一种重组RSV F蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种重组RSV F蛋白、其制备方法及在制备呼吸道合胞病毒疫苗中的应用。

背景技术

人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus，hRSV）是婴幼儿和老年人发生严重呼吸道疾病的主要病因之一，自20世纪50年代hRSV被发现以来，国内外科研人员对hRSV疫苗进行了大量的研发，hRSV疫苗一直面临安全性不足或免疫原性弱等巨大挑战，已有多种进入临床试验阶段的hRSV疫苗宣布“失败”。2013年，融合前F蛋白（prefusionF protein, Pre-F）构象成功解析后，以Pre-F为基础的hRSV疫苗展现出良好的应用前景。尽管已有大量关于RSV F蛋白融合前构象稳定性的研究，但其作为疫苗使用的安全性和有效性仍面临巨大的挑战。

因此，提供一种安全性好、表达量高且具有增强的免疫原性和改善的稳定性的RSVPre-F蛋白，以及包含其的疫苗成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开一种重组RSV F蛋白、其制备方法及在制备呼吸道合胞病毒疫苗中的应用。所述重组RSV F蛋白相对于相应野生型RSV F蛋白的氨基酸序列，在氨基酸序列中引入突变，所述突变包括氨基酸的取代、缺失或添加。

本发明一方面提供一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白，其包含可溶性F蛋白多肽，该F蛋白多肽包含至少一种选自下组的修饰：

（a）至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代；

（b）至少一个空腔填充突变；

（c）融合肽的部分或全部缺失；和

（d）添加包含异源三聚化结构域的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述至少一种修饰包含F蛋白多肽的F1亚基和/或F2亚基中至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代。

在一些实施方式中，所述被半胱氨酸取代的氨基酸残基包含野生型RSV F蛋白氨基酸序列的第159+291、176+190和89+231位中的至少一对。

在一些实施方式中，所述至少一个空腔填充突变是野生型RSV F蛋白氨基酸序列第67位的天冬酰胺突变，所述突变为疏水氨基酸的替换，利用多侧链疏水氨基酸的空间填充作用，维持表位Φ融合前构象。

在一些实施方式中，所述第67位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸或色氨酸。

在一些实施方式中，F蛋白多肽的融合肽部分缺失。

在一些实施方式中，所述重组RSV F蛋白相较于野生型呼吸道合胞病毒F蛋白存在以下突变：

（a）所述重组RSV F蛋白相较于野生型呼吸道合胞病毒F蛋白的F1亚基和/或F2亚基中至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代；

（b）第67位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸或色氨酸；和

（c）融合肽的部分或全部缺失；

所述野生型呼吸道合胞病毒 F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代使得重组RSV F蛋白的F1亚基和F2亚基之间、或F1亚基内形成非天然二硫键连接，所述非天然二硫键包括除F1亚基与F2亚基之间形成的Cys69-Cys212和Cys37-Cys439之外的二硫键。

在RSV F蛋白融合前构象中，β2与β4链之间彼此靠近，促进Φ表位两个不连续表位的空间折叠；通过添加非天然二硫键可以相对稳定β2与β4链之间空间位置，很好的稳定Pre-F蛋白结构。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代选自H159C+I291C、K176C+S190C和A89C+L231C中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代为A89C+L231C，A89C+L231C使得在重组RSVF蛋白的第89位和第231位之间形成链间二硫键。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代为K176C+S190C以及A89C+L231C，使得在重组RSV F蛋白的第176位和第190位之间形成链内二硫键，并且在第89位和第231位之间形成链间二硫键。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代为H159C+I291C，使得在重组RSV F蛋白的第159位和第291位之间形成链内二硫键。

在一些实施方式中，为了维持表位Φ融合前aa62-69和aa196-209两段不连续表位肽形成的空间构象和稳定性，在表位附近的β1和β2，和/或β3和β4结构间区域进行疏水氨基酸的替换，利用多侧链疏水氨基酸的空间填充作用，维持表位Φ融合前构象。

在一些实施方式中，所述重组RSV F蛋白相较于野生型呼吸道合胞病毒F蛋白存在至少一处空腔填充突变，所述空腔填充突变至少包含第67位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸（即N67F）或色氨酸（即N67W）。

在一些实施方式中，所述空腔填充突变优选为N67F。

在另一些实施方式中，所述空腔填充突变优选为N67W。

在一些实施方式中，所述重组RSV F蛋白相较于野生型呼吸道合胞病毒F蛋白存在融合肽的部分缺失。

在一些实施方式中，所述融合肽缺失的部分至少包括野生型RSV F蛋白的第137～144位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述融合肽缺失的部分为野生型RSV F蛋白的第137～144位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述融合肽缺失的部分为野生型RSV F蛋白的第137～146位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述融合肽缺失的部分为野生型RSV F蛋白的第110～146位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代为H159C+I291C，F蛋白氨基酸序列第67位的天冬酰胺突变为色氨酸，所述融合肽缺失的部分包括野生型呼吸道合胞病毒F蛋白的第137～144位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代为K176C+S190C和A89C+L231C，F蛋白氨基酸序列第67位的天冬酰胺突变为色氨酸，所述融合肽缺失的部分包括野生型呼吸道合胞病毒F蛋白的第137～144位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代为 A89C+L231C， F蛋白氨基酸序列第67位的天冬酰胺突变色氨酸，所述融合肽缺失的部分包括野生型呼吸道合胞病毒F蛋白的第137～144位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代为 A89C+L231C， F蛋白氨基酸序列第67位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸，所述融合肽缺失的部分包括野生型呼吸道合胞病毒F蛋白的第137～144位氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述重组RSV F蛋白的C端包含选自foldon或GCN4的三聚化结构域。

在一些实施方式中，所述重组RSV F蛋白的C端包含的三聚化结构域优选为foldon。

在一些实施方式中，所述三聚化结构域可以经由接头（诸如氨基酸接头，例如序列GG、GS或SAIG）连接至F1亚基或其功能片段。接头也可以是较长接头，例如，包括重复序列GG。

重组RSV F蛋白的F1亚基可具有与相应野生型RSV F蛋白的全长F1多肽相同的长度；然而，其也可具有缺失，诸如从全长F1多肽的C-末端缺失1个、2个、3个、5个、10个、20个氨基酸残基、最多达60个氨基酸残基。重组RSV F蛋白的全长F1多肽对应于天然RSV F0前体的氨基酸位置137-574，且包括（从N-末端至C-末端）胞外域（残基137-524）、跨膜结构域（残基525-550）和细胞质结构域（残基551-574）。

在一些实施方式中，重组RSV F蛋白的F1亚基缺少整个细胞质结构域。在其它实施方式中，F1亚基缺少细胞质结构域和一部分或全部跨膜结构域。在一些具体实施方式中，重组RSV F蛋白包含F1域，其中从位置510、511、512、513、514、515、520、525或530至574的氨基酸残基不存在。通常，对于连接至三聚化域的重组RSV F蛋白，氨基酸514至574可不存在。因此，在一些具体实施方式中，氨基酸残基514至574在重组RSV F蛋白的F1亚基中不存在。在其它具体实施方案中，重组RSV F蛋白的F1亚基包含天然F0多肽序列的氨基酸残基137-513。

本发明所述的重组RSV F蛋白的序列包括蛋白酶切割位点序列，诸如凝血酶切割位点（LVPRGS）；蛋白标签，诸如6×His-标记(HHHHHH)和StrepII标签（WSHPQFEK）；或接头序列(诸如GG、GS、SAIG)，所述序列不是RSV F蛋白的功能、诸如诱导免疫应答所必需。本领域技术人员将认识到此类序列，并且在适当时理解，这些序列不包括于所公开的重组RSV F蛋白中。

本发明所述“foldon”或“foldon结构域”通常是指在噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的残基。在本申请中，foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的27个残基或其突变体。一个实例是具有GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 6)的序列。在本申请中，foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的27个残基截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、6或10个氨基酸得到的截短体或增长体。这里所说的突变体通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。

在一些实施方式中，所述重组RSV F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、15、20和21中任一项所示。

本发明另一方面还提供一种重组核酸，其包含编码上述的重组RSV F蛋白的多核苷酸序列。在某些实施方案中，对重组核酸进行密码子优化以在选定的原核或真核宿主细胞中表达。包含重组RSV F蛋白编码核酸的宿主细胞也是本发明的特征。有利的宿主细胞包括原核（即细菌）宿主细胞，诸如大肠杆菌（E.coli），以及很多真核宿主细胞，包括真菌（例如酵母）细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞（诸如CHO、VERO、HEK293和Expi293F细胞）。

本发明还提供制备所述重组RSV F蛋白的方法，包括如下步骤：

S1、合成所述重组RSV F蛋白对应的DNA序列，并克隆到质粒载体中；

S2、用重组质粒载体转染宿主细胞、并进行表达，所述宿主细胞为真核细胞；

S3、对培养产物进行纯化，得到所述重组RSV F蛋白。

本发明另一方面还提供任一种上述的重组RSV F蛋白在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。

本发明进一步提供一种疫苗，其包含任一种上述的重组RSV F蛋白和药学可接受载体或赋形剂。

在一些实施方式中，所述单剂人用疫苗中含有所述重组RSV F蛋白60~120μg。在一些实施方式中，所述单剂人用疫苗中含有所述重组RSV F蛋白优选60μg。在一些实施方式中，所述单剂人用疫苗中含有所述重组RSV F蛋白优选120μg。

在一些实施方式中，所述载体或赋形剂包含缓冲剂。药学可接受载体和赋形剂是公知的，并且可以由本领域技术人员进行选择。任选地，药学可接受载体或赋形剂还含有至少一种增加溶解度和/或稳定性的成分。增溶剂/稳定剂的例子包括去污剂，例如月桂树肌氨酸和/或吐温。另有一些增溶剂/稳定剂的例子包括精氨酸、蔗糖、海藻糖等。因此，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合于通过选定的使用途径向受试者施用的配制剂。合适的赋形剂包括但不限于甘油、聚乙二醇、KCl、钙离子、镁离子、锰离子、锌离子和其他二价阳离子相关盐等。

所述疫苗针对RSV A亚型和B亚型中的至少一种感染提供保护。亚型A和B的F蛋白的氨基酸序列约90%相同。A亚型的F0前体多肽的实例序列提供于SEQ ID NO: 1 (A2毒株；GenBank: AAB86664.1)中，且B亚型的F0前体多肽的实例序列提供于SEQ ID NO: 2 (18537毒株；Swiss-Prot: P13843.1)中。两者都是574个氨基酸的序列，其中，信号肽序列也已报导为氨基酸1-25。在两个序列中，TM结构域是近似氨基酸530至550，但替代地报导为525-548。胞质尾区在氨基酸548或550开始并在氨基酸574结束，其中棕榈酰基化半胱氨酸残基位于氨基酸550。

在一些实施方式中，所述疫苗进一步包含佐剂。

在一些实施方式中，所述佐剂包含铝佐剂、角鲨烯、生育酚、MPL、LPA、CpG、poly(I:C)以及QS-21中的至少一种。

通常在佐剂选择时应能够在接受疫苗施用的受试者或受试者群体中增强Th1偏向性免疫应答，且在受试者或受试者群体中是安全且有效的。

任选地，疫苗还可以包含与RSV不同的病原性生物体的至少一种其他的抗原，例如，病原性生物体是与RSV不同的病毒，诸如带状疱疹病毒、人乳头瘤病毒、乙肝病毒、冠状病毒或流感病毒。或者病原性生物体可以是细菌，诸如白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血菌或肺炎球菌。

本发明还提供制备上述预防RSV感染的疫苗的方法，其包括：

S1、培养哺乳动物宿主细胞以表达所述重组RSV F蛋白；

S2、纯化表达的重组RSV F蛋白；

S3、将纯化的重组RSV F蛋白与佐剂按比例单独包装或充分混合。

在一些实施方式中，所述方法还包括基因合成、表达载体的构建、纯化蛋白的冻干等额外步骤。可以通过本领域公知的许多方法的任一种或几种来从重组细胞培养物回收和纯化所表达的重组RSV F蛋白，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离心、阴/阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最后，可以在最终的纯化步骤中采用高效液相层析HPLC。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对野生型RSV F蛋白进行多种氨基酸的取代、缺失和添加，获得了能够暴露更多中和抗体表位的RSV F蛋白融合前构象，在维持稳定的融合前构象的同时确保了其可引起对RSV亚型A和B的有效中和抗体反应和结合抗体反应。更特别的，本发明使用重组RSV F蛋白作为免疫原联合佐剂，获得了更强的免疫诱导效力，不仅提高体液免疫应答，还强效地刺激Th1型免疫，大大提升了RSV抗原的免疫原性。本发明公开的突变方式适用于人RSV的其他病毒株；适用于以RSV F蛋白为抗原的各种疫苗形式，如蛋白疫苗、核酸疫苗、病毒样颗粒疫苗和载体疫苗。

具体实施方式

下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。

除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

术语定义

在本申请中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本申请中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。

在本申请中，术语“空腔填充突变”是指野生型RSV F蛋白中的氨基酸残基被预期填充成熟RSV F蛋白的内部空腔的氨基酸取代。在一种应用中，此类空腔填充突变有助于稳定F蛋白的融合前构型。RSV F蛋白的融合前构型中的空腔可通过本领域已知的方法来鉴定，诸如通过目视检查呈融合前构型的RSV F的晶体结构，或通过使用计算型蛋白设计软件。

在本申请中，术语“DS-Cav1”是指RSV F蛋白的具有McLellan等人，Science, 342(6158), 592-598, 2013中所述的氨基酸序列的形式。

在本申请中，术语“pXCS847”是指RSV F蛋白的具有辉瑞公司CN201680075615.8中所述的SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的形式。

在本申请中，术语“D25”是指 CN200880023301.9中所述的抗体，其具有该申请说明书附图11D中分别显示的重链CDRs和轻链CDRs的氨基酸序列。

在本申请中，术语“101F”是指US11261356中所述的抗体，其具有该申请说明书附图2a和2b中分别显示的抗RSV mAb 101F的重链CDRs和轻链CDRs的氨基酸序列。

在本申请中，术语“Mota”或“motavizumab”是指WO2007002543A2中所述的抗体，其具有该申请说明书表2中分别显示的“抗体A4B4L1FR-S28R（aka motavizumab）”的重链CDRs和轻链CDRs的氨基酸序列。

在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。

实施例1. 单突变体设计与基因合成

本发明的重组RSV F蛋白是基于SEQ ID NO: 1中所述的野生型（简称WT）RSV F蛋白氨基酸序列来设计和制备的。本实施例说明各种重组RSV F蛋白的设计，所述重组RSV F蛋白包括foldon结构域和引入的氨基酸突变。

引入氨基酸突变前的模板氨基酸序列为：

MELLILKANAITTILTAVTFCFASG

将按下表设计的氨基酸序列按照宿主Expi293F细胞进行密码子优化确定核酸序列进行全基因合成。

表1 半胱氨酸取代的突变体设计

表2 空腔填充突变的突变体设计

表3 融合肽缺失的突变体设计

表4 对照组设计

实施例2. 重组质粒构建、表达与初步筛选

将合成的目的基因插入真核质粒PTT5载体，用于转染Expi293F细胞进行表达。处于对数生长期的Expi293F细胞于转染前一天进行传代，按照一定的细胞密度接种于96孔深孔板中，使第二天细胞密度达到2.5×10

双抗体夹心ELISA法具体步骤为：

1）溶液配制

包被液：碳酸氢钠为1.59g/L、碳酸氢钠2.94mg/L；

20mM PB溶液：磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；

封闭液：0.02M的PB、1.5%BSA+5%蔗糖、0.1%Proclin300；

稀释液：0.02M的PB、1.5%BSA、0.1%Proclin300、氨基比林。

2）抗体包被：将101F抗体用包被液稀释至4μg/ml，100μl/孔加入酶标板孔中，置2-8℃包被16h。

3）封闭：洗板机300μl/孔、2次清洗拍干，加封闭液150μl/孔、37℃、孵育2小时。

4）加样：加入待检样品和酶标抗体（2000倍稀释），100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗板机洗板5次。

5）显色：加入显色液（A+B）100μl/孔，室温、避光反应15分钟。

6）读数：提前打开酶标仪，显色完全，酶标板反应孔中加入终止液50μl/孔，置于酶标仪（双波长、450nm/630nm）读数。

初筛获得表达量高的设计方案，用于下一步的筛选或评价，结果如下表所示。

表5 半胱氨酸取代的突变体96孔板高通量转染表达初筛

结果表明，突变体CM-2、CM-5、CM-6、CM-8、CM-14、CM-15、CM-18、CM-19、CM-23、CM-26、CM-27、CM-28、CM-32、CM-33、CM-34和CM-35能够稳定保持中和抗体表位Siteφ和SiteⅡ，可用于下一步的筛选和评价。

表6 空腔填充突变的突变体96孔板高通量转染表达初筛

结果表明，突变体VM-3、VM-4、VM-5、VM-6、VM-8、VM-10、VM-11、VM-12、VM-14以及VM-15能够稳定保持中和抗体表位Siteφ和SiteⅡ，可用于下一步的筛选和评价。

表7 融合肽缺失的突变体96孔板高通量转染表达初筛

结果表明，突变体△FP能稳定保持中和抗体表位Siteφ和SiteⅡ，在进一步的研究中发现，在与其它突变形成组合突变体时，仅缺失第137～144位氨基酸残基具有更高的表达量，因此，在下一步的筛选和评价中主要选用缺失第137～144位氨基酸残基的突变体。

实施例3. 单突变体表达量及稳定性评价

对数生长期的Expi293F细胞于转染前一天进行传代，按照1.2×10

表8 半胱氨酸取代的突变体表达量与构象稳定性筛选

注：“/”表示未检测到反应性或未测定

表9 半胱氨酸取代的突变体构象稳定性

注：“/”表示未检测到反应性或未测定

经综合考量表达量和热稳定性，半胱氨酸取代的突变体CM-2、CM-18、CM-19、CM-28、CM-35、CM-33和CM-14表现较优。与野生型相比，在4℃条件下储存14天后D25检测活性浓度下降不明显或未发生下降，融合前构象保留率明显高于野生型F蛋白。且具有与DS-Cav1相当或更高的稳定性。

表10 空腔填充突变的突变体表达量与构象稳定性筛选

注：“/”表示未检测到反应性或未测定

表11 空腔填充突变的突变体构象稳定性

经综合考量表达量和热稳定性，突变体VM-4和VM-5表现较优。与野生型相比，在4℃条件下储存14天后D25检测活性浓度下降不明显或未发生下降，融合前构象保留率明显高于野生型F蛋白。且具有与DS-Cav1相当的稳定性。

表12 融合肽缺失的突变体表达量与构象稳定性筛选

表13 融合肽缺失的突变体构象稳定性

与野生型相比，融合肽缺失的突变体在4℃条件下储存14天后D25检测活性浓度下降不明显，融合前构象保留率明显高于野生型F蛋白。且具有与DS-Cav1相当的稳定性。在进一步的研究中发现，在与其它突变形成组合突变体时，仅缺失第137～144位氨基酸残基具有更高的表达量，因此，在下一步的筛选和评价中主要选用缺失第137～144位氨基酸残基的突变体。

实施例4. 组合突变体设计、表达量及稳定性评价

将模板氨基酸序列的信号肽更换为CD33信号肽（SEQ ID NO: 8），foldon结构域与F1亚基之间的接头更换为GGSGGSG，以上述筛选出的表达和热稳定性较优的单突变体为设计基础，按下表设计氨基酸序列并按照宿主Expi293F细胞进行密码子优化确定核酸序列进行全基因合成，参照实施例2的方法构建重组质粒并表达。

表14 组合突变体设计

组合突变体表达三天后，10000rpm离心收集表达的细胞上清，另取表达上清，在50℃和60℃条件下分别孵育1小时，再采用双抗体夹心ELISA法，以101F作为包被抗体，D25作为标记抗体检测配对，检测重组质粒表达的各突变体在4℃、50℃孵育1h和60℃孵育1h后Siteφ表位的表达量和构象稳定性，其中，表达量以表位特异性中和抗体检测活性浓度表示，构象稳定性以50℃/4℃和60℃/4℃的活性浓度比值表示，结果如下表所示。

表15 组合突变体表达量及构象稳定性

突变体RC174、RC215、RC227和RC229表现出比4个对照组更高的表达量，并且在50℃甚至在60℃条件下具有与pXCS847和DS-Cav1对照组相当或更优的构象稳定性，显著高于Post-F和WT对照组，作为疫苗免疫原组分可保证在50~60℃极端温度条件下1小时内的暂时存放。

实施例5. 蛋白制备

5.1蛋白的大量表达

通过使用PEI MAX在Expi293F细胞中瞬时转染来表达重组蛋白。转染前一天将对数生长期的Expi293F细胞进行传代，按2.5×10

5.2蛋白纯化

开启SCG层析系统并连接仪器，调节系统参数压力不超0.3Mpa气泡报警高灵敏，将待纯化细胞上清以10000rpm，8min的条件离心，然后过滤备用。使用两步层析法对表达的免疫原蛋白进行纯化。

（1）HiS Trap HP(5ml)层析：首先使用50ml Buffer A（20 mM PB, 500 mM NaCl,pH7.4）以5ml/min的流速平衡层析柱（HiS Trap HP 5ml）10分钟，平衡结束后以2ml/min的流速上样前处理过滤上清。上样结束后使用50ml Buffer A（20 mM PB, 500 mM NaCl,pH7.4）以5ml/min的流速冲洗层析柱10分钟直至紫外UV趋于基线位置，然后使用buffer B（20 mM PB, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 7.4）以5ml/min的流速洗脱免疫原蛋白。

（2）StrepII(1ml)层析：使用30ml Buffer C（100mM Tris-HCl, 150 mM NaCl,1mM EDTA, pH 8.0）以1ml/min的流速平衡层析柱（StrepII 纯化柱）至紫外UV趋于基线位置；HiS Trap HP(5ml)层析洗脱液以1ml/min的流速上样，上样完成，以Buffer C按1ml/min流速平衡层析柱至紫外UV趋于基线；最后使用Buffer D（50mM biotin in BindingBuffer）以1ml/min的流速洗脱免疫原蛋白。纯水冲洗后，NaOH（50mM）碱洗柱重生。

定量：将洗脱下来的蛋白混匀后对其进行UV280nm定量，取出少量蛋白进行电泳检测，其余分装后置于-80℃冻存。

实施例6.免疫原构象稳定性评价

使用Pre-F融合前构象特异性单抗D25鉴定纯化的蛋白免疫原构象的稳定性。考察候选免疫原在不同温度、渗透压及反复冻融等条件下构象的稳定性，并测试候选免疫原与D25单抗的亲和力。

表16 考察条件

结果表明，虽然各重组RSV F蛋白包含野生型RSV F蛋白天然的弗林蛋白酶切割位点和pep27，但经由本发明公开的突变足以将其稳定在融合前构象，且在50℃放置1小时、高/低渗透压、及反复冻融的情况下与处理前的D25中和抗体检测活性浓度比值均接近于1，尤其是RC174、RC215、RC227和RC229在60℃放置1小时后，稳定程度与对照组的DS-Cav1和pXCS847水平相当，均显著高于野生型WT。

实施例7. 动物试验

选择6-8周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫，随机分组，每组6只，在0天、21天通过肌肉注射对小鼠进行疫苗双点免疫，左、右腿各50μL，包括重组RSV F蛋白候选抗原RC174、RC215、RC227和RC229；WT、DS-Cav1、pXCS847对照抗原组；以及PBS对照组。抗原剂量为12μg/只小鼠。分别在第20天和第35天收集血清，采集的血清储存于-20℃，后续进行中和抗体和结合抗体检测。

7.1中和抗体检测：

委托武汉大学病毒学重点实验室利用保存的RSV A2毒株进行中和抗体检测。具体步骤为：

（1）免疫后血清于56℃水浴孵育30分钟；

（2）灭活后的血清样本以1:8的起始稀释度，使用含2%FBS的DMEM培养基在96孔板中2倍梯度稀释；

（3）将50~100 PFU的RSV A2毒株添加至孔中，混匀后于37℃，5%CO

（4）将病毒与血清混合液转移至预先接种单层Vero细胞的96孔板中，37℃、5% CO

（5）观察细胞病变，应用Reed-Muench法计算中和抗体滴度，中和抗体滴度定义为有50%以上完整Vero细胞的最高血清稀释度。

结果显示，候选抗原RC174、RC215、RC227和RC229诱导产生的中和抗体几何平均浓度与pXCS847水平相当，稍高于DS-Cav1，但没有显著性差异，上述所有蛋白诱导产生的中和抗体几何平均浓度均显著高于WT和post-F蛋白。

7.2结合抗体检测：

（1）纯化的pre-F和post-F蛋白稀释至3μg/mL包被96孔板，100μL/孔，4℃孵育过夜，37℃下使用1.5%BSA-PBS封闭2小时，洗涤，干燥；

（2）血清样本使用样品稀释液进行2倍连续稀释，以1:200为检测首点，每孔加入100μL，37℃孵育30分钟；

（3）将辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（Abclonal，#AS003）按1:4000稀释，每孔加入100μL，37℃孵育30分钟；

（4）使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）进行显色，每孔加入100μL，室温避光孵育15分钟；

（5）每孔加入50μL 2M H

（6）以阴性对照吸光度值2.1倍为Cut-off值，样品吸光度值≥Cut-off值的最大稀释倍数为样本的滴度。

结果显示，候选抗原RC174、RC215、RC227和RC229诱导产生的Pre-F特异性抗体几何平均浓度约为WT的2倍，pXCS847的1.5倍，与DS-Cav1水平相当。

综上所述，本发明提供的重组RSV F蛋白具有较高的稳定性和表达量，包含所述重组RSV F蛋白的疫苗组合物可诱导产生针对RSV病毒的高滴度的中和抗体，这提示在病毒入侵时疫苗将提供较好的保护性效果，对RSV候选疫苗的研发具有重要意义。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。