基因或与1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或其它8个编码人抗体链的基因的组合。在一个优选实施例中，HAC包括编码至少一条人IgG1抗体重链的基因；在此实施例中，进一步优选的是HAC包括编码人IgM抗体重链的基因或编码已被嵌合化以编码有蹄类动物源性IgM重链恒定区(如牛重链恒定区)的人IgM抗体重链的基因。在另一实施例中，HAC包括编码至少一条人IgA抗体重链的基因；在此实施例中，进一步优选的是HAC包括编码人IgM抗体重链的基因或编码已被嵌合化以编码有蹄类动物源性IgM重链恒定区(如牛重链恒定区)的人IgM抗体重链的基因。在另一优选实施例中，HAC包括编码所有9条抗体重链的基因，并且更优选地其中编码人IgM抗体重链的基因已被嵌合化以编码有蹄类动物源性IgM重链恒定区。在另一实施例中，HAC可以包括编码人抗体重链的人染色体14的一部分。人抗体重链的可变区基因和恒定区基因形成簇，并且人重链基因座定位在人染色体14上的14q32处。在一个实施例中，插入在HAC中的人染色体14的区包括来自人染色体14的14q32区的人抗体重链的可变区和恒定区。

在本公开的HAC载体的一些实施例中，编码人抗体重链的核酸的至少一个类别开关调节元件被有蹄类动物源性类别开关调节元件替代。类别开关调节元件是指为距抗体重链恒定区5'处的核酸。每个重链恒定区基因与其自身的开关区操作性地连接(即，处于其控制下)，所述开关区还与其自身的I外显子缔合。类别开关调节元件调节类别开关重组并且确定Ig重链同种型。每种重链同种型的种系转录是由位于距I外显子仅5'处的启动子/增强子元件驱动的，并且那些元件是细胞因子或其它激活子响应的。在类别开关的简单模型中，特异性激活子和/或细胞因子诱导从其类别开关调节元件(即，激活子/细胞因子响应启动子和/或增强子)进行的每个重链同种型种系转录。类别开关之前是从每个Ig重(IGH)基因座缔合的开关区对I外显子进行的转录。因为每个重链恒定区基因与其自身的开关区连接，

因此可以使用任何合适的有蹄类动物源性类别开关调节元件。例如，下面列出的人重链基因同种型具有以下类别开关调节元件：

IgM:Iμ-Sμ、

IgG1:Iγ1-Sγ1、

IgG2:Iγ2-Sγ2、

IgG3:Iγ3-Sγ3、

IgG4:Iγ4-Sγ4、

IgA1:Iα1-Sα1、

IgA2:Iα2-Sα2和

IgE:Iε-Sε。

在各个实施例中，HAC上的1个、多于1个或全部人抗体重链基因具有其被有蹄类动物源性类别开关调节元件替代的类别开关调节元件，所述有蹄类动物源性类别开关调节元件包含但不限于有蹄类动物Iμ-Sμ、Iγ-Sγ、Iα-Sα或Iε-Sε类别开关调节元件。在一个实施例中，用于HAC(如在SEQ ID NO:1中的)上编码人IgG1重链的核酸的Iγ1-Sγ1人类别开关调节元件被有蹄类动物Iγ1-Sγ1类别开关调节元件替代。示例性有蹄类动物Iγ1-Sγ1类别调节开关元件包含牛IgG1 Iγ1-Sγ1类别开关调节元件(SEQ ID NO:2)、马Iγ1-Sγ1类别开关调节元件(SEQ ID NO:3)和猪Iγ1-Sγ1类别开关调节元件(SEQ ID:4)。然而，不必用来自对应重链同种型的有蹄类动物类别开关调节元件替代人类别开关调节元件。因此，例如，用于HAC上的编码人IgG3重链的核酸的Iγ3-Sγ3人类别开关调节元件可以被有蹄类动物Iγ1-Sγ1类别开关调节元件替代。如本领域的技术人员将基于本文的教导显而易见的，任何此类组合都可以用于本公开的HAC中。

在另一实施例中，HAC包括至少一个用于替代与HAC上的一个或多个编码人抗体重链恒定区的核酸缔合的增强子元件的有蹄类动物增强子元件。存在与人抗体重链基因缔合的两个3'增强子区(α1和α2)。增强子元件距重链恒定区3'并且还有助于调节类别开关。可以使用任何合适的有蹄类动物增强子，包含但不限于3'Eα增强子。可使用的3'Eα增强子的非限制性实例包含3'Eα、3'Eα1和3'Eα2。来自牛的可以用于HAC并且替代人增强子的示例性3'Eα增强子元件包含但不限于牛HS3增强子(SEQ ID NO:5)、牛HS12增强子(SEQ ID NO:6)和牛增强子HS4。此实施例在其中HAC包括来自人染色体14的14q32区的人抗体重链的可变区和恒定区的实施例中是特别优选的。

本公开的HAC载体可以包括一个或多个编码人抗体轻链的基因。任何合适的编码人抗体轻链的基因都可以用于本发明的HAC载体中。人抗体轻链包含两种类型的基因即，κ/K链基因和λ/L链基因。在一个实施例中，HAC包括一个或多个拷贝的编码κ和λ两者的基因。κ链的可变区和恒定区定位在人染色体2的2p11.2-2p12处，并且λ链形成定位在人染色体22的22q11.2处的簇。因此，在一个实施例中，本发明的HAC载体包括含有2p11.2-2p12区的κ链基因簇的人染色体2片段。在另一实施例中，本发明的HAC载体包括含有22q11.2区的λ链基因簇的人染色体22片段。

在另一实施例中，HAC载体包括至少一个编码人抗体替代轻链的基因。编码人抗体替代轻链的基因是指编码瞬态抗体轻链的基因，所述瞬态抗体轻链与通过在人祖B细胞中重构基因以构成前B细胞受体(preBCR)产生的抗体重链缔合。可以使用任何合适的编码人抗体替代轻链的基因，包含但不限于VpreB1(SEQ ID NO:7)、VpreB3(SEQ ID NO:8)和λ5(还被称为IgLL1，SEQ ID NO:9)人抗体替代轻链以及其组合。VpreB基因和λ5基因在人抗体λ链基因座内定位在人染色体22的22q11.2处。因此，在一个实施例中，HAC可以包括人染色体22的含有VpreB基因和λ5基因的22q11.2区。本发明的人VpreB基因提供了VpreB1基因(SEQ IDNO:7)和VpreB3(SEQ ID NO:8)基因中的任一者或两者并且在一个实施例中提供了VpreB1基因和VpreB3基因两者。

在又另一实施例中，HAC载体包括编码有蹄类动物源性IgM重链恒定区的基因。在此实施例中，IgM重链恒定区表达为具有人IgM抗体重链可变区的嵌合体。可以使用任何合适的编码有蹄类动物IgM重链抗体恒定区的核酸，包含但不限于牛IgM(SEQ ID NO:10)、马IgM(SEQ ID NO:11)、羊IgM(SEQ ID NO:12)和猪IgM(SEQ ID NO:13)。在一个实施例中，嵌合IgM包括SEQ ID NO:14中的序列。通过IgM重链分子进行的前BCR/BCR信号传导通过与B细胞膜分子Ig-α/Ig-β相互作用以在细胞中引起信号转导来促进B细胞的增殖和发育。IgM的跨膜区和/或其它恒定区被视为在与Ig-α/Ig-β的相互作用中具有用于信号转导的重要作用。IgM重链恒定区的实例包含编码如CH1、CH2、CH3和CH4等恒定区结构域以及如TM1和TM2等B细胞跨膜结构域和细胞质结构域的核酸。编码包含在本发明的人人工染色体载体中的有蹄类动物源性IgM重链恒定区的核酸不受具体限制，条件是所述区在可以充分诱导B细胞受体的信号或上述IgM重链恒定区中的B细胞增殖/发育的范围内。在一个实施例中，编码有蹄类动物源性IgM重链恒定区的核酸提供了源自有蹄类动物的跨膜以及胞质TM1结构域和TM2结构域，并且在其它实施例中，编码有蹄类动物源性CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域或有蹄类动物源性CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域。

在一个实施例中，牛的编码IgM重链恒定区的基因是编码牛IgM重链恒定区的包含在牛内源性IgM重链基因所定位的IGHM区(源自IGHM)中的基因或编码IGHML1区中(源自IGHML1)的牛IgM重链恒定区的基因。在另一实施例中，编码牛IgM重链恒定区的基因包含在IGHM区中。

在另外的实施例中，HAC包括编码人抗体重链的基因，所述编码人抗体重链的基因包括编码人重链(例如，人IgG重链，如IgG1重链)的基因，并且其中人重链基因的恒定区的跨膜结构域和胞内结构域被有蹄类动物源性重链(例如，有蹄类动物IgG重链，如IgG1重链)恒定区基因的跨膜结构域和胞内结构域替代。在一个实施例中，编码有蹄类动物源性(如牛)IgG(如IgG1)重链恒定区的跨膜结构域和胞内结构域的基因用于替代人IgG重链基因的对应区。在另一实施例中，编码有蹄类动物源性(如牛)IgG(如IgG1)重链恒定区的TM1结构域和TM2结构域的基因用于替代人IgG重链基因的对应区。在另一实施例中，编码有蹄类动物源性(如牛)IgG(如IgG1)重链恒定区的CH1-CH4结构域和/或TM1结构域和TM2结构域中的一种或多种的基因用于替代人IgG重链基因的对应区。

本公开进一步提供了包括根据本公开的任何实施例或实施例的组合的HAC载体的转基因有蹄类动物。包括本发明的HAC载体的转基因有蹄类动物是指本发明的人人工染色体载体引入到其体内的动物。具有本发明的HAC的转基因有蹄类动物不受特别限制，条件是动物是其中人人工染色体片段可以引入到其细胞中的转基因有蹄类动物，并且可以使用任何非人动物，例如，有蹄类动物，如牛、马、山羊、绵羊和猪；等等。一方面，转基因有蹄类动物为牛。具有本发明的HAC载体的转基因有蹄类动物可以例如通过使用任何合适的技术，如本文所述的那些技术将本公开的HAC载体引入到宿主动物的卵母细胞中来构建。本发明的HAC载体可以例如通过微细胞融合方法引入到源自宿主有蹄类动物的体细胞中。之后，可以通过将细胞的细胞核或染色质聚集体移植到卵母细胞中并且将卵母细胞或要由卵母细胞形成的胚胎移植到宿主动物的子宫中以进行分娩来构建具有HAC载体的动物。可以通过Kuroiwa等人(Kuroiwa等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》,18,1086-1090,2000和Kuroiwa等人,《自然生物技术》,20,889-894)的方法证实通过以上方法构建的动物是否具有人人工染色体载体。

本公开进一步提供了转基因有蹄类动物，所述转基因有蹄类动物包括整合到其基因组中的编码以下的基因：

(a)一条或多条人抗体重链，其中每个编码抗体重链的基因与类别开关调节元件操作性地连接；

(b)一条或多条人抗体轻链；以及

(c)一条或多条人抗体替代轻链和/或有蹄类动物源性IgM重链恒定区；

其中编码一条或多条人抗体重链的基因的至少一个类别开关调节元件被有蹄类动物源性类别开关调节元件替代。

在此类实施例中，转基因有蹄类动物可以包括如本文针对HAC所述的核酸的任何实施例或实施例的组合，但与存在于HAC中相反，其整合到有蹄类动物的染色体中。

本公开进一步提供了产生人抗体的方法，所述方法包括：(a)向本公开的任何实施例或实施例的组合的转基因有蹄类动物施用人冠状病毒或本公开的其它靶抗原，以在有蹄类动物的血清或血浆中产生并积累对人冠状病毒(或对T细胞、B细胞和/或单核细胞)具有特异性的人免疫球蛋白群体；以及任选地(b)从有蹄类动物的血清或血浆中分离、回收和/或纯化对人冠状病毒(或对T细胞、B细胞和/或单核细胞)具有特异性的人免疫球蛋白群体。

多克隆血清或血浆或从多克隆血清或血浆中纯化的人免疫球蛋白可以用作用于冠状病毒病的免疫球蛋白产物。

在一种变化中，本公开提供了一种回收人抗体的蛋白质序列的方法，所述方法包括：(i)从转基因有蹄类动物中分离淋巴细胞；(ii)由淋巴细胞生成产生杂交瘤的人单克隆抗体；以及(iii)从杂交瘤中回收对抗原具有特异性的人单克隆抗体。在另一实施例中，从转基因有蹄类动物的淋巴结中分离来自转基因有蹄类动物的淋巴细胞。在另外的实施例中，用靶抗原对转基因有蹄类动物进行高免疫。

冠状病毒蛋白特异性人免疫球蛋白(如冠状病毒S蛋白特异性人免疫球蛋白)可以通过以下产生：用人冠状病毒蛋白或本公开的另一种抗原对具有HAC载体的转基因有蹄类动物进行免疫，以在转基因有蹄类动物的血清或血浆中产生冠状病毒蛋白特异性人免疫球蛋白，并且从转基因有蹄类动物的血清或血浆中回收冠状病毒蛋白特异性人免疫球蛋白。

用于检测并测量组合物中的冠状病毒S蛋白特异性人免疫球蛋白的方法的实例包含通过酶联免疫吸附测定进行的结合测定等。人免疫球蛋白的结合量可以通过将包括人免疫球蛋白的组合物与细胞(例如，冠状病毒、T细胞、B细胞和/或单核细胞或重组蛋白抗原)一起温育，并且然后使用特异性识别人免疫球蛋白的抗体来测量。

在一种变化中，本公开的方法用于生成单克隆抗体。制备和利用各种类型的抗体的方法对本领域的技术人员来说是众所周知的，并且将适于实践本发明(参见例如，Harlow等人《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory),1988；Kohler和Milstein,《自然(Nature)》256:495(1975))。杂交瘤的制备方法的实例包括以下步骤：(1)用冠状病毒对转基因有蹄类动物进行免疫；(2)从转基因有蹄类动物(即，从淋巴结)中采集产生抗体的细胞；(3)将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合；(4)从在以上步骤中获得的融合的细胞中选择产生对冠状病毒具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤；以及任选地(5)从所选杂交瘤中选择产生对冠状病毒具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤。

在产生对冠状病毒蛋白具有特异性的多克隆免疫球蛋白(如冠状病毒S蛋白特异性人免疫球蛋白)的方法的实施例中，转基因有蹄类动物产生对冠状病毒蛋白具有特异性的人多克隆免疫球蛋白。所述方法可以包括从转基因有蹄类动物中采集多克隆血清和/或多克隆血浆。在一些实施例中，所述有蹄类动物为牛。在一些实施例中，多克隆免疫球蛋白组合物包括完全人免疫球蛋白群体。在一些实施例中，多克隆免疫球蛋白组合物包括完全人免疫球蛋白群体、基本上人免疫球蛋白群体。

本公开的方法的一些实施例和相关组合物具有令人惊讶的优点，即冠状病毒蛋白特异性免疫球蛋白(如冠状病毒S蛋白特异性人免疫球蛋白)以高产率、高纯度和/或以转基因有蹄类动物的血清或血浆中存在的总免疫球蛋白的高百分比产生。此外，一些实施例产生具有聚糖的冠状病毒蛋白特异性免疫球蛋白，所述聚糖包括至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％或更高百分比的岩藻糖基化聚糖。此外，一些实施例产生与参考免疫球蛋白制剂，例如人源性免疫球蛋白的活性至多大约相同的ADCC或CDC活性的冠状病毒蛋白特异性免疫球蛋白。

在一些实施例中，所述人免疫球蛋白群体以15nM或更大的K

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.1％、至少1.2％、至少1.3％、至少1.4％、至少1.5％、至少1.6％、至少1.7％、至少1.8％、至少1.9％、至少2％、至少2.1％、至少2.2％、至少2.3％、至少2.4％、至少2.5％、至少2.6％、至少2.7％、至少2.8％、至少2.9％、至少3％、至少3.1％、至少3.2％、至少3.3％、至少3.4％、至少3.5％、至少3.6％、至少3.7％、至少3.8％、至少3.9％、至少4％、至少4.1％、至少4.2％、至少4.3％、至少4.4％、至少4.5％、至少4.6％、至少4.7％、至少4.8％、至少4.9％、至少5％、至少5.1％、至少5.2％、至少5.3％、至少5.4％、至少5.5％、至少5.6％、至少5.7％、至少5.8％、至少5.9％、至少5.9％、至少6.0％、至少6.1％、至少6.2％、至少6.3％、至少6.4％、至少6.5％、至少6.6％、至少6.7％、至少6.8％、至少6.9％、至少7.0％、至少7.1％、至少7.2％、至少7.3％、至少7.4％、至少7.5％、至少7.6％、至少7.7％、至少7.8％、至少7.9％、至少8.0％、至少8.1％、至少8.2％、至少8.3％、至少8.4％、至少8.5％、至少8.6％、至少8.7％、至少8.8％、至少8.8％、至少9.0％、至少9.1％、至少9.2％、至少9.3％、至少9.4％、至少9.5％、至少9.6％、至少9.7％、至少9.8％、至少9.8％、至少9.9％或至少10％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括0.1-0.6％、0.2-0.7％、0.3-0.8％、0.4-0.9％、0.5-1％、0.6-1.1％、0.7-1.2％、0.8-1.3％、0.9-1.4％、1-1.5％、1.1-1.6％、1.2-1.7％、1.3-1.8％、1.4-1.9％、1.5-2％、1.6-2.1％、1.7-2.2％、1.8-2.3％、1.9-2.4％、2-2.5％、2.1-2.6％、2.2-2.7％、2.3-2.8％、2.4-2.9％、2.5-3％、2.6-3.1％、2.7-3.2％、2.8-3.3％、2.9-3.4％、3-3.5％、3.1-3.6％、3.2-3.7％、3.3-3.8％、3.4-3.9％、3.5-4％、3.6-4.1％、3.7-4.2％、3.8-4.3％、3.9-4.4％、4-4.5％、4.1-4.6％、4.2-4.7％、4.3-4.8％、4.4-4.9％、4.5-5％、4.6-5.1％、4.7-5.2％、4.8-5.3％、4.9-5.4％、5-5.5％、5.1-5.6％、5.2-5.7％、5.3-5.8％、5.4-5.9％、5.5-6％、5.6-6.1％、5.7-6.2％、5.8-6.3％或5.9-6.4％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括0-0.5％、0.5-1％、1-1.5％、1.5-2％、2-2.5％、2.5-3％、3-3.5％、3.5-4％、4-4.5％、4.5-5％、5-5.5％、5.5-6％、6-6.5％、6.5-7％、7-7.5％、7.5-8％、8-8.5％、8.5-9％、9-9.5％、9.5-10％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括0-1％、1-2％、2-3％、3-4％、4-5％、5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括0-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括0-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆血清或多克隆血浆中总免疫球蛋白的质量计，多克隆血清或多克隆血浆包括1-4％、2-5％、3-6％、4-7％、5-8％、6-9％或7-10％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.1％、至少1.2％、至少1.3％、至少1.4％、至少1.5％、至少1.6％、至少1.7％、至少1.8％、至少1.9％、至少2％、至少2.1％、至少2.2％、至少2.3％、至少2.4％、至少2.5％、至少2.6％、至少2.7％、至少2.8％、至少2.9％、至少3％、至少3.1％、至少3.2％、至少3.3％、至少3.4％、至少3.5％、至少3.6％、至少3.7％、至少3.8％、至少3.9％、至少4％、至少4.1％、至少4.2％、至少4.3％、至少4.4％、至少4.5％、至少4.6％、至少4.7％、至少4.8％、至少4.9％、至少5％、至少5.1％、至少5.2％、至少5.3％、至少5.4％、至少5.5％、至少5.6％、至少5.7％、至少5.8％、至少5.9％、至少5.9％、至少6.0％、至少6.1％、至少6.2％、至少6.3％、至少6.4％、至少6.5％、至少6.6％、至少6.7％、至少6.8％、至少6.9％、至少7.0％、至少7.1％、至少7.2％、至少7.3％、至少7.4％、至少7.5％、至少7.6％、至少7.7％、至少7.8％、至少7.9％、至少8.0％、至少8.1％、至少8.2％、至少8.3％、至少8.4％、至少8.5％、至少8.6％、至少8.7％、至少8.8％、至少8.8％、至少9.0％、至少9.1％、至少9.2％、至少9.3％、至少9.4％、至少9.5％、至少9.6％、至少9.7％、至少9.8％、至少9.8％、至少9.9％或至少10％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括0.1-0.6％、0.2-0.7％、0.3-0.8％、0.4-0.9％、0.5-1％、0.6-1.1％、0.7-1.2％、0.8-1.3％、0.9-1.4％、1-1.5％、1.1-1.6％、1.2-1.7％、1.3-1.8％、1.4-1.9％、1.5-2％、1.6-2.1％、1.7-2.2％、1.8-2.3％、1.9-2.4％、2-2.5％、2.1-2.6％、2.2-2.7％、2.3-2.8％、2.4-2.9％、2.5-3％、2.6-3.1％、2.7-3.2％、2.8-3.3％、2.9-3.4％、3-3.5％、3.1-3.6％、3.2-3.7％、3.3-3.8％、3.4-3.9％、3.5-4％、3.6-4.1％、3.7-4.2％、3.8-4.3％、3.9-4.4％、4-4.5％、4.1-4.6％、4.2-4.7％、4.3-4.8％、4.4-4.9％、4.5-5％、4.6-5.1％、4.7-5.2％、4.8-5.3％、4.9-5.4％、5-5.5％、5.1-5.6％、5.2-5.7％、5.3-5.8％、5.4-5.9％、5.5-6％、5.6-6.1％、5.7-6.2％、5.8-6.3％或5.9-6.4％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括0-0.5％、0.5-1％、1-1.5％、1.5-2％、2-2.5％、2.5-3％、3-3.5％、3.5-4％、4-4.5％、4.5-5％、5-5.5％、5.5-6％、6-6.5％、6.5-7％、7-7.5％、7.5-8％、8-8.5％、8.5-9％、9-9.5％、9.5-10％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括0-1％、1-2％、2-3％、3-4％、4-5％、5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括0-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括0-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％或更大的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括1-4％、2-5％、3-6％、4-7％、5-8％、6-9％或7-10％的完全人(或基本上人)免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括至少5％的完全人免疫球蛋白。

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，按多克隆免疫球蛋白中总免疫球蛋白的质量计，多克隆免疫球蛋白包括2％至5％的完全人免疫球蛋白。

在一些实施例中，有蹄类动物源性多克隆免疫球蛋白包括具有人重链和有蹄类动物κ轻链(被称为“cIgG”)的“嵌合”人免疫球蛋白。在一些实施例中，以总蛋白质浓度的百分比计，多克隆免疫球蛋白包括小于约0.5％、小于约0.75％、小于约1.0％、小于约1.25％、小于约1.5％、小于约1.75％、小于约2.0％、小于约2.25％、小于约2.5％、小于约2.75％、小于约3.0％、小于约3.25％、小于约3.5％、小于约3.75％或小于约4.0％的cIgG。在一些实施例中，以总蛋白质浓度的百分比计，多克隆免疫球蛋白包括约0.5％至约1.0％、约1.0％至约1.5％、约1.5％至约2.0％、约1.5％至约2.0％、约2.0％至约2.5％、或约2.5％至约3.0％的cIgG。在一些实施例中，以总蛋白质浓度的百分比计，多克隆免疫球蛋白包括约0.5％至约1.0％、约1.0％至约2.0％、或约1.0％至约3.0％的cIgG。

在一些实施例中，在补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中，本公开的多克隆免疫球蛋白不如参考产物(例如，人源性多克隆免疫球蛋白)有效。在一些实施例中，在补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中，本公开的多克隆免疫球蛋白的效力为参考产物(例如，人源性多克隆免疫球蛋白)的效力至多约5％、至多约10％、至多约25％、至多约50％、至多约100％、至多约150％或更至多约200％。

在一些实施例中，本公开的多克隆免疫球蛋白生成的对CD8+细胞的毒性比参考产物(例如人源性多克隆免疫球蛋白)的毒性低。在一些实施例中，在CD8+细胞杀伤测定中，本公开的多克隆免疫球蛋白的效力比参考产物(例如，人源性多克隆免疫球蛋白)的效力高至多约5％、至多约10％、至多约25％、至多约50％、至多约100％、至多约150％或至多约200％。

在一些实施例中，本公开的多克隆免疫球蛋白生成的CD4+T细胞凋亡的速率比参考产物(例如，人源性多克隆免疫球蛋白)生成的速率低。在一些实施例中，在CD4+细胞凋亡测定中，本公开的多克隆免疫球蛋白的毒性比参考产物(例如人源性多克隆免疫球蛋白)的毒性低至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约100％、至少约150％或至少约200％。

在一些实施例中，本公开的多克隆免疫球蛋白比参考产物(例如，人源性多克隆免疫球蛋白)更好保持T

在本公开的方法和组合物的一些实施例中，完全人免疫球蛋白(或基本上人)群体与人冠状病毒、冠状病毒S蛋白或另一种冠状病毒抗原特异性结合。在一些实施例中，完全人(或基本上人)免疫球蛋白群体与人冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)、人冠状病毒S蛋白或另一种人冠状病毒抗原特异性结合。

在一些实施例中，转基因有蹄类动物的基因组包括人免疫球蛋白基因座。

在一些实施例中，转基因有蹄类动物进行免疫3次、4次、5次或更多次。

在一些实施例中，完全人或基本上人免疫球蛋白群体是在免疫后从转基因有蹄类动物的血清中纯化的。

本公开提供了向有需要的受试者提供对于冠状病毒蛋白(如冠状病毒S蛋白)治疗具有特异性的人多克隆免疫球蛋白的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据本公开的多克隆免疫球蛋白。在一些实施例中，所述方法向受试者提供对冠状病毒蛋白具有特异性的有效量的人多克隆免疫球蛋白。

本公开提供了向有需要的受试者提供对于冠状病毒蛋白(如冠状病毒S蛋白)治疗具有特异性的人多克隆免疫球蛋白的方法，所述方法包括向所述受试者施用通过用人冠状病毒对转基因有蹄类动物进行免疫产生的组合物。在一些实施例中，所述方法向受试者提供对冠状病毒蛋白具有特异性的有效量的人多克隆免疫球蛋白。

本公开提供了向有需要的受试者提供对于冠状病毒蛋白(如冠状病毒S蛋白)治疗具有特异性的人多克隆免疫球蛋白的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据本公开产生的多克隆免疫球蛋白。在一些实施例中，所述方法向受试者提供对冠状病毒S蛋白具有特异性的有效量的人多克隆免疫球蛋白。

本公开进一步提供了药物组合物，其包括完全人或基本上人免疫球蛋白群体以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，完全人或基本上人免疫球蛋白群体与人冠状病毒、人冠状病毒S蛋白或另一种人冠状病毒抗原特异性结合。

在一些实施例中，药物组合物包括至少约1mg/mL、至少约50mg/mL、至少约100mg/mL或至少约1,000mg/mL的完全人或基本上人免疫球蛋白。在一些实施例中，药物组合物包括至少约100μg/mL、至少约250μg/mL、至少约500μg/mL、至少约750μg/mL或至少约1,000μg/mL的完全人或基本上人免疫球蛋白。

在一些实施例中，完全人或基本上人免疫球蛋白是在有蹄类动物体内产生的。在一些实施例中，所述有蹄类动物为牛。

在一些实施例中，按药物组合物中总免疫球蛋白的质量计，药物组合物包括至少5％完全人免疫球蛋白。

在一些实施例中，按药物组合物中总免疫球蛋白的质量计，药物组合物包括2％至5％的完全人免疫球蛋白。

实例

以下具体实例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。

实例1

在转染色体牛(TcB)系统中产生人多克隆免疫球蛋白

申请人已开发了转染色体(Tc)牛产生系统，在所述系统中牛Ig基因被敲除，并且人人工染色体(HAC)载体被引入到牛基因组中以表达人多克隆抗体。这些Tc牛用特异性靶标，如SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白的胞外结构域进行免疫，以产生显著量的抗原特异性人多克隆抗体以用于治疗性处理。

根据表1中的时间表，用表达野生型SARS-CoV-2刺突蛋白的质粒DNA(pDNA)疫苗对转染色体(Tc)牛(量化为产生>2mg/mL总人IgG、>30％IgG1)进行初始免疫(免疫1和2)，随后用来自在昆虫细胞中产生的SARS-CoV-2的重组刺突蛋白进行额外免疫(接种3和以后)。

表1：疫苗接种间隔和调配

对于第一疫苗接种和第二疫苗接种(V1和V2)，通过肌内(IM)注射施用编码来自严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2(SARS-CoV-2)，Wuhan-Hu-1(GenPept：QHD43416)的全长刺突(S)蛋白的pDNA。将佐剂Montanide ISA-206和Quil A共同施用于DNA疫苗接种位点附近。

对于第三疫苗接种(V3)，施用来自SARS-CoV-2，Wuhan-Hu-1(GenPept：QHD43416)的与Montanide ISA-206和Quil A混合的重组S蛋白。S蛋白是使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中产生的并且是通过镍亲和色谱法纯化的。此重组蛋白含有SARS-CoV-2S蛋白的1196个残基(胞外结构域)。其被修饰成去除多碱性S1/S2切割位点(RRAR[SEQ ID NO:18]至A；残基682至685)，其用一对突变(K986P和V987P，野生型编号)稳定，并且包含凝血酶切割位点、T4折叠体三聚化结构域和C末端六组氨酸标签。

将采集的血浆冷冻以供运输，解冻、汇集、通过癸酸(CA)分馏，并且通过深层过滤澄清。如下对含有Tc牛源性人免疫球蛋白G(IgG)的经澄清的材料进行纯化：通过亲和色谱法，首先使用抗人IgG亲和柱以与Tc牛源性人IgG(hIgG)结合并去除牛血浆蛋白(BPP)，然后进行低pH处理以供病毒灭活，并且之后穿过抗牛IgG(bIgG)重链(HC)特异性亲和柱以进一步去除含有牛HC或牛HC的Fc的残余IgG分子。然后对Tc牛源性人IgG馏分进行浓缩并渗滤，之后进行Q琼脂糖色谱法抛光步骤、纳米过滤、最终缓冲液交换、浓缩和灭菌过滤。

TcB产生的人多克隆免疫球蛋白的生物化学表征

Tc牛被工程化为偏向人IgG1。正常人血浆和Tc牛的人IgG子类别比率呈现在表2中。在Tc牛源性抗体中，IgG亚类别处于以下范围内：

表2：相比于Tc牛人IgG存在于正常人IgG中的IgG子类别

经纯化的免疫球蛋白是通过SDS-PAGE(图2A-2B)和尺寸排阻色谱法(图3)表征的。人免疫球蛋白以高浓度(表3)以及高单体丰度和IgG1百分比(表4)存在。

表3

表4

TcB产生的人多克隆免疫球蛋白的功能表征

与人Fcγ受体的结合为通过生物层干涉法进行的测定。结果示出在表5中。

表5

通过ELISA在全血中检测sC5b-9对补体活化进行了评估。将血液在存在多克隆免疫球蛋白的情况下在37℃、25mM下温育两小时。添加EDTA以停止反应(补体活化为Ca2+和Mg2+依赖性的)。使用了热聚集的IgG(HAGG)作为补体活化的阳性对照。活化是通过ELISA分析作为sC5b-9的补体片段测量的。在人源性样品与TcB样品之间未观察到统计差异(图4)。

抗体依赖性细胞毒性(ADDC)是通过ADCC iLite测定检测CD16A介导的信号传导(图5A)和使用来自

证明相似水平的人Fcγ受体结合的另外的数据在图6A-6B中提供。

还对在存在Raji和抗CD20利妥昔(Rituxan)的情况下由Jurkat-CD64产生的IL-2产生的抑制进行了测试。TcB源性产物表现出的对与效应细胞特异性抑制IL-2产生的免疫复合物相互作用的抑制略微优于人IgG(图7)。

TcB产生的人多克隆免疫球蛋白的糖基化

IgG1的岩藻糖基化先导物的减少已示出COVID-19患者的巨噬细胞活化和肺上皮损伤增加。

申请人已发现，与康复血清不同，本文所述的有蹄类动物源性多克隆免疫球蛋白虽然具有完全人抗体序列，但维持较高的岩藻糖基化。TcB系统将高岩藻糖基化维持在94％，这与正常人IgG1岩藻糖基化水平相当，但与在对SARS-CoV-2具有特异性的人源性hIgG1中观察到的岩藻糖基化水平不同。因此，本公开提供了一种用于获得用于治疗COVID，如COVID-19或由未来的冠状病毒菌株引起的疾病的高度岩藻糖基化的人免疫球蛋白的独特方法。IgG1岩藻糖基化的正常水平(例如,约94％)将这种疗法与其它疗法区分开，因为其可以避免可能导致上皮肺组织损伤的ADCC和效应细胞功能的强活化。

另外，TcB源性产物含有NGNA，这将所述产物与人源性产物区分开。

表6提供了通过质谱法确定的TcB源性产物的糖基化谱。

表6

表7将TcB源性产物与人源性产物的NGNA含量进行比较。唾液酸分析表明TcB产生的hIgG具有>90％NGNA。NGNA的唯一预期影响将是清除率更高，但先前的临床工作表明TcB源性产物的半衰期为28天，与人源性hIgG1相同。

表7

实例2

SAB-185在健康参与者体内的安全性、耐受性和药代动力学

冠状病毒病2019(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的传染病。SAB Biotherapeutics公司(SAB Biotreateutics)已开发了SAB-185，即静脉内(转染色体[Tc]牛源性)抗SARS-CoV-2人免疫球蛋白，作为用于治疗COVID-19的潜在治疗剂。本研究将评估SAB-185在健康参与者体内的安全性、免疫原性和药代动力学。

五个队列接受递增剂量水平或产物或安慰剂：

·含10mg/kg SAB-185的生理(0.9％)盐水；浓度4mg/mL(0.4％)

·含25mg/kg SAB-185的生理(0.9％)盐水；浓度20mg/mL(2％)

·含25mg/kg SAB-185的生理(0.9％)盐水；浓度20mg/mL(2％)。队列3将在第一次处理后7天(+/-2)接受第二次25mg/kg剂量的SAB-185。

·含50mg/kg SAB-185的生理(0.9％)盐水；浓度20mg/mL(2％)

·与实验药物组中的每个队列的体积大致相同的生理(0.9％)盐水。

主要结果量度为：

·具有不良事件的参与者的数量[时间范围：29天]

·其它不良事件和严重不良事件(SAE)的发生率和严重程度

·具有输液相关的不良事件的参与者的数量[时间范围：29天]

·输液相关的不良事件

次要结果量度为：

·具有不良事件的参与者的数量[时间范围：90天]

·从筛选至研究第90天的不良事件和SAE的发生率和严重程度

·从筛选至第90天的药代动力学[时间范围：90天]

·从筛选至研究第90天SARS-CoV-2结合(ELISA)抗体和中和(PRNT80)抗体滴度

SAB-185在患有COVID-19的流动参与者体内的安全性、耐受性和药代动力学

冠状病毒病2019(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的传染病。SAB Biotherapeutics公司已开发了SAB-185，即静脉内(转染色体[Tc]牛源性)抗SARS-CoV-2人免疫球蛋白，作为用于治疗COVID-19的潜在治疗剂。本研究将评估SAB-185在患有COVID-19的流动参与者体内的安全性、免疫原性和药代动力学。

SAB-185是经纯化的人免疫球蛋白G(hIgG)，其被设计成与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病毒特异性结合。SAB-185是从获得免疫的Tc牛的质粒中进行纯化的，所述获得免疫的Tc牛最初用表达野生型SARS-CoV-2刺突蛋白的质粒DNA(pDNA)疫苗进行免疫(免疫1和2)，随后用来自在昆虫细胞中产生的SARS-CoV-2的重组刺突蛋白进行了额外免疫(接种3和以后)。经纯化的hIgG为以10mM谷氨酸单钠盐、262mM D-山梨糖醇、0.05mg/mL Tween 80，pH 5.5调配的无菌液体。药物产物将静脉内施用并且将根据临床方案在盐水中稀释。

四个队列接受递增剂量水平或产物或安慰剂：

·含10mg/kg SAB-185的生理(0.9％)盐水；浓度4mg/mL(0.4％)

·含25mg/kg SAB-185的生理(0.9％)盐水；浓度20mg/mL(2％)

·含50mg/kg SAB-185的生理(0.9％)盐水；浓度20mg/mL(2％)

·与实验药物组中的每个队列的体积大致相同的生理(0.9％)盐水。

主要结果量度为：

·具有不良事件的参与者的数量[时间范围：29天]

·其它不良事件和严重不良事件(SAE)的发生率和严重程度

·具有输液相关的不良事件的参与者的数量[时间范围：29天]

·输液相关的不良事件

次要结果量度为：

·具有不良事件的参与者的数量[时间范围：90天]

·从筛选至研究第90天的不良事件和SAE的发生率和严重程度

·评估静脉内施用的SAB-185的PD[时间范围：90天]

·测量从筛选至研究第90天SARS CoV-2中和(PRNT80)抗体滴度

·由SAB-185引发的免疫应答[时间范围：90天]

·测量直至第90天的类风湿因子

·由SAB-185引发的受试者抗SAB-185抗体的浓度[时间范围：90天]

·测量直至筛选第90天抗SAB-185抗体

·口咽(OP)或鼻咽(NP)拭子样本中SARS-CoV-2的发生率[时间范围：29天]

·通过定量RT-PCR测量的直至研究第29天拭子样本中SARS-CoV-2的发生率

·口咽(OP)或鼻咽(NP)拭子样本中SARS-CoV-2的水平[时间范围：29天]

·通过定量RT-PCR测量的直至研究第29天拭子样本中SARS-CoV-2的水平

实例3

针对VSV-SARS-CoV-2突变体的SAB-185体外评估

包含(D614G、N501Y、S477N和E484K)的四种所关注的突变体目前在人体内高度循环。在此研究中，使用了VSV-SARS-CoV-2和从用两个剂量的编码Wuhan菌株S基因的质粒DNA以及之后的重复剂量的重组S蛋白进行高免疫的转染色体(Tc)牛中纯化的SAB-185来评估相比于对于SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1 S蛋白来说单克隆的中和受体结合结构域(RBD)，SAB-185在体外用野生型和D614G、S477N、E484K和N501Y S蛋白取代中和野生型SARS-CoV-2(D614G变体)和嵌合水疱性口炎病毒(VSV)SARS-CoV-2报告病毒的能力。

转染色体(Tc)牛的基因组含有人人工染色体(HAC)，所述人人工染色体包括驻留在2种不同的人染色体(hChr)，具体地来自hChr14的IgH基因座和来自hChr2的免疫球蛋白κ(Igk)基因座上的整个人Ig基因储库(人Ig重链[IgH]和人κ轻链)。所述系统维持使用由免疫球蛋白基因储库提供的遗传信息以生成广泛多样的人多克隆抗体(pAb)的能力。然后，在用合适的抗原进行疫苗接种后，可以在这些Tc牛体内产生完全hIgG(hIgG/hIgκ)，并且这些动物在其血浆中产生至多15g/L的IgG抗体(类似于具有7-16g/LIgG的人)。使用这种方法，针对对于人类而言的大量紧急威胁的多克隆血清已得到开发并被确立为安全。

结果

在转染色体牛体内生成针对SARS-CoV-2刺突的人免疫球蛋白。

为了生成抗SARS-CoV-2多克隆人免疫球蛋白SAB-185，用编码Wuhan-Hu-1菌株刺突(S)基因的DNA对转染色体(Tc)牛进行了初免(Wu等人《自然》579:265-69(2020))。以3周间隔用SARS-CoV-2刺突蛋白进行第一接种(V1)和第二接种(V2)，之后以4周间隔用具有从昆虫细胞中产生和纯化的重组刺突胞外结构域的3次后续增强剂进行第三接种(V3)至第五接种(V5)。在V3至V5的每次增强剂后8天、11天和14天采集血浆。然后将合格的血浆汇集并且针对人IgG SAB-185进行cGMP纯化。分别从汇集的V3血浆和V4血浆中纯化SAB-185批次1和批次5。从汇集的V3、V4和V5血浆中纯化SAB-185批次6。

SAB-185对VSV-SARS-CoV-2的中和的作用。

在此使用基于VSV-SARS-CoV-2的中和测定，对SAB-185抑制由S蛋白介导的感染的能力进行了评估。将VSV-SARS-CoV-2与增加浓度的SAB-185一起在37℃下温育1小时，并且测量Vero E6细胞上的残留传染性。观察到有效中和，其中大致IC

使用单克隆抗体，先前在对特定单克隆抗体表现出抗性的SARS-CoV-2刺突中选择了>50个突变体。这些突变体中有S477N和E484K，这两种突变体对多种抗体表现出抗性并且存在于新出现的关注变体中。还生成了显性D614G和小鼠适配的N501Y变体。为了确定SAB-185的效力是由于刺突中的这些单独氨基酸取代中的任何氨基酸取代还是双突变体N501YE484K而改变，进行了中和测定。将所指示的VSV-SARS-CoV-2突变体中的每一种与增加浓度的SAB-185一起在37℃下温育1小时，并且测量Vero E6细胞上的残留传染性(图8B)。图8C是相同数据的热图。所有四种突变体都由SAB-185以与对于野生型刺突观察到的那些水平相似的水平进行剂量依赖性抑制。此数据表明，SAB-185对存在于SARS-CoV-2的循环人分离株(isolate)中的D614G、N501Y、S477N和E484K突变体具有等同的中和能力。

选择SAB-185逃逸突变体

利用VSV RNA依赖性RNA聚合酶的固有容易出错的性质，我们和其它人先前已经通过使用mAb和人康复血清进行选择来分离VSV-SARS-CoV-2S基因突变体。对SAB-185和阴性对照hIgG在1的MOI下中和针对VSV-SARS-CoV-2的活性进行了测试。覆盖物中添加的SAB-185的浓度完全抑制病毒感染(图9A)。与容易分离mAb和血清逃逸突变体的能力相反，无法分离对人免疫球蛋白SAB-185具有抗性的突变体(图9B)。总而言之，此分析表明，结合SARS-CoV-2S蛋白上的不同表位的pAb的天然混合物对免疫逃逸构成屏障。

实验模型和受试者细节

细胞：将细胞在潮湿温育箱中在34℃或37℃和含5％CO

VSV-SARS-CoV-2突变体。VSV-SARS-CoV-2如先前所述(6)。S477N和E484K是从先前所述的mAb(7)中分离的逃逸突变体。使用SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1刺突分别用N501或D614位点处的取代构建N501Y和D614G，并且通过使用逆向遗传系统挽救。然后对病毒进行蚀斑纯化，并且通过桑格尔测序(Sanger sequencing)(GENEWIZ)鉴定突变。使病毒原液在含有2％FBS和20mM HEPES pH 7.7的培养基199(密理博西格玛公司(Millipore Sigma))中在34℃下以0.01的MOI在MA104细胞上扩增。在广泛的细胞病变效应后收获病毒上清液，并且通过以1,000x g离心5分钟来澄清细胞碎屑。将等分试样维持在-80℃下。

方法细节

蚀斑测定。对Vero和Vero E6-TMPRSS2细胞进行蚀斑测定。简言之，将细胞接种到6孔板中过夜。使用DMEM对病毒进行连续稀释，并且将细胞在37℃下感染1小时。在34℃下在存在Ab或不存在Ab的情况下用琼脂糖覆盖物将细胞培养2天。覆盖物中添加的SAB-185pAb的浓度完全抑制病毒感染。在生物分子成像器上扫描板，并且eGFP的表达在感染后48小时显示。

使用重组VSV-SARS-CoV-2和突变体进行中和测定。简言之，初始稀释开始于83μg/mL，并且在96孔板中连续稀释三倍，经八次稀释。将所指示稀释的SAB-185pAb与10

定量和统计分析

所有统计测试都如所示图例中所述进行。对于图8A-8B和图9A使用Prism 9.0进行非线性回顾(曲线拟合)。所使用的独立实验的数量在相关附图图例中指出。

实例4

来自转染色体牛的肌内抗SARS-CoV-2免疫球蛋白保护K18转基因小鼠免受活病毒激发

产生了抗SARS-COV-2产物(SAB-185)。在使用至多50mg/kg的IV施用途径的1期健康志愿者临床试验和1b期流动COVID-19患者临床试验中评估了SAB-185[clinicaltrial.gov；分别地NCT04469179、NCT04468958]。SAB-185在健康志愿者和感染COVID-19的志愿者体内是安全的、耐受良好的且非免疫原性的(准备手稿)。接下来，在表达人ACE2受体的K18转基因小鼠中进行SARS-CoV-2活病毒激发研究。

为了评估暴露前有效性，向两组K18小鼠(每组n＝12)给予低或高剂量SAB-185的IM注射，然后在12小时后用鼻内施用的亚致死剂量的SARS-COV-2进行激发。为了评价暴露后有效性，在亚致死病毒鼻内激发后六小时或24小时，用IM施用的SAB-185对两组K18小鼠(每组n＝12)进行处理。第五组受感染的盐水处理的K18小鼠充当对照(n＝12)。SAB-185的IM施用在预防SARS-COV-2感染时非常有效。单独的实验评价了SAB-185对致死激发剂量的SARS-COV-2的有效性。在鼻内SARS-COV-2激发之前12小时或之后6小时，用IM SAB-185对两组K18小鼠(n＝5)进行了处理。一组受感染的盐水处理的K18小鼠(n＝5)充当对照。与5个未经处理的对照之1相比，所有经处理的小鼠存活。这些结果显示，当通过IM注射施用时，SAB-185在K18小鼠体内作为暴露前预防和暴露后预防都有效。这些结果支持在人体内进行进一步临床测试以预防COVID-19病。

结果

SAB-185在激发后降低SARS-CoV-2病毒负载的功效

在之前(暴露前)用低(1.87mg)和高(3.75mg)剂量的SAB-185或在用活SARS-CoV-2病毒鼻内激发之后(暴露后)六小时和24小时用高剂量SAB-185对五组(每组n＝12)K18转基因小鼠进行处理。在每组内，在激发后第2天、第4天、第6天和第8天对三只小鼠实施安乐死。在安乐死时，获得血液样品，并且移除肺、鼻甲、脑、肝、肾和心脏以供分析。通过ddRT-PCR和病毒分离对肺组织中SARS-Cov-2的存在进行评估以评估在IM施用后SAB-185的全身抗病毒影响。图11A示出了在来自暴露前组中的动物的在各个时间点存在于肺组织中的SARS-CoV-2RNA的拷贝数。在所有时间点，与对照盐水处理的组相比，用低剂量或高剂量的SB-185处理的组显示出较低的几何平均病毒RNA拷贝数。由于每个时间点存在仅3只动物，因此未进行统计分析。图11B显示了与对照动物相比，高剂量和低剂量暴露前组中的所有动物(n＝12)的ddRT-PCR结果。两个暴露前组的几何平均RNA拷贝数与对照盐水处理的小鼠的几何平均RNA拷贝数相似且显著低于其(p<0.0001)，这表明暴露前IM SAB-185处理的有效性。

类似地，来自暴露前组的动物的(图12A)的分别在激发后六小时和24小时接受高剂量SAB-185的肺在所有时间点显示出比接受盐水的对照动物低的几何平均SARS-CoV-2RNA拷贝。图12B示出了相比于对照组，每个组中的所有动物的ddRT-PCR结果，不管在激发后采样的时间如何。结果显示，SARS-CoV-2RNA拷贝的几何平均数显著低于盐水处理的对照组的几何平均拷贝数(p<0.0001)，这表明暴露后IM SAB-185处理的有效性。

为了评估动物组中在暴露后肺中活病毒的存在，在VERO81细胞中对肺组织进行处理和培养，随后进行IFA，以检测SARS-CoV-2的存在。结果汇总于表8中。直至激发后第8天，来自低剂量和高剂量暴露前组中的所有动物的肺样品未显示出可检测的活病毒。类似地，来自用高剂量IM SAB 185处理的暴露后6小时组的所有肺组织对于可检测到的活病毒呈阴性。来自暴露后24小时SAB-185处理的组中的12只动物中的四只动物的肺样品具有可检测到的活病毒。其中，两个肺样品来自在激发后第2天提取的样本，并且两个肺样品来自在第6天获得的样本。与SAB-185处理的动物不同，来自对照盐水处理的组中的12只动物中的9只动物的肺组织跨所有时间点均具有可检测到的活病毒。

表8：来自经处理的小鼠和未经处理的小鼠的肺组织病毒分离结果(阳性数/总数)。

SAB-185对减少激发后器官病理学的功效

在病毒激发后第2天、第4天、第6天和第8天，对来自每个组的三只小鼠实施安乐死。通过组织学/免疫组织学染色检查鼻甲、肺、肝、肾、心脏和脑组织的器官病理学，并且如表3所述进行评分。除两个小鼠(一个在第2天，一个在第4天)之外，所有对照盐水处理的小鼠直至激发后第8天在肺中显示出1+至3+组织学变化。肺组织显示出多病灶血管周和间质单核细胞、嗜酸性细胞浸润。血管表明与单核白细胞的着边和迁移一致的透壁多病灶单核细胞(图13E)。还观察到肺泡炎症，其显示出与间质性肺炎一致的淋巴细胞组织、细胞多病灶浸润。针对SARS-CoV-2病毒抗原的存在的免疫组织化学染色在肺泡间隔中显示出多病灶免疫反应性(图13F)。相比之下，除了在暴露前高剂量(第2天)、暴露后6小时(第4天和第8天)和暴露后24小时(第2天和第6天)组中各一只小鼠外，来自SAB-185处理的动物(暴露前低剂量和高剂量、暴露后6小时和24小时)的肺组织看起来正常。

在检查动物的鼻甲时，所有盐水处理的对照小鼠在第2天显示出3+病理学，其在第4天和第6天降低至1+。到第8天，仅1/3动物显示出异常组织学。一般来说，与盐水处理的动物相比，SAB-185处理的动物的鼻甲中的病理学不太严重。暴露前低剂量组在第2天显示出2+至3病理学，在第4天显示出1+，之后在第6天和第8天显示出正常鼻甲。在暴露前高剂量组中，小鼠仅在第2天显示出1+至2+病理学。在第4天、第6天和第8天实施安乐死的小鼠具有正常鼻甲。在暴露后处理组中，除了暴露后6小时组中第8天的一个动物之外，所有动物均显示出1+至2+病理学。与24小时组相比，暴露后6小时组的严重程度更小。

测试的所有其它器官(肝、肾、心脏和脑)在任何对照或SAB-185处理的小鼠中均未显示感染相关病理学，但在第6天实施安乐死的一只对照小鼠除外。来自此动物的脑组织在H&E染色上显示出4+变化，包含影响下丘脑的多病灶血管周单核细胞浸润。还观察到影响大脑和下丘脑的神经元的轻度多病灶空泡化。免疫组织化学染色在嗅球、大脑、海马体、丘脑和下丘脑中是阳性的。

在IM施用后检测SAB-185

将来自在指定时间段实施安乐死的动物的血清汇集，并且使用可商购获得的定量ELISA对总人抗SARS-CoV-2IgG的存在进行分析。假定任何可检测到的人抗SARS-CoV-2IgG表示SAB-185。图14A-14B显示人抗SARS-CoV-2抗体存在于暴露前用低剂量或高剂量的SAB-185处理的小鼠体内(图14A)以及暴露后6小时和24小时处理的那些小鼠体内(图14B)。抗SARS-CoV-2抗体在激发后第2天存在于这些动物体内，并且持续到激发后第8天。相比之下，在对照盐水处理的动物体内不存在可检测到的抗体。

cPASS ELISA用作替代物，以评估来自施用IM SAB-185的小鼠的血清中的抗SARS-CoV-2中和活性。将80％中和抗体滴度用作与试剂盒阴性对照样品相比使与重组RBD蛋白的结合的降低大于或等于80％的最高稀释度。显而易见的是，在研究期间测量的所有时间点，来自所有SAB-185处理的组(暴露前低剂量和高剂量、暴露后6小时和24小时)的血清均含有SARS-CoV-2中和抗体(80％中和滴度80-320)。在研究期间的任何时间点，在对照盐水处理的组中未发现可检测到的中和抗体(表9)。

表9：通过C-pass ELISA测量的SARS-CoV-2中和抗体

致死病毒激发后的发病率和死亡率。

用致死剂量的SARS-CoV-2鼻内激发三个由五只动物构成的组，然后持续28天，每日观察，所述每日观察包含体重测量和临床疾病迹象(表10)。图15A示出了Kaplan Meier图，其显示了在激发后存活的小鼠的百分比。在对照组中，在激发后第9天之后，仅五只动物之一存活，而暴露后组和暴露前组中的所有小鼠存活，这表明显著保护免于活SARS-CoV-2激发(p<0.003)。

表10

出现感染迹象的时间在图15B中示出。到第7天，对照组中的所有五只动物都显示出感染迹象。在激发后六小时用高剂量SAB-185处理的小鼠中，除了在第5天出现疾病迹象(并且随后恢复)一只小鼠外，所有小鼠都保持无症状。在整个观察时间段，在鼻内激发之前12小时给予高剂量IM SAB-185的小鼠保持无症状。

讨论

这项研究的结果表明，通过IM注射施用经纯化的抗SARS-CoV-2高免疫多克隆抗体产物SAB-185在表达人ACE2受体的K18转基因小鼠中提供了显著保护免于SARS-CoV-2活病毒激发。当在暴露前在鼻内激发前12小时给予时，低(1.88mg)和高(3.75mg)剂量的SAB-185多克隆IgG抗体显著减少了肺的SARS-CoV-2感染，如通过ddRT-PCR检测到的病毒RNA的不存在或显著减少以及无法通过在肺组织中进行培养来检测活病毒证明的。此外，与未经处理的对照小鼠相比，肺组织的组织学检查和免疫组织化学染色证明肺中不存在组织病理学或感染。

在鼻内SARS-CoV-2激发后六小时用IM给予的SAB-185进行高剂量处理的暴露后，动物几乎没有显示出肺病理学或感染，如通过从所有12只小鼠的肺中无法恢复活病毒证明的。与盐水处理的对照小鼠相比，在激发后24小时施用的SAB-185进行的高剂量暴露后处理似乎不太有效，但仍使SARS-CoV-2病毒RNA减少并且从肺组织中分离病毒的频率较低。与激发后24小时相比，在激发后六小时施用SAB-185的病毒负载更大地减少的趋势可以由限制病毒复制和全身传播的早期干预来解释。

在鼻内活病毒激发之前和之后，在给予IM注射SAB-185的小鼠的汇集的血清中检测到人抗SARS-CoV-2IgG抗体。利用cPASS测定确定这些抗体的中和活性。汇集的血清样品中高水平的SARS-CoV-2IgG和中和抗体表明SAB-185从肌内注射部位全身传播。在暴露前组中，与低剂量组相比，SARS-CoV-2IgG和中和抗体在高剂量组中往往更高，但每个时间点时组之间的滴度仅在一个稀释度内。对于暴露后组，与在24小时时给药的那些小鼠相比，IgG和中和抗体滴度在感染后六小时时给药的小鼠中在第2天和第4天往往更高，但组之间的滴度也仅在一个稀释度内。

所有小鼠在鼻内施用活SARS-CoV-2后都表现出鼻甲感染。在通过H&E和免疫组织化学染色检查组织样品时通过2+至3+组织学变化指出了这一点。不受理论束缚，预防鼻甲感染失败是由于缺乏足够的粘膜中和抗体活性以及将高SARS-CoV-2滴度直接接种到鼻通路中。

对于未经处理的对照组中的小鼠，除了一只动物之外，通过RT-PCR或病毒培养在脑、肝、肾或心脏中未观察到SARS-CoV-2感染的证据。对于这一只动物，脑组织在激发后第6天通过免疫组织化学染色显示出感染证据。此单独的动物的病毒抗原检测表明，在鼠研究中，CNS感染不经常发生。这与Golden等人《JCI洞察杂志(JCI Insight)》5(19):e142032(2020)形成对比，所述文献显示，其研究中的大多数K18转基因小鼠在激发后5-11天证表现出脑受累的证据。

总之，与对照相比，SARS-CoV-2激发前和激发后施用的IM SAB-185显著降低了K18小鼠的肺部感染、发病率和死亡率。这项研究提供了临床前证据，即IM SAB-185可以是适于保护大群体，如医疗和军事人员、免疫抑制的患者、关键基础设施工人和护理家庭居民的有效SARS-CoV-2暴露前和暴露后出路。这些结果支持在人体内进行进一步临床测试以预防COVID-19病。

材料和方法

抗SARS-CoV-2多克隆抗体SAB-185

SAB 185是由利用表达作为初免剂的USA-WA1/2020SARS-CoV-2菌株的全长刺突蛋白以及之后的刺突蛋白的重组胞外结构域的增强剂的DNA构建体以初免剂-增强剂方式进行高免疫的转染色体牛(Tc牛)产生的。初免剂由调配在相隔三周给予的SAB的专有佐剂调配物(SAB-adj-1)中的两种12mg剂量的DNA组成。DNA疫苗是通过使用PharmaJet

SARS-CoV-2激发病毒

SARS-CoV-2的活USA-WA1/2020菌株在VERO81细胞中繁殖，并且在传代6时收获，以制备供激发实验使用的病毒原液。将病毒原液以2x 105PFU/mL(致死激发)和2x 104PFU/mL(亚致死激发)的浓度储存，如通过蚀斑测定确定的。将原液保持储存在-80℃下。

预防性且暴露后肌内施用SAB-185

在第一实验中，使用了五组K18-hACE2转基因小鼠(每组12只)。组1和2分别表示低剂量和高剂量暴露前处理。总体积为50μl的由1.88mg组成的低剂量和高剂量3.75mg的SAB-185是在SARS-CoV-2的鼻内激发前12小时IM递送的。组3和4表示暴露后处理并且分别在鼻内SARS-CoV-2活病毒激发后六小时和24小时接受高剂量SAB-185。组5中的动物充当对照并且接受盐水。在第0天，使所有动物都鼻内感染50μL 103PFU的SARS-CoV-2。在第2天、第4天、第6天和第8天时，对来自每组的三只动物实施安乐死，并且在尸检时将血液、肺、鼻甲、脑、肝、肾和心脏去除，以进行组织学检查。对肺的一部分进行处理以通过培养检测活病毒，并且通过定量液滴数字RT-PCR(ddRT-PCR)检测病毒RNA。

第二实验检查了SAB-185对降低发病率和死亡率的有效性。用致死剂量(1x104pfu)的活SARS-CoV-2激发三个每组由5只动物组成的组。组1在激发前12小时接受高剂量SAB-185，并且组2在激发后6小时接受相同的剂量。组3中的动物充当对照并且接受盐水。在鼻内激发后，观察小鼠中总共28天的疾病的临床症状和死亡率。表10示出了用于对临床疾病的严重程度进行定量的症状量表。

IM SAB-185的暴露前和暴露后功效分析

在第一实验中，在所指示时间收获肺。将器官的一半固定在福尔马林中并且进行处理以用于组织学检查。基于表11中的分级量表对组织的H&E切片进行组织学分级。将另一半在PBS中匀浆化，并且对匀浆的一半进行处理以通过ddRT-PCR分析评估病毒负载。将引物序列靶向USA-WA1/2020病毒菌株的核衣壳基因。正向引物序列和反向引物序列分别为5'-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3'(SEQ ID NO:15)和5'-TCTGGTT ACTGCCAGTTGAATCTG-3'(SEQ IDNO:16)。所使用的探针序列为5'-ACCCCGCAT-/ZEN/-TACGTTTGGTGGACC-3'-3IABkFQ(SEQ IDNO:17)。ddRT-PCR结果表示为总RNA拷贝数。将来自SAB 185处理的动物的结果与未经处理的对照进行比较，以评估SAB 185对活病毒激发后的病毒负担的影响。

表11

对匀浆的另一半进行处理以通过组织培养回收活病毒。将简单等分试样的匀浆在含有VERO81细胞的汇合单层的烧瓶中温育，并且在37℃下温育7天。温育后，将细胞刮取，通过3000rpm的离心澄清，并且将细胞团粒重悬并施涂到24孔载玻片上，以供免疫荧光测定(IFA)。将载玻片固定在Cytofix/Cytoperm中，并且之后使用针对SARS-CoV-2的刺突蛋白(ProSci，目录号3525)的抗体检查荧光感染的细胞的存在。

检测小鼠血清中的SAB-185多克隆抗体

在各个时间点使用COVID-SeroIndex定量测定测量小鼠血清中的总抗SARS-CoV-2IgG抗体。此测定检测人IgG，并且因此用于在IM注射后对SAB-185的血清水平进行定量。测定利用与小鼠血清反应的重组SARS-CoV-2RBD抗原包被的板。用酶连接的抗人IgG单克隆抗体检测结合的抗RBD抗体。对于定量，在第二正交测定中测试阳性样品，在所述测定中用SARS-CoV-2刺突蛋白包被的板与样品反应，然后使用酶连接的抗人IgG单克隆抗体进行结合的抗体检测。通过将来自测试样品的信号与校准曲线进行比较，计算任意单位/毫升(AU/mL)的最终定量读出。

使用了GeneScript cPASS技术以检查通过IM注射给予SAB-185的小鼠的血清抗SARS-CoV-2中和抗体活性。这是通过模拟SARS-CoV-2病毒与携带ACE-2受体蛋白的宿主细胞之间的相互作用来检测样本中的总中和抗体的抑制测定。简言之，用ACE-2蛋白包被的板与含有所关注血清样本的混合物和与HRP缀合的重组受体结合蛋白反应。如果抗体以干扰与ACE-2蛋白结合的方式存在于与RBD蛋白结合的样本中，则将不存在颜色，这表示存在中和抗体。因为测定不需要直接检测结合抗体，所以测定可以用于检测人和动物抗SARS-CoV-2抗体两者，并且不是同种型特异性的。对于此测定，将来自在所指示日实施安乐死的三只动物的血清汇集并进行测试。由汇集的血清进行两倍连续稀释，随后根据制造商指南在cPASS抑制测定中测试所述汇集的血清的替代中和活性。产生80％或更大抑制的最高血清稀释被视为是端值中和滴度。

数据分析

使用单向ANOVA(图基方法(Tukey Method))计算指示组的几何平均RNA拷贝数，并且通过多重平均值比较对统计显著性进行比较。使用GraphPad Prism软件包，通过对数秩(Mantel-Cox)测试对死亡率和发病率的结果进行分析。

****

虽然本文已经示出和描述了本发明的实施例，但本领域技术人员将理解，此类实施例仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。以下权利要求书旨在限定本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和其等同物的范围内的方法和结构。

序列表

<110>SAB生物制药公司（SAB Biotherapeutics, Inc.）

T·卢克

C·L·鲍施

E·J·萨利文

H·吴

K·A·埃格兰德

<120>对冠状病毒蛋白具有特异性的有蹄类动物源性多克隆免疫球蛋白和其用途

<130>SABB-002/04WO 321962-2012

<150>US 63/180,935

<151>2021-04-28

<150>US 63/144,784

<151>2021-02-02

<150>US 63/076,121

<151>2020-09-09

<150>US 63/072,683

<151>2020-08-31

<160>18

<170>PatentIn 3.5版

<210>1

<211>6802

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>1

cagcagggtc acaagggcag gccgggtcct tgtggagagc acatttagtg ggagggacat60

gatttccctt caaagtgccc attctggacg cttcccgttc catgctggac gcttcctctt 120

ccacgctgga tgcttcctgt tccacactgg atgcttcctg ttccacgctg gatgtttcct 180

gttacactct ggatgcttcc tgttccacac tggatgcttc ctgttccatc ctggatgctt 240

cctgttccat gctggacatt tcctgttcca ctctggatgc tccctgttcc atgctggatg 300

cttcctgttc catgctggat gcttcctgtt ccatgctgga catttcctgt tccactctgc 360

atgcttcctg ttccactctg gatgcttcct gttccatggt ggacgtttcc tgttccactc 420

tgcatgcttc ctgttccatg ctggatgctt ccttttccat tctggatgct tcctgttcca 480

tgttggatgt ttcttgttcc actctggatg cttcctattc cattctggat gcttcctgtt 540

ccatgctgga catttcctgt tccatgctgg atgctttctg ttacatcctg gatgcttcct 600

gttccatgct ggatgttttt tgtttgactc tggatgcttc cagttccatt ctggatgctt 660

cctgttccat gctggatgct tccttttcca ttccgcacaa ttcctattcc attctggaca 720

cttcctgtgc gacacctcct tgggttttct gtctgcccag tccctctatc ctcatcccgt 780

tccctgctac ctcccacctc cacaatcgtc cttgcccagc tcctccctct ctctagagct 840

tcggcctggc aaggtccctc ctgatctcag tccaggctcc cccagcacag gtaggagcct 900

agcacctgcc cttggacctc cccaccctgc atggtgccag catcccccgg tccccaggga 960

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gtgcccctga cctctgagga agttaagtgt cctgtcccta gccaggctat cccgtctgct1080

cagccccagg gccctgcccc caaccccttc ccctcacctg caccacaggc tctggccaac1140

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cccctccctg caccatgagt cagagccagc tggagacacg cccaggccaa agcagccacc1560

agggcctagt gggggccaga agcttcagat gagaggccca ggtattgaga ggctgagatc1620

acgggcagaa tggtcataat cgctgccagt atcagtccag ccccagggac tcagagacag1680

agaaaagagc agcacacaag gtctgggctc cccaccttct cccgtgagta cgggggagta1740

tgggggcagc caccaccccc atccccacac acccatgagg cagcctcggc tgtgtctgga1800

ctccccctcg ccctctgacc cagaaaccac cagaagaaaa gggaacttca ggaagtaagt1860

ggtgccgccg gtttcaatcc tgttcttagt ctttgcagcg tggagttcac acacctgggg1920

acctgggggc cgagctgtga tttcctagga agacaaatag cggctgacgg caggggcggg1980

gctgcccaca tgtacctcgc cagaacagga agggctgaga cccccacctc ggtgagtggg2040

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cctctcagcc aggaccaagg acagcaggtg agccgggagc agagcaggga gggtgagtgt2580

ggcagcagga caggagggtg gaagccaagg agcccagagg cagaggcagg gacaggggag2640

gcacaggggc tgggctcaga gccagctgat ggggttgggg cacctgctgg cggggagcag2700

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gaagagtcca gggaggccca gaaaggccca gagtgcagca ggcctggggc gaggggaagg2820

gctgaggctc cgtgcgttca gggaactgac ccagcagagc agaggccact gaggagctga2880

ggttccagag aggcttccag agcaggagca gtgcagggac aggaggatcc gggagctcat2940

tcaggagggg cacatgggca agggcaaggg gctctgttgg ggagacctga ctggacactg3000

gggctgctcc acagcatagg gaacacgcca agtgctgcaa aatcaaaaat gagggcagaa3060

aaacagccca aacctggaca gagggtgcca ggacaggcag gggggcaaca gtgacctgag3120

tgacattgct gcccgggttg agggagggca gagtgagcag ggagcaggca ttggagctca3180

gggaccagga ccaagcagcc acaggtgagc agggcaggtg ggggcagaag gagcaggggg3240

cacctcctgg agctcagggg accagggcag agcagcctca ggtgagcagg ggctggtggg3300

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<210>2

<211>9483

<212>DNA

<213>家牛（Bos taurus）

<400>2

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cag9483

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<212>DNA

<213>野马（Equus ferus）

<220>

<221>misc_feature

<222>(6918)..(8037)

<223>n是任何核苷酸

<400>3

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cctttactca gtgttgtaag actggcatgc aggctagaat aatggttgct cagccacttg 780

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tctataatta ggcacatgca gcatcatgag tcagatcaaa gcataggtac aacgtttgtg 960

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gcaaagcatc ttgtgactgt agtaaaagag atactcctgt catatgtgat gtacgtccct1560

tgttccaaga cggtatataa ccacgctgca cacccggctt cttcacaaca cttccttcct1620

tggtgaaggt tattgtcccg ggctatgtag tcctcaaatt ggctcaaata ataaactcac1680

cccaattttg attaacagat tgattatagt ttattgcctc aacatttcct gaccagaaat1740

tacatagatg aacgtgcttc ttatgtaacg gcagcgatgc tcacagcctg cggagcacat1800

gactgaggga ggctgccttc cgtgggagag atggcaaaac tgcgtgggcg ccatggagag1860

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cagggtccgg cccaggagtt ccgggggagc aggcagagca ggtacaggtg agcaggcgct6720

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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7020

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7080

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7140

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7200

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7260

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7320

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7380

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7440

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7500

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7560

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7620

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7680

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7740

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7800

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7920

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn7980

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngtt8040

ccagggaatc ttctacaggg agctagatag agaaagttta taggtaaagc aggtgccggt8100

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gcaggttaca ggtgagcagg cgattgtgag aagtctggaa gcggcaggtg tcttcccatg8220

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gaggggcagg gggcagccaa ggagctccag cggggtagtc agagcagcta taggtgagca8340

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gagcagaaac tggtgagcag gggccggtga gagatctgga gttgcagggg gctgcccagg8460

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aggtgagagg gctggagggg cagcgggctg cccaggagct ccaggggagc aggcagagca8640

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gtcctgccca ggagttccgg gggagcaggc agagcaggta caggtgagca ggtgctggtg8820

agaggtctgg agaggcaggg ggctgcccac gactttaggg gatgaagggc actgggcctg8880

agttaaacag agccctcaac tggtgggacc tgagggggta cagggagcag ggacagctgg8940

aggctcccag ggctcaggtc aggctggctg ggcagggagg agagttgagc tggttgagtt9000

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ccacacgggg gcctggggag gctggcaccg agaggagagg agtgccgagc gcagcgcatg9420

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ggacaagaag actcccaggg atggggtcca gtacacggat ggagtccagg gaagggacgg9720

ggtccaggac agggaaggga tgggttcagg acagggatgg ggtcgagggc aaggacaaag9780

cccaaggcat gaacagggtt caagacagga tcaggatcag gggagcgttg gggacaagta9840

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gacagcagat tagggtccat cagaagccga ccagaagcac aggtctctgg tccgggctca 10080

gactggggac tcagtcaggc gggccacctg caggaggcct gagcagggac aaggggcagg 10140

ggccccaggg ggctctaatc taggttctct gagcctgtgg ctgcagaggc accagccctg 10200

atgacaggca gccacaaggg gcatctaggc ctcagactct ctggaaacac acgggcgcag 10260

gggcaggccc tggtggtcac acgcctcctc tcttgcag 10298

<210>4

<211>9313

<212>DNA

<213>野猪（Sus scrofa）

<400>4

ggtatatata cacactagaa taccactcgg ccgtaaaaac gaaccaaata atgccattgg60

cagcaacacg gatggaacca gagactctca tactaagtga agtaagtcag aaagaccaat 120

accatacgct atcacgtaca tctggaatct aatatatggc acaaataaac ctttccacag 180

aaaagaaacc catggacttg gagaaaatac ttgtggtcgc caagggtgag gtagtggggt 240

agactgggag tttggggtta gtagatgcaa catattgcat ttggcataga taaactatga 300

gatcctgctg gagagcacag ggagctgtat ctagtccctt gtgatggaac atgttggagg 360

ataaagtgag aaaaagaaca tataaatata tacaccacac gcacacacac acacatatat 420

gaatgactgg gtcactttgc cgtagagtag aaattgacag aacacagtaa atcaactata 480

acggaaaaaa ataaaaaaca ttaaaaaaaa aaaaacagat gctcatctcc atggattctg 540

aacacatttt tgacagaatt caacacccaa ctttttcttg atgattttta ttttttccac 600

tgcaggtggt ttaccctgct ctgttgattc cactgtacag aaaagtgaca aagtcacaca 660

catatatata tgtagacatt ctttttctca cattatcctc catcatgccc catcataggt 720

gactagatag agggaaacta caccaacata ctaaaagcca tatatgacaa acccacaact 780

atcatcattc tcaatggtga aaacctgaaa gcatttccgc taagatcagg aacaagacaa 840

ggatgtctgc tctcaccact ctccttccac ggagttttgg aagtcctagc cagggcaatt 900

agagaagaaa aggaatccaa atcggaaacg gagaagtaac actaccgctc tttacaggtg 960

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atgaatttgg tcaagctgca ggatacaaaa ttaacacaca gaaattggct gccttgctct1080

acgttaacaa tgaaagagca gcgagagaaa ctagggaaac catcccactg agcagtgcct1140

cgaaatgaat gaaatgccca ggaataaacc tacccaaaga cacaaagacc tggactctga1200

aaaccataag gcactgctgg aagcaaccaa agacgacaca aaccggtgga aagctagacc1260

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cactctcagt gcaatccctc tcaaatctcc aatggcattt tccacagaac tagaacaaaa1380

aacctcaaaa atttgcatgg aaacacaaat acctcactga cctgggctat actacaaagc1440

tgcagtcatc aaaacggtat ggcactgaca ctccccccca aaaaagacat acatatcagt1500

ggaacagaac agaaagccca gcaataaacc caagcaccta tgctcaatcc atccatgaca1560

taggaggcaa gactattcaa cagagaaggg agagtcactt cactaagtgg tgctggggag1620

ctggacagct ccatgtaaag aatgaaacca gaacactccc aaacgccaaa cacaccaaaa1680

aaaaacaaaa aacaaaaaaa aaaaaataaa aaaaccctca aaacaaatga aactcctaaa1740

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tcacagcaac atcttatttg atccacctcc tggaataact acaataaaga caaaagtgga1860

gttcccgtca cggctcagtg gtaaccaaat ctgactagga accatgaggt tgcgggttca1920

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caattcgacc cctagcctgg gaacctccac atgccatggg tgcggccctg gaaaagacaa2100

aaagacgggg aaaaaatgaa agaaagaaag aaggaaagaa ggaaaggagg aaagaagaaa2160

gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaca gacagacaaa agtaaaccaa2220

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aacaggagtt cccgtcctgg ctcaggggtt aacgaatctg actagcatcc atgaggaggc2340

agatttgatc cctggcctca ctcagcaggt taaggatccg gcattgccat gagctgtgag2400

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acctaaatag acatttctcc aaagaagaca tacagatggc cagaagacac atgaaaaaat2700

cctcaacagc actaattttt agggaaatgc aaatcaaaac tgcaatgagg caccacctca2760

cactggtcag aatggccatc attaagagtc aactaacagc aaatgctgga gagggtgagg2820

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ccacatgagc cgccagggca ctgtctggac tcccccaggc cctctgggac agaaagcaac5160

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gggttcacga agaccagggg caggggcagc ggagggggga cgaggagggg agaccccaca5460

gcagggctgc agccgaccca gcccagggaa cacagcctgc acgcgggtca tgtcgcccgc5520

ccagcacagg gaccagggag ccctggcagg ggcacgccca cgccaacaga ggtggtgccc5580

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agcgcagggg acaaagaggt cacctggggt tgcagggtcc tgtcccggct gccggagccc5820

gcttgagccc cagggcaggt atgaaagcag taactgtcgg gtcccgggga aggagccagg5880

gccacgggca gcaggtgagc cgggagcaga gcaggcaggg cgggccgggc tcctgtgtgc5940

ccagagctgg cagcacaggg actgagccta aagctccaca ggccgcagga gggctgacgg6000

gagccagggg cctgagggca ggagcgggag ccaggggctg ggagctgggc gccagtgcag6060

ctgagccagc aactagaggg agccagggac cagacaggct ccaagggtgg tcgcggcgag6120

aagagggtga gctcagaagg gtcaggagcc cctccgggag gggaccaggt gggacagagg6180

ctctgccagg gggacgctac ccagagaggg tgggcaccca gggctccggg aacaaaggcc6240

agccctggga aagaaaggaa gccaggagtg gagctagaca aggctgaggg ttcgggggca6300

ggaagagggg tggtgacact gaggcccagg agccccaggg aaaggggcag gtaggctgca6360

ggtgagcagg gaaccgggag ggcggaaaag ctgtccttag agctgctggg aacacataga6420

gctggtgcag gtgaggaggg gttgggaggg caagggggct gaacctgaag ctcctcggaa6480

ctggtagagc ttgtgcagat gagcaggggc tgggagggca gggggcagcc ctgggaccac6540

ctgagagctg tagatcttgg gcaggtgagc acaaactggt agggcagggg aagaacctgc6600

agttcctggg agcaggagga gcttgtgcag gtgagcaggg gctggagggc agggggctaa6660

acctggagct attgggaaga ggttaggctt gtgcaggcga gcagggggtg ggagggcgag6720

ggtcagtcct gggagccctt tcgagccaat agagcccagg caggtgagca ggggcttggc6780

gggcagggag catccctggg atgagtttgt gcaggtgagc agggggtggg agtgtaggga6840

gcagtcctag caactcctgg gagctggtag agcttgggca ggtgaacagg ggctggaagt6900

gcagggggca catctgggag gccctgggag caattagcgc tctggcaggt gagtaggggc6960

tcggagggca gggagcagcc ctgggagctc cttggagcag gtagagcttg ggcaggtgag7020

cagggggtgg gagggcaggg ggcagtccta gcaactcctg ggagcttgta gagcttgggc7080

aggtgagaac gagctggtag ggcaggggaa tgaacctgga gttactgggt caggaggagc7140

atgtgcaggt gagcaggggc tggagggcag ggggctaaac ctggagctat tgggaagagg7200

ttaggcttgt gcaggcaagc agggggtggg agagcaaggg tcagtcctgg gagcccttgc7260

gagccggtag agcccaggca ggtgagcagg ggctgggcgg gcagggagca gtcctagcaa7320

ctcctgggag caggtagagc ttgtgcaggt gagcaggggg tgggagggta gggagcagtc7380

ctgggaactc ctgcgagcag gtagagcttg tgcaggtggg caggggtggg agggcagggg7440

gctgaacctg gagctcctca gaactggtag agcttgtgca gatgagcagt ggctgggagg7500

gcagggggca gccctgggag caatagacct tgggcaggtg agaacgagct ggtagggcag7560

tggaatgaac ctggagttac tgggtcaaga agagcttgtg caggcaagca ggggctgaag7620

ggcagggggc taaacctgga gctattggga agaggttagg cttgtgcagg cgagcagggg7680

gtgggagggc aagggtcagt cctgggagcc cttgcgagcc ggtagagccc aggcaggtga7740

gcaggggctg ggagggcagg gagcatccct gggacctctt gggagcaggt agagcttgtg7800

caggtgagca gggggtggga gggtagggag ccgtcctagc aactcctgaa tctggtagag7860

cttgcggagg tgaacagggg ctgggagtgc agggggcagt cctgggagcc cctgggagta7920

attagagctt gggcaggtga gcaggagctt ggagtctagg gggctaaact ggagctattg7980

ggaagagttt aggcttgttc aggtgagcaa ggggtgggag tagagggggc attcctagga8040

gctcccgcga gttggtcaat ctcgggcagg taagcagggg ctcagaggcc tggagcagcc8100

ctgggaccat ctgggagcag ggcgagcttg ggcaggtgag ccgggccagg ggggatgcag8160

gacagggcag gggcaacaga gtgggggtga gctcagggga gccccaggct cgagggaggg8220

gccgatatag ggctagccag gctggaaagt gggctcctgg ggggaaggtc cccaggactg8280

cgggggcagg ggcagggctg aacagacgcc atgggtcaca gggatcgggc caacgggcca8340

taccctgttc cagcaaagtg agtggacatg ggacagagca gctggagtcc taagtgagaa8400

cagcggcaca gggcagtgca catggtcggg gggtcgaggg gctcatctgg gcctgagctg8460

gggaagcagg caatggctga acagaacagg ggggagagga ccggcccaac cgggcagggg8520

cgcatggggt gctggcgccc cgtgggagag gaaggccagg ggcagggctc ggctgcagca8580

gtgctgccag gcaggctggc agcgggaagg gcaggagcag agggagggct ctggcctcag8640

caggcagctg ggaggcccag agctgggctg caggggccgg ggctctgggg aaagctgcct8700

cgggtgagct cagggccaag ccaggagccc cggtggagga gggaccggtg ggcccagagg8760

cccagatttg gagcctgggc cagggccgga gggatggcag gggaggggcc tcggaggaga8820

ctacctgccc tcgcccaggg aaaggggcat gttggtgcca gggaccaacg cgcacgggcc8880

ttgactgcag agctgaccca gaggaacggg gcctggagag caaacagcag gccaggacca8940

ggggccagga gcagagcatg ggcagtgggt ggcagtgggt ggcagtgtcc ctgccaggct9000

ggggaagcag gacggtggcc tcaggggacc agcagaagct ggccaggaac acaggccacc9060

cgctggtcgg gccaggcacc cacaggggct ctgggccctg gcgggctctc atccaggcgg9120

tcacccagct ctgaccaggc agctgcgccc agaacctgca gctgcaatgg cagcgagctg9180

ggcggctggt ctgccgactt tctggaagca agtgggtgct gggcgcagcg gccccgctgt9240

tctgagggcc cgattcgctg cccgccccac aaggaacaag gccctggcgg tcacgcagcc9300

tcctctcttc cag 9313

<210>5

<211>337

<212>DNA

<213>家牛（Bos taurus）

<400>5

tccactaggg tggccaggca cagtcaccag agggggaggg ctcgggtgca ggggtgcggg60

agggtggggg aggcagcggt gtttgtgtcc tcttgttttt ctctttcttc tcaagccccc 120

tgcacctcat cacctgctga aacatccaaa atagctctag gtggctactg agtcattgcg 180

agcacagccc aacccaggtg tcccagccag gctgctcttc tgagaatcgg gccccaaaac 240

cgagacctgg ccaggtgggc ctggggcctg ggcccggggc caaagcccag gggagtccta 300

cgggggcagt gagttcccca aggcctggag agggccc337

<210>6

<211>246

<212>DNA

<213>家牛（Bos taurus）

<400>6

ccccaccccc taggcaggtg cgaggccctc tcagtttccc ccaggttact catttggggc60

acactcagcc ttgcagggca tgcaaatggc tgtttgttcc acactgaaaa acatgtctaa 120

gcctctgtgg ttatttccag aaatagccta cgcccacgcc ccacctgcag ccccagctct 180

gaccctccag agtgccaggc tggcctggag ctcaggattc gggggaccct gcaccccctg 240

ccccag246

<210>7

<211>145

<212>PRT

<213>智人（Homo sapiens）

<400>7

Met Ser Trp Ala Pro Val Leu Leu Met Leu Phe Val Tyr Cys Thr Gly

1 5 1015

Cys Gly Pro Gln Pro Val Leu His Gln Pro Pro Ala Met Ser Ser Ala

202530

Leu Gly Thr Thr Ile Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Asn Asp His Asp

354045

Ile Gly Val Tyr Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Pro

505560

Pro Arg Phe Leu Leu Arg Tyr Phe Ser Gln Ser Asp Lys Ser Gln Gly

65707580

Pro Gln Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ala Arg Asn

859095

Arg Gly Tyr Leu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Met Gly Ala Arg Ser Ser Glu Lys Glu Glu Arg Glu

115 120 125

Arg Glu Trp Glu Glu Glu Met Glu Pro Thr Ala Ala Arg Thr Arg Val

130 135 140

Pro

145

<210>8

<211>123

<212>PRT

<213>智人（Homo sapiens）

<400>8

Met Ala Cys Arg Cys Leu Ser Phe Leu Leu Met Gly Thr Phe Leu Ser

1 5 1015

Val Ser Gln Thr Val Leu Ala Gln Leu Asp Ala Leu Leu Val Phe Pro

202530

Gly Gln Val Ala Gln Leu Ser Cys Thr Leu Ser Pro Gln His Val Thr

354045

Ile Arg Asp Tyr Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Gly Ser Ala

505560

Pro Arg Tyr Leu Leu Tyr Tyr Arg Ser Glu Glu Asp His His Arg Pro

65707580

Ala Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ala Lys Asp Glu Ala His Asn

859095

Ala Cys Val Leu Thr Ile Ser Pro Val Gln Pro Glu Asp Asp Ala Asp

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ser Val Gly Tyr Gly Phe Ser Pro

115 120

<210>9

<211>177

<212>DNA

<213>智人（Homo sapiens）

<400>9

gtcacatctg gactccccca ggccctctga gacagaaaac actcagaaga aaagggaact60

tcaggaagca agtcgcgtca ccaggtttca ttcctgttct tagtcttcac agcactgggg 120

gaagggccct cacgcctcct gggactggtg accaagtccc agggagcagg gctgcag177

<210>10

<211>476

<212>PRT

<213>家牛（Bos taurus）

<400>10

Glu Gly Glu Ser His Pro Arg Val Phe Pro Leu Val Ser Cys Val Ser

1 5 1015

Ser Pro Ser Asp Glu Ser Thr Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Arg Asp

202530

Phe Val Pro Asn Ser Val Ser Phe Ser Trp Lys Phe Asn Asn Ser Thr

354045

Val Ser Ser Glu Arg Phe Trp Thr Phe Pro Glu Val Leu Arg Asp Gly

505560

Leu Trp Ser Ala Ser Ser Gln Val Val Leu Pro Ser Ser Ser Ala Phe

65707580

Gln Gly Pro Asp Asp Tyr Leu Val Cys Glu Val Gln His Pro Lys Gly

859095

Gly Lys Thr Val Gly Thr Val Arg Val Ile Ala Thr Lys Ala Glu Val

100 105 110

Leu Ser Pro Val Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asn Ser Leu Ser

115 120 125

Gly Asp Gly Asn Ser Lys Ser Ser Leu Ile Cys Gln Ala Thr Asp Phe

130 135 140

Ser Pro Lys Gln Ile Ser Leu Ser Trp Phe Arg Asp Gly Lys Arg Ile

145 150 155 160

Val Ser Gly Ile Ser Glu Gly Gln Val Glu Thr Val Gln Ser Ser Pro

165 170 175

Ile Thr Phe Arg Ala Tyr Ser Met Leu Thr Ile Thr Glu Arg Asp Trp

180 185 190

Leu Ser Gln Asn Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Asn Lys Glu Thr

195 200 205

Phe Gln Lys Asn Val Ser Ser Ser Cys Asp Val Ala Pro Pro Ser Pro

210 215 220

Ile Gly Val Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Leu Thr

225 230 235 240

Lys Ser Ala Lys Leu Ser Cys Leu Val Thr Asn Leu Ala Ser Tyr Asp

245 250 255

Gly Leu Asn Ile Ser Trp Ser Arg Gln Asn Gly Lys Ala Leu Glu Thr

260 265 270

His Thr Tyr Phe Glu Arg His Leu Asn Asp Thr Phe Ser Ala Arg Gly

275 280 285

Glu Ala Ser Val Cys Ser Glu Asp Trp Glu Ser Gly Glu Glu Phe Thr

290 295 300

Cys Thr Val Ala His Ser Asp Leu Pro Phe Pro Glu Lys Asn Ala Val

305 310 315 320

Ser Lys Pro Lys Asp Val Ala Met Lys Pro Pro Ser Val Tyr Leu Leu

325 330 335

Pro Pro Thr Arg Glu Gln Leu Ser Leu Arg Glu Ser Ala Ser Val Thr

340 345 350

Cys Leu Val Lys Gly Phe Ala Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Leu

355 360 365

Gln Arg Gly Glu Pro Val Thr Lys Ser Lys Tyr Val Thr Ser Ser Pro

370 375 380

Ala Pro Glu Pro Gln Asp Pro Ser Val Tyr Phe Val His Ser Ile Leu

385 390 395 400

Thr Val Ala Glu Glu Asp Trp Ser Lys Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val

405 410 415

Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Met Val Thr Glu Arg Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Glu Glu Glu Gly Phe Glu Asn

435 440 445

Leu Asn Thr Met Ala Ser Thr Phe Ile Val Leu Phe Leu Leu Ser Leu

450 455 460

Phe Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe Lys Val Lys

465 470 475

<210>11

<211>471

<212>PRT

<213>野马（Equus ferus）

<400>11

Glu Ser Thr Lys Thr Pro Asp Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Gly Pro

1 5 1015

Ser Leu Asp Glu Ser Leu Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe

202530

Leu Pro Asn Val Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Val

354045

Val Arg Ser Gln Asp Ile Lys Asn Phe Pro Ser Val Leu Arg Glu Gly

505560

Lys Tyr Thr Ala Ser Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Gly Asp Val Pro

65707580

Leu Val Cys Thr Val Asn His Ser Asn Gly Asn Lys Lys Val Glu Val

859095

Arg Pro Gln Val Leu Ile Gln Asp Glu Ser Pro Asn Val Thr Val Phe

100 105 110

Ile Pro Pro Arg Asp Ala Phe Thr Gly Pro Gly Gln Arg Thr Ser Arg

115 120 125

Leu Val Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Lys Glu Ile Ser Val Ser

130 135 140

Trp Leu Arg Asp Gly Lys Pro Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Glu Glu

145 150 155 160

Val Gln Pro Gln Asn Lys Glu Ser Trp Pro Val Thr Tyr Lys Val Thr

165 170 175

Ser Met Leu Thr Ile Thr Glu Ser Asp Trp Leu Asn Gln Lys Val Phe

180 185 190

Thr Cys His Val Glu His Gln Gln Gly Val Phe Gln Lys Asn Val Ser

195 200 205

Ser Met Cys Ser Pro Asn Ser Pro Val Pro Ile Lys Ile Phe Ala Ile

210 215 220

Pro Pro Ser Phe Ala Gly Ile Phe Leu Thr Lys Ser Ala Lys Leu Ser

225 230 235 240

Cys Gln Val Thr Asn Leu Gly Thr Tyr Asp Ser Leu Ser Ile Ser Trp

245 250 255

Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ile Leu Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu

260 265 270

Ser His Pro Asn Gly Thr Phe Ser Ala Leu Gly Glu Ala Thr Ile Cys

275 280 285

Val Glu Asp Trp Glu Ser Gly Asp Asp Tyr Ile Cys Thr Val Thr His

290 295 300

Thr Asp Leu Pro Phe Pro Leu Lys Gln Ala Ile Ser Arg Pro Asp Ala

305 310 315 320

Val Ala Lys His Pro Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Thr Arg Glu

325 330 335

Gln Leu Ser Leu Arg Glu Ser Ala Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly

340 345 350

Phe Ser Pro Pro Asp Val Phe Val Gln Trp Leu Gln Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Leu Ser Ser Asp Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln

370 375 380

Ala Pro Gly Leu Tyr Phe Val His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu

385 390 395 400

Asp Trp Ser Ser Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala

405 410 415

Leu Pro His Val Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Glu Gly

420 425 430

Glu Val Ser Ala Glu Glu Glu Gly Phe Glu Asn Leu Ser Ala Met Ala

435 440 445

Ser Thr Phe Ile Val Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Thr

450 455 460

Val Thr Leu Phe Lys Val Lys

465 470

<210>12

<211>476

<212>PRT

<213>绵羊（Ovis aries）

<400>12

Glu Ser Glu Ser His Pro Lys Val Phe Pro Leu Val Ser Cys Val Ser

1 5 1015

Ser Pro Ser Asp Glu Asn Thr Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Arg Asp

202530

Phe Val Pro Asn Ser Val Ser Phe Ser Trp Lys Phe Asn Asn Ser Thr

354045

Val Ser Ser Glu Arg Phe Trp Thr Phe Pro Glu Val Leu Arg Asp Gly

505560

Leu Trp Ser Ala Ser Ser Gln Val Ala Leu His Ser Ser Ser Thr Phe

65707580

Gln Gly Thr Asp Gly Tyr Leu Val Cys Glu Val Gln His Pro Lys Gly

859095

Gly Lys Thr Val Gly Thr Val Met Val Val Ala Pro Lys Val Glu Val

100 105 110

Leu Ser Pro Val Val Ser Val Phe Val Pro Pro Cys Asn Ser Leu Ser

115 120 125

Gly Asn Gly Asn Ser Lys Ser Ser Leu Ile Cys Gln Ala Thr Asp Phe

130 135 140

Ser Pro Lys Gln Ile Ser Leu Ser Trp Phe Arg Asp Gly Lys Arg Ile

145 150 155 160

Val Ser Asp Ile Ser Glu Gly Gln Val Glu Thr Val Gln Ser Ser Pro

165 170 175

Thr Thr Tyr Arg Ala Tyr Ser Val Leu Thr Ile Thr Glu Arg Glu Trp

180 185 190

Leu Ser Gln Ser Ala Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Asn Lys Glu Thr

195 200 205

Phe Gln Lys Asn Ala Ser Ser Ser Cys Asp Ala Thr Pro Pro Ser Pro

210 215 220

Ile Gly Val Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Leu Thr

225 230 235 240

Lys Ser Ala Lys Leu Ser Cys Leu Val Thr Asn Leu Ala Ser Tyr Asp

245 250 255

Gly Leu Asn Ile Ser Trp Ser His Gln Asn Gly Lys Ala Leu Glu Thr

260 265 270

His Thr Tyr Phe Glu Arg His Leu Asn Asp Thr Phe Ser Ala Arg Gly

275 280 285

Glu Ala Ser Val Cys Ser Glu Asp Trp Glu Ser Gly Glu Glu Tyr Thr

290 295 300

Cys Thr Val Ala His Leu Asp Leu Pro Phe Pro Glu Lys Ser Ala Ile

305 310 315 320

Ser Lys Pro Lys Asp Val Ala Met Lys Pro Pro Ser Val Tyr Val Leu

325 330 335

Pro Pro Thr Arg Glu Gln Leu Ser Leu Arg Glu Ser Ala Ser Val Thr

340 345 350

Cys Leu Val Lys Gly Phe Ala Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Leu

355 360 365

Gln Lys Gly Glu Pro Val Ala Lys Ser Lys Tyr Val Thr Ser Ser Pro

370 375 380

Ala Pro Glu Pro Gln Asp Pro Ser Ala Tyr Phe Val His Ser Ile Leu

385 390 395 400

Thr Val Thr Glu Glu Asp Trp Ser Lys Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val

405 410 415

Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Met Val Thr Glu Arg Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Glu Glu Glu Gly Phe Glu Asn

435 440 445

Leu Asn Thr Met Ala Ser Thr Phe Ile Val Leu Phe Leu Leu Ser Leu

450 455 460

Phe Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe Lys Val Lys

465 470 475

<210>13

<211>477

<212>PRT

<213>野猪（Sus scrofa）

<400>13

Glu Ser Gln Ser Ala Pro Asn Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Val Ser

1 5 1015

Pro Pro Ser Asp Glu Ser Leu Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Arg Asp

202530

Phe Leu Pro Ser Ser Val Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Lys Asn Ser Ser

354045

Lys Val Ser Ser Gln Asn Ile Gln Asp Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly

505560

Gly Lys Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Val Leu Leu Pro Ser Val Ser Ile

65707580

Pro Gln Asp Pro Glu Ala Phe Leu Val Cys Glu Val Gln His Pro Ser

859095

Gly Thr Lys Ser Val Ser Ile Ser Gly Pro Val Val Glu Glu Gln Pro

100 105 110

Pro Val Leu Asn Ile Phe Val Pro Thr Arg Glu Ser Phe Ser Ser Thr

115 120 125

Pro Gln Arg Thr Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Ser Asp Phe Ser Pro

130 135 140

Lys Gln Ile Ser Met Ala Trp Phe Arg Asp Gly Lys Arg Val Val Ser

145 150 155 160

Gly Val Ser Thr Gly Pro Val Glu Thr Leu Gln Ser Ser Pro Val Thr

165 170 175

Tyr Arg Leu His Ser Met Leu Thr Val Thr Glu Ser Glu Trp Leu Ser

180 185 190

Gln Ser Val Phe Thr Cys Gln Val Glu His Lys Gly Leu Asn Tyr Glu

195 200 205

Lys Asn Ala Ser Ser Leu Cys Thr Ser Asn Pro Asn Ser Pro Ile Thr

210 215 220

Val Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Ala Gly Ile Phe Leu Thr Lys Ser

225 230 235 240

Ala Lys Leu Ser Cys Leu Val Thr Gly Leu Val Thr Arg Glu Ser Leu

245 250 255

Asn Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asp Gly Glu Val Leu Lys Thr Ser Ile

260 265 270

Val Phe Ser Glu Ile Tyr Ala Asn Gly Thr Phe Gly Ala Arg Gly Glu

275 280 285

Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp Glu Ser Gly Asp Arg Phe Thr Cys

290 295 300

Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Ser Val Ser

305 310 315 320

Lys Pro Arg Gly Ile Ala Arg His Met Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro

325 330 335

Pro Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Gln Glu Trp Ala Ser Val Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Leu Gln

355 360 365

Lys Gly Glu Pro Val Ser Ala Asp Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Val

370 375 380

Pro Glu Pro Glu Pro Lys Ala Pro Ala Ser Tyr Phe Val Gln Ser Val

385 390 395 400

Leu Thr Val Ser Ala Lys Asp Trp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Thr Cys

405 410 415

Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Thr Val Thr Glu Arg Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Glu Glu Glu Gly Phe Glu

435 440 445

Asn Leu Asn Thr Met Ala Ser Thr Phe Ile Val Leu Phe Leu Leu Ser

450 455 460

Leu Phe Tyr Ser Thr Thr Val Thr Leu Phe Lys Val Lys

465 470 475

<210>14

<211>471

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合IgM

<400>14

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 1015

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

202530

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

354045

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

505560

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65707580

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

859095

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

100 105 110

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

145 150 155 160

Thr Asp Gln Val Glu Thr Val Gln Ser Ser Pro Ile Thr Phe Arg Ala

165 170 175

Tyr Ser Met Leu Thr Ile Thr Glu Arg Asp Trp Leu Ser Gln Asn Val

180 185 190

Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Asn Lys Glu Thr Phe Gln Lys Asn Val

195 200 205

Ser Ser Ser Cys Asp Val Ala Pro Pro Ser Pro Ile Gly Val Phe Thr

210 215 220

Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Leu Thr Lys Ser Ala Lys Leu

225 230 235 240

Ser Cys Leu Val Thr Asn Leu Ala Ser Tyr Asp Gly Leu Asn Ile Ser

245 250 255

Trp Ser Arg Gln Asn Gly Lys Ala Leu Glu Thr His Thr Tyr Phe Glu

260 265 270

Arg His Leu Asn Asp Thr Phe Ser Ala Arg Gly Glu Ala Ser Val Cys

275 280 285

Ser Glu Asp Trp Glu Ser Gly Glu Glu Phe Thr Cys Thr Val Ala His

290 295 300

Ser Asp Leu Pro Phe Pro Glu Lys Asn Ala Val Ser Lys Pro Lys Asp

305 310 315 320

Val Ala Met Lys Pro Pro Ser Val Tyr Leu Leu Pro Pro Thr Arg Glu

325 330 335

Gln Leu Ser Leu Arg Glu Ser Ala Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Glu Pro

355 360 365

Val Thr Lys Ser Lys Tyr Val Thr Ser Ser Pro Ala Pro Glu Pro Gln

370 375 380

Asp Pro Ser Val Tyr Phe Val His Ser Ile Leu Thr Val Ala Glu Glu

385 390 395 400

Asp Trp Ser Lys Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala

405 410 415

Leu Pro His Met Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Glu Gly

420 425 430

Glu Val Ser Ala Glu Glu Glu Gly Phe Glu Asn Leu Asn Thr Met Ala

435 440 445

Ser Thr Phe Ile Val Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Tyr Ser Thr Thr

450 455 460

Val Thr Leu Phe Lys Val Lys

465 470

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

gaccccaaaa tcagcgaaat20

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

tctggttact gccagttgaa tctg 24

<210>17

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>经修饰的ZEN探针序列

<400>17

Thr Ala Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys

1 5 1015

<210>18

<211>4

<212>PRT

<213>严重急性呼吸综合征冠状病毒2

<400>18

Arg Arg Ala Arg

1