低共熔溶剂及其应用、含有小檗碱的提取物及其应用

技术领域

本发明涉及中药原料提取技术领域，具体而言，涉及低共熔溶剂及其应用、含有小檗碱的提取物及其应用。

背景技术

防腐剂是化妆品安全性的重要组成部分，其保证化妆品在生产、储存、运输以及使用的过程中不易受到微生物的污染而变质。目前化妆品中使用频率较高的是化学合成来源的防腐剂，例如尼泊金酯类、苯氧乙醇等。化学合成来源的防腐剂在抗菌方面有显著的效果。然而，经研究发现，部分化学合成的防腐剂是导致人体皮肤产生刺激，发炎、过敏以及诱发癌症等的重要因素之一，具有一定的安全风险。因此，安全有效和天然来源的防腐剂更加符合人们对健康的追求，已成为化妆品研究的热点。对于产品的天然、安全及温和的呼声越来越高，天然来源及植物的原料及防腐剂的需求也会越来越大对其的研究也会更加的深入。同时很多植物还有一定的药用功效，可以进一步开发其他的应用价值。

其中，小檗碱不仅仅可以作为防腐原料，其自身也具有相应的护肤功效，继而可以用于护肤品中。目前，目前，工业上常用的提取小檗碱或其盐的方法有以下几个方法：(1)酸水法，但由于此法使用了酸水，因此存在腐蚀设备、易造成污染的问题。(2)乙醇为溶剂的进行提取，此法克服了酸水法的缺点，具有溶剂可回收反复使用、不腐蚀设备的特点。但是在提取率相当的情况下，乙醇流浸提法得到的产品纯度较低，即便是采用超声波辅助萃取也是同样的结果，因此限制了有机溶剂提取法的应用。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供低共熔溶剂及其应用、含有小檗碱的提取物及其应用。本发明实施例提供一种低共熔溶剂，其能够小檗碱有良好的溶解性，能够有效将其从中药原料中溶出，继而提升小檗碱的提取收率和纯度。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种低共熔溶剂，所述低共熔溶剂用于制备小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物，其由氢氧化胆碱和顺丁烯二酸组成，其中，所述氢氧化胆碱和所述顺丁烯二酸的摩尔比为(2-4):1。

在可选的实施方式中，所述氢氧化胆碱和所述顺丁烯二酸的摩尔比为(2-3.5)：1。

第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的低共熔溶剂在制备小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物中的应用。

在可选的实施方式中，所述制备包括利用所述低共熔溶剂对含有小檗碱或其盐的中药原料进行提取；

优选地，所述中药原料选自黄连。

第三方面，本发明提供一种小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物的制备方法，包括：利用前述实施方式所述的低共熔溶剂对含有小檗碱或其盐的中药原料进行提取。

在可选的实施方式中，将所述低共熔溶剂与所述中药原料混合并在40-60℃的条件下提取3.5-6.5h；

优选地，提取后进行后处理；

优选地，后处理包括：对提取混合液进行抽滤，而后调节滤液的pH至中性，再过滤，并将滤渣洗涤至中性，而后烘干；

优选地，每克所述中药原料对应10-30ml所述低共熔溶剂；

优选地，所述中药原料选自黄连。

第四方面，本发明提供一种小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物，其通过前述实施方式所述的小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物的制备方法制备得到。

第五方面，本发明提供一种纳米乳，其原料包括水、乳化剂、助乳化剂、稳定剂、柔润剂、助渗剂和前述实施方式所述的小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物。

在可选的实施方式中，以质量百分比计，所述原料包括7-15％乳化剂、3-8％助乳化剂、6-10％稳定剂、6.5-9.5％柔润剂、0.5-1.5％助渗剂、1-2.5％小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物，其余量为水；

优选地，以质量百分比计，所述原料包括7-15％蓖麻油、3-8％山梨坦油酸酯、6-10％丙二醇、6.5-9.5％辛酸/癸酸甘油三酯、0.5-1.5％角鲨烷、1-2.5％小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物，其余量为水。

第六方面，本发明提供一种防腐剂，其原料包括前述实施方式所述的小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物或前述实施方式所述的纳米乳。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过特定地选择氢氧化胆碱和顺丁烯二酸，并限定其配比形成一种新的低共熔溶剂，该低共熔溶剂能够对中药原料中的小檗碱进行有效的提取，提升含有小檗碱的提取物的收率，并提升提取物中小檗碱的含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例5提供的提取物的HPLC结果图；

图2为本发明实施例6提供的提取物的HPLC结果图；

图3为本发明实施例7提供的提取物的HPLC结果图；

图4为本发明实施例8提供的提取物的HPLC结果图；

图5为本发明对比例1提供的提取物的HPLC结果图；

图6为本发明对比例2提供的提取物的HPLC结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种低共熔溶剂，该低共熔溶剂可以用于对含有小檗碱的中药原料进行提取，继而得到小檗碱或其盐或者是含有小檗碱的提取物。具体地，该低共熔溶剂由氢氧化胆碱和顺丁烯二酸组成，其中，所述氢氧化胆碱和所述顺丁烯二酸的摩尔比为(2-4):1，例如2:1、2.5:1、3:1、3.5:1以及4:1等2-4:1之间的任意数值或者任意两个数值之间的范围值，例如优选为(2-3.5)：1。

上述低共熔溶剂的制备，也就是将物料混合搅拌得到澄清均一的液体。搅拌的温度可以是常温-60℃均可。

本发明实施例特定地采用上述原料进行组合物形成的氢氧化胆碱和顺丁烯二酸能有效对中药原料中的小檗碱进行提取，提升提取率和提取物中小檗碱的含量。

因此，本发明提供一种前述实施方式所述的低共熔溶剂在制备小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物中的应用。其中，制备包括利用所述低共熔溶剂对含有小檗碱或其盐的中药原料进行提取；例如，所述中药原料包括但不限于黄连。可以理解的是，也可以选择其他含有小檗碱的中药原料。

具体地，本发明提供一种小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物的制备方法，包括：

将上述低共熔溶剂与中药原料混合，其中，每克所述中药原料对应10-30ml所述低共熔溶剂；例如1克中药原料对应10ml、15ml、20ml、25ml以及30ml等10-30ml之间的任意数值或者任意两个数值之间的范围值。

而后在40-60℃的条件下提取3.5-6.5h。例如温度为40℃、43℃、45℃、47℃、50℃、51℃、54℃、55℃、58℃以及60℃等40-60℃之间的任意数值或任意两个数值之间的范围值。时间为3.5h、4h、4.5h、5h、6h以及6.5h等3.5-6.5h之间的任意数值。

而后进行抽滤，去除提取混合物中的中药原料，接着调节滤液的pH至中性，6.5-7.5，而后再过滤收集滤渣，并对滤渣进行洗涤至中性，而后烘干得到所需的提取物。

若要得到纯净的小檗碱可以再对提取物进行纯化处理，纯化的方法可以选择现有技术中已知的纯化方法，例如柱层析、结晶、萃取等。

本发明实施例还提供一种纳米乳，该纳米乳的原料包括上述制备得到的小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物。具体地，形成纳米乳的原料还包括水、乳化剂、助乳化剂、柔润剂、稳定剂和助渗剂。

更具体地，以质量百分比计，所述原料包括7-15％乳化剂、3-8％助乳化剂、6-10％稳定剂、6.5-9.5％柔润剂、0.5-1.5％助渗剂、1-2.5％小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物，其余量为水；例如原料包括7-15％蓖麻油、3-8％山梨坦油酸酯、6-10％丙二醇、6.5-9.5％辛酸/癸酸甘油三酯、0.5-1.5％角鲨烷、1-2.5％小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物，其余量为水。

蓖麻油包括但不限于PEG-40蓖麻油。

上述纳米乳的制备为现有已知的纳米乳的制备方法，因此，本发明实施例不再进行详述。

进一步地，本发明提供一种防腐剂，其原料包括前述实施方式所述的小檗碱、其盐或含有小檗碱的提取物或前述实施方式所述的纳米乳。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种低共熔溶剂，其由氢氧化胆碱和顺丁烯二酸组成，其中氢氧化胆碱和顺丁烯二酸的摩尔比为2:1。

该低共熔溶剂的制备方法包括：

按配比将上述物料加入烧杯中，用磁力加热搅拌器在60℃下搅拌为澄清均一的液体，即得制备好的低共熔溶剂。

实施例2-4以及对比例1-15

实施例2-4和对比例1-15分别提供一种低共熔溶剂，区别仅在于原料或其配比有所不同，具体参见表1，其制备方法与实施例1一致。

表1低共熔溶剂的配方

检测例1

对上述实施例1-4以及对比例1-15制备得到的低共熔溶剂进行检测，分别依次观察上述低共熔溶剂在常温(25℃)放置24小时，在0℃放置24小时以及在40-50℃条件下旋蒸60分钟后的状态，并记录其变化。具体参见表2。

表2低共熔溶剂的检测结果

可见，本发明实施例提供的低共熔溶剂分别在上述低共熔溶剂在常温(25℃)放置24小时，在0℃放置24小时以及在40-50℃条件下旋蒸60分钟处理后，依然保持为黄色透明液体，其他对比例要么在常温放置时，便有固体分析，要么是在低温放置有固体析出，要么旋蒸时，立刻会有固体析出，这些对比例的低共熔溶剂都失败，不能作为提取小檗碱的提取剂。而顺丁烯二酸：氢氧化胆碱的摩尔比在1:2至1:4时，可以制备成低共熔溶剂；顺丁烯二酸：氢氧化胆碱的摩尔比为1：3时，制备得到的低共熔溶剂流动性最佳，液体呈均质透明状态，有利于该低共熔溶剂制备得到的盐酸小檗碱收率更高。

实施例5

本实施例提供一种含有小檗碱的提取物的制备方法，包括：

1)将黄连清洗干净后粉碎，得到黄连粉末。

2)在平底烧瓶(100mL)中加入20mL实施例1的低共熔溶剂和黄连粉末(1.0g)，随后将样品放入反应器，在50℃下反应提取4-6h。反应结束后，进行抽滤，滤液调PH,用无水乙醇和蒸馏水将提取残渣洗至中性，放入40℃烘箱中烘干，收集留作成分分析。

实施例6-8

实施例6-8分别提供一种含有小檗碱的提取物的制备方法，与实施例5提供的制备方法一致，区别仅在于将实施例1的低共熔溶剂更改为对应实施例2-4的低共熔溶剂。

对比例1：本对比例提供一种含有小檗碱的提取物的制备方法：称取10g磨细的中药黄连至250mL圆底烧瓶中,加100mL乙醇后,置超声波清洗器中,在20kHz功率下、恒温60℃超声萃取30min。(下文也称为醇提)。

对比例2：本对比例提供一种含有小檗碱的提取物的制备方法：黄连20g，加入200ml水，煎煮20分钟，过滤，静置放冷，无沉淀析出。向滤液中加入4％ NaCl，有黄色沉淀析出，抽滤，漂白水试验为樱红色，确定为盐酸小檗碱，水重结晶精制，烘干，得盐酸小檗碱精品。(下文也称为水提)。

检测例2

利用HPLC检测上述实施例5-8以及对比例1-2制备得到的提取物的小檗碱的含量，具体如下：

色谱柱:Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相:乙腈∶0.02moL·L

对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品1.25mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得浓度为0.125mg·mL

结果参见表3以及图1-6。

表3不同方式提取黄连的结果

需要说明的是，上述盐酸小檗碱的含量指的是每克提取物中盐酸小檗碱的含量。

检测例3

检测上述实施例6、实施例7以及对比例1-2制备得到的提取物以及阳性对照物质的抑菌效果。具体如下：

(1)金黄色葡萄球菌牛津杯法试验

取活化好的第三代金黄色葡萄球菌培养基斜面新鲜培养物，加入5mL无菌生理盐水配置成10

其中，实验样品为上述提取物以及阳性对照0.5g分别定容至100mL的纯化水得到的浓度为5mg/mL的待测样品。阳性对照药物为苯氧乙醇，苯氧乙醇水溶液浓度为0.5％。

结果参见表4。

表4金黄色葡萄球菌抑菌结果

可见，抑菌效果为：实施例6＞实施例7＞醇提＞水提＞阳性结果，说明本发明实施例的提取物的抑菌效果优异。

(2)马拉色菌牛津杯法试验

取活化好的第三代糠秕马拉色菌培养基斜面新鲜培养物，加入5mL无菌生理盐水配置成10

其中，实验样品为上述提取物以及阳性对照0.5g分别定容至100mL的纯化水得到的浓度为5mg/mL的待测样品。阳性对照药物为OCT。

结果参见表5。

表5马拉色菌抑菌结果

可见，抑菌效果为：实施例6＞实施例7＞醇提＞阳性结果＞水提，说明本发明实施例的提取物的抑菌效果优异。

(3)白色念珠菌牛津杯法试验

取活化好的第三代白色念珠菌培养基斜面新鲜培养物，加入5mL无菌生理盐水配置成10

其中，实验样品为上述提取物以及阳性对照0.5g分别定容至100mL的纯化水得到的浓度为5mg/mL的待测样品。阳性对照为OCT。

结果参见表6。

表6白色念珠菌的抑菌结果

可见，抑菌效果为：实施例6＞实施例7＞阳性结果＞醇提＞水提，说明本发明实施例的提取物的抑菌效果优异。

实施例9-实施例11

实施例9-11分别提供一种纳米乳，纳米乳的成分如下：油相辛酸/癸酸甘油三酯和角鲨烷在体系中占比为9.5％，山梨坦油酸酯与PEG-40蓖麻油为混合表面活性剂15％，助表面活性剂丙二醇为8％，实施例或对比例样品为1.5％，其余为水相占比。具体参见表7。

表7纳米乳的成分

该纳米乳的制备方法如下：室温下，将PEG-40蓖麻油和山梨坦油酸酯混匀作为复配乳化剂，加入助乳化剂丙二醇混匀，再加入油相辛酸/癸酸甘油三酯与角鲨烷，置于磁力搅拌器上，制备三份，并在三份中以400r/min的转速搅拌均匀后缓慢分别滴加含有相同含量的(实施例1、实施例2和实施例4)防腐剂的纯化水，搅拌30min即分别得三份澄清透明的纳米乳溶液。

需要说明的是，实施例9的纳米乳对应实施例1的提取物，实施例10的纳米乳对应实施例2的提取物，实施例11的纳米乳对应实施例4的提取物。

检测例4

对上述实施例9-11制备得到的纳米乳进行防腐测试，具体如下：

1、细菌：金黄色葡萄球菌(推荐使用ATCC 6538)，大肠埃希氏菌(推荐使用ATCC8739)，铜绿假孢单菌(推荐使用ATCC 9027)。除此三种细菌外，根据产品和原料的特性，可根据需要增加洋葱伯克霍尔德氏菌(推荐使用ATCC 25416)或从已污染样品内分离的菌作为指标菌株，并由送检人在检测前明确提出要求。

2、真菌：白色念珠球菌(推荐使用白色假丝酵母菌)(ATCC 10231)，黑曲霉菌(推荐使用ATCC 16404)。

3、菌种代数：从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种传代后为第1代，应选择第3代到第5代菌种为防腐挑战试验的工作菌种。

4、菌种接种方式：细菌的接种方式为细菌混合菌(当样品特性需进行单菌接种时，在试验前由送检方明确要求)；真菌的接种方式为单菌，即取两份样品，分别接种白色念珠球菌和黑曲霉菌。

5、菌种接种浓度：对于细菌，不管是单菌试验还是混合菌试验，细菌的接种浓度都为1.0-5.0×10

6、活菌计数：将测试菌液加入到待测样品中后，分别于0小时，第7天，第4天，第21天、第28天取样，进行平板活菌计数。

7、菌液接种及样品检测：取上述称量好的化妆品(30g)，分别加入0.3mL混合细菌悬浊液和0.3mL混合真菌悬浊液，用旋涡振荡器混合均匀，将样品于室温(22.5+2.5℃)保存，并分别于0、1、7、14、21、28天检测化妆品中的菌落数，即取1g或1mL待测样品加入到9mL改良的LETHEEN肉汤中，充分混匀稀释成适宜的倍数，检测样品中菌落数。每次检测做两个平行样。

检测标准参见表8。

表8检测标准

检测结果参见表9-表11。

表9实施例9的纳米乳的检测结果

细菌混合菌，B标；白色念珠球菌，A标；黑曲霉菌，A标。

表10实施例10的纳米乳的检测结果

细菌混合菌，A标；白色念珠球菌，A标；黑曲霉菌，A标。

表11实施例11的纳米乳的检测结果

细菌混合菌，C标；白色念珠球菌，A标；黑曲霉菌，A标。

说明本发明实施例提供的纳米乳有良好的防腐效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。