基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极及其用途

技术领域

本发明属于电化学检测领域，具体涉及基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极及其用途。

背景技术

肾上腺素(Epinephrine，EP)一种由肾上腺髓质分泌的激素，是哺乳动物中枢神经系统中非常重要的儿茶酚胺类神经递质，它以大型有机阳离子的形式存在于神经组织和体液中，在调节生命系统的生理过程中发挥着重要作用

目前，电化学技术已被广泛应用，成为了分析检测肾上腺素的手段和方法之一。电化学生物传感器是通过集成电子转导元件和生物识别元件而开发的。一方面，电子元件提供了高性能电化学生物传感平台，用于检测具有高灵敏度和快速响应的目标分子。另一方面，基于对生物分子的特异性识别，生物认知元件有助于生物传感器的高选择性。

脱氧核糖核酸(DNA)作为一种优良的生物材料，已成为生物传感器技术中构建新型器件的优秀基石。由于DNA本身局具有有序的纳米结构和高度可编程的性质，其可以与小分子、金属离子或纳米颗粒相互作用，且基于DNA的电化学生物传感器具有操作简单、响应速度快、成本低等优点，以其高灵敏度和高选择性在生化分析中得到了广泛的应用。DNA结构中的磷酸主链、含有O原子的脱氧核糖以及含有N和O原子的碱基，使其成为金属离子结合的天然靶标。其中过渡金属离子倾向于与DNA碱基产生内部球体复合物。一般认为金属离子通过N7原子与嘌呤碱基G和A结合。G的O6原子和A的N1原子也是金属离子结合位点。嘧啶碱基T和C分别通过O2和N3原子与金属离子结合。

铜离子由于其重要的生物学作用，是目前研究与DNA相互作用最广泛、最深入的金属离子之一。据报道，Cu

发明内容

为了解决现有电极制备过程复杂且耗时较长等问题，本发明提供了一种基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极。

本发明提供的基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极，其制备方法为：

a、将金电极依次用0.3μm和0.05μm的Al

b、在室温下，将含有1μM ssDNA(单链DNA)的10μL PBS缓冲液滴在预处理的金电极上避光12小时，然后用PBS缓冲液和超纯水冲洗电极，并在N

c、然后将ssDNA/AuE电极在含有0.9mM MCH(6-巯基-1-己醇)的10μL Tris-HCl缓冲液中孵育60分钟，获得电极MCH/ssDNA/AuE；

d、将含有1μM dsDNA(互补链DNA)的10μL SSC缓冲溶液滴涂到MCH/ssDNA/AuE电极上1h完成杂交，得到电极dsDNA/AuE；

e、将电极dsDNA/AuE放置在含有Cu

上述基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极的制备方法中，步骤a所述电化学预处理时，扫描速率为100mV/s。

上述基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极的制备方法中，步骤b所述PBS缓冲液由10mM Na

上述基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极的制备方法中，步骤c所述SSC缓冲液由0.15M氯化钠和15mM柠檬酸钠组成，pH值为7.0。

上述基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极的制备方法中，步骤e所述Cu

本发明还提供了上述基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极在构建检测肾上腺素电化学生物传感器中的用途。

上述用途的操作方法为：将电极Cu

上述用途的操作方法中，所述含有EP的PBS缓冲液，配置前需通氮气去氧。

本发明提供了一种简单的新型电化学生物电极，通过肾上腺素与Cu

附图说明

图1本发明提供的基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极在肾上腺素检测中的示意图。

图2A、不同修饰电极的电化学阻抗表征:(a)裸AuE；(b)ssDNA/AuE；(c)MCH/ssDNA/AuE；(d)dsDNA/AuE；(e)Cu

图3不同序列的DNA对肾上腺素氧化峰电流的响应度。

图4A、在Cu

图5DNA的浓度对肾上腺素氧化峰电流的响应度。

图6Cu

图7Cu

图8Cu

图9A、肾上腺素缓冲液的pH对肾上腺素氧化峰电流的响应度；B、pH与峰电位的线性关系图。

图10肾上腺素的富集时间对肾上腺素氧化峰电流的响应度。

图11A、基于Cu

图12肾上腺素在Cu

图13基于Cu

具体实施方式

基于铜离子与DNA相互作用制备的电化学生物电极在构建检测肾上腺素电化学生物传感器中的用途，其操作方法为：将电极Cu

上述操作方法中，所述电极Cu

a、将金电极依次用0.3μm和0.05μm的Al

b、在室温下，将含有1μM ssDNA的10μL PBS缓冲液滴在预处理的金电极上避光12小时，利用S-Au(利用硫和金能够发生键合)将ssDNA自组装到金电极表面；然后用PBS缓冲液和超纯水冲洗电极，以去除未结合到电极上的DNA，并在N

c、然后将ssDNA/AuE电极在含有0.9mM MCH的10μL Tris-HCl缓冲液中孵育60分钟，以阻断电极的活性位点，获得电极MCH/ssDNA/AuE；

d、将含有1μM dsDNA的10μL SSC缓冲溶液滴涂到MCH/ssDNA/AuE电极上1h完成杂交，得到电极dsDNA/AuE；

e、将电极dsDNA/AuE放置在含有Cu

上述电极Cu

上述电极Cu

上述电极Cu

上述电极Cu

本发明采用的ss DNA购自上海生工生物科技有限公司，其碱基序列如下：

P1:5’—SH—(CH

P2:5’—CCCCGGCCCC—3’；

P3:5’—SH—(CH

P4:5’—GCGCGCGCGC—3’。

本发明所述的自组装到金电极上的ssDNA为P1或P3，ssDNA-P1与ssDNA-P2互补得到dsDNA-P1&P2；ssDNA-P3与ssDNA-P4互补得到dsDNA-P3&P4。

上述电极Cu

EP(肾上腺素)购自上海麦克林生化科技有限公司。盐酸肾上腺素注射液购自远大医药(中国)有限公司。MCH(6-巯基-1-己醇)购自Sigma-Aldrich(英国吉林厄姆)。MCH于Tris-HCl缓冲液(10mM，pH值为7.0)中稀释至所用的浓度。实验用水均为超纯水。

从宁夏医科大学动物实验中心选购SD大鼠(雄性)，采取大鼠腹部血样，4℃静置1h，4℃离心取上层血清，然后加入乙腈去除蛋白，得到经处理后的大鼠血清。

所用设备包括烘箱、磁力搅拌器、离心机和数控超声波清洗器。所有电化学测量均采用在CHI 660D电化学工作站(中国上海辰华仪器有限公司)。采用常规的三电极系统，裸金电极或所修饰的金电极(AuE，3mm)作为工作电极，进行了循环伏安(CV)、差示脉冲伏安(DPV)和电化学阻抗谱(EIS)等电化学测量，铂丝作为对电极；Ag/AgCl作为参比电极。

实施例1不同修饰电极的电化学表征

采用电化学阻抗谱(EIS)和差示脉冲伏安法(DPV)对不同修饰的金电极进行了表征。阻抗谱包括高频区的半圆和低频区的线性，其中高频区的半圆直径等于界面电子转移电阻(Ret)，Ret能反应电极界面处的电子转移信息，可以表征传感器的逐步构建过程。图2A显示了5种不同修饰的金电极在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)

图2B显示了裸AuE、dsDNA-P1&P2/AuE和Cu

实施例2DNA序列的选择

为了提高对肾上腺素峰电流的响应度，采用DPV法探究了固载不同序列的DNA(ssDNA-P1、ssDNA-P3、dsDNA-P1&P2、dsDNA-P3&P4)对EP峰电流的影响。如图3所示，当固载的DNA链中的鸟嘌呤为间隔时，其对EP峰电流的响应度较小，且单链小于双链，这说明Cu

实施例3扫描速度对肾上腺素电化学行为的影响

在含有10μM EP的PBS缓冲液(pH 7.0)中，在扫速为40～160m V/s的范围内，通过循环伏安法(CV)考察了扫描速度(v)对峰电流(Ip)的影响，进一步探究了EP在电极dsDNA-P1&P2表面的氧化还原反应机理。从图4A中可以看出，EP的CV曲线中只出现了氧化峰，表明EP在电极表面的反应是不可逆的。同时，随着扫描速度的平方根的增大，氧化峰电流也逐渐增大，且呈现较好的线性正相关(图4B)，线性方程是Ip(μA)＝0.57v

实施例4实验条件的优化

为了提高电极Cu

1)图5显示了DNA的浓度对EP的峰电流的影响，当DNA的浓度达到1.0μM时，EP的峰电流达到最大值，且随着DNA浓度的增加，峰电流趋于稳定，因此选择固载的DNA浓度为1.0μM。

2)图6显示了Cu

3)图7显示了Cu

4)图8显示了Cu

5)本发明还对EP缓冲液的pH进行了优化，探讨了不同pH对EP的峰电位和峰电流的影响。结果表明，(图9A)在pH 5～9范围内，EP的峰电位值随着pH的增加明显逐渐负移，且氧化峰电流随着pH的增大，先增大后减小，在pH＝7.0时，EP的峰电流达到最大值，考虑到人体体液的生理pH值，因此后续实验选择pH为7.0时进行测定。(图9B)而且进一步发现EP氧化峰电位(E

0.38(R

6)本发明也探讨了肾上腺素的富集时间对峰电流的影响，如图10所示，当富集时间为180s时，EP的峰电流达到最大值，且随着富集时间的增加，峰电流趋于稳定，因此选择肾上腺素的富集时间为180s。

实施例5基于电极Cu

在本发明筛选出的实验条件下，采用本发明提供的电极构建传感器，利用DPV法对不同浓度的肾上腺素进行检测：将电极Cu

由图11可以看出，在肾上腺素的浓度为1～12.5μM范围内，肾上腺素的氧化峰电流与其浓度呈现良好的线性关系，线性方程为Ipa(μA)＝0.14C

表1Cu

表1列出并比较了其他参考文献公开的修饰电极检测肾上腺素的性能。结果表明，本发明提供的电极Cu

实施例6重现性，选择性和稳定性

通过DPV分析来评估采用本发明电极所构建传感器的重现性：取5根在相同条件下固载好的电极，在最优条件下检测浓度为5μM的肾上腺素，RSD(相对标准偏差)为5.6％。在含有5μM的肾上腺素缓冲液中加入一些常见共存离子，研究对Ip的影响(图12)。结果表明，200倍甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)和柠檬酸(CA)，100倍的NaCl，2倍的抗坏血酸(AA)对肾上腺素的峰电流基本不会产生干扰，RSD为2.7％，表明修饰电极具有较强的抗干扰能力。

如图13所示，将在相同条件下修饰的电极放在4℃，分别在第1，3，5天对肾上腺素进行检测，结果表明峰电流稳定，RSD为3.5％。这些结果表明，电极Cu

实施例7加入大鼠血清样品中肾上腺素的测定

为进一步验证本发明电极的准确度，采用电极Cu

采集大鼠腹部血样，经处理获得大鼠血清。将血清用PBS缓冲液(pH 7.0)稀释至200倍使用。在稀释后的大鼠血清样本中加入已知量的肾上腺素，得到含有不同浓度肾上腺素的血清样品，如表2所示。由此可知不同样品的回收率范围为97.9％～106.0％，相对标准偏差(RSD)范围为3.6％～4.7％。

表2大鼠血清样本中肾上腺素的测定

表2中的研究结果表明了该传感器可应用于生物样品中的肾上腺素的检测，具有较好的准确度。

实施例8实际样品的测定

将盐酸肾上腺素注射液(1mg/mL)用去氧的PBS缓冲液(pH 7.0)稀释至不同浓度，采用电极Cu

表3盐酸肾上腺素注射液中肾上腺素的测定

如表3所示，结果表明本发明提供的电极，可实现对实际样品中肾上腺素的检测。

本发明提供了一种在缓冲溶液和真实样品中电化学检测肾上腺素的系列电极Cu

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