对植物乳植杆菌具有促定植作用的黄芪茎叶提取物及其制备方法

技术领域

本申请涉及提取物领域，具体涉及对植物乳植杆菌有促定植的作用黄芪茎叶提取物及其制备方法。

背景技术

肠道是机体重要的消化器官，同时也是最大的免疫器官，肠道健康与畜禽的健康休戚相关。植物乳杆菌是常见的益生菌之一，可以改善肠道微生物态环境从而起到调节肠道菌群的作用。因此研究和开发能够促进肠道植物乳杆菌生长和定植的新型饲料添加剂对畜禽生产具有重要意义。

研究表明，黄芪提取物具有抗氧化，增强免疫力，抗疲劳，抗病毒，抗肿瘤，治疗糖尿病、动脉粥样硬化和老年痴呆，促进肉鸡生长等功效。黄芪(地上部分)茎叶提取物具有增强免疫、抗炎、保肝、抗衰老、保护胰腺等功效。然而，关于黄芪茎叶提取物和黄芪提取物促进益生菌生长的报道却很少。黄芪提取液(主要成分黄芪多糖)可以发酵培养枯草芽孢杆菌，低浓度的黄芪多糖可以有效提高芽孢杆菌数量，而高浓度黄芪多糖则抑制芽孢杆菌的生长。然而，关于黄芪茎叶提取物促进益生菌定植的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供对植物乳植杆菌有促定植的作用黄芪茎叶提取物。

本发明的再一目的是提供上述对植物乳植杆菌有促定植的作用黄芪茎叶提取物的制备方法。

根据本发明的对植物乳植杆菌有促定植作用的黄芪茎叶提取物，通过包括以下步骤的方法制备而得：

黄芪茎叶干燥后进行粉碎，过60目筛备用；

向粉碎的黄芪茎叶中加入去离子水，进行超声提取获得黄芪茎叶粗提物，其中，料液比为1:40，提取功率为500W，提取时间为25min，提取温度为50℃，pH＝7；

所述黄芪茎叶粗提物通过制备色谱收集对植物乳杆菌有促定植的作用黄芪茎叶提取物，其中，0～10min，20％乙腈；10～20min，24％乙腈；20～30min，35％乙腈；30～40min，50％乙腈；40～45min，15％乙腈；波长260nm，柱温室温，流速50mL/min，样品浓度100mg/mL，上样体积19mL，在制备的第32.53min-36min收集到对植物乳植杆菌有促定植功效的馏分。

根据本申请的技术方案，以黄芪茎叶提取物(AME)中多糖、多酚、黄酮、皂苷四大类活性物质以及提取物对植物乳杆菌(LP)的促生长活性为指标对超声提取条件进行考察，并通过单因素优化黄芪茎叶提取条件，从而得到AME的最优超声提取工艺。

通过制备色谱图确定收集的馏分，以时效和量效为基础，并以生物活性为导向筛选对LP有促定植作用的馏分。

附图说明

图1为不同产地液相图谱；

图2显示不同产地活性成分含量及促LP增殖活性；

图3显示不同提取方式液相图谱；

图4显示不同提取方式成分含量及促LP增殖活性；

图5为不同料液比液相图谱；

图6显示不同料液比活性成分含量及促LP增殖活性；

图7为不同提取功率液相图谱；

图8显示不同提取功率活性成分含量及促LP增殖活性；

图9为不同提取时间液相图谱；

图10显示不同提取时间活性成分含量及促LP增殖；

图11为不同提取温度液相图谱；

图12显示不同提取温度活性成分含量及促LP增殖活性；

图13显示黄芪茎叶粗提物制备色谱图；

图14显示黄芪茎叶粗提物和馏分F1-F9液相色谱图；

图15显示黄芪茎叶粗提物和馏分F2-F8对植物乳植杆菌的促定植活性；

图16显示黄芪茎叶粗提物和馏分F7对枯草芽孢杆菌的促定植活性；

图17显示馏分F7还原糖含量。

具体实施方式

实施例1黄芪茎叶提取物

黄芪茎叶干燥后进行粉碎，过60目筛备用，如表1所示，以单因素为变量进行超声提取。

表1单因素水平

通过DNS法、福林酚法、亚硝酸钠—硝酸铝法、香草醛—硫酸比色法测定黄芪茎叶提取物中活性成分含量，比较黄芪茎叶提取物促植物乳杆菌生长活性。

促植物乳杆菌增殖活性测定方法如下：

保存的菌液平板划线，恒温培养箱中37℃培养48h；挑取单菌落接种到40ml MRS液体培养基中，摇床培养24；取二次活化后的菌液400μL，加药处理24h；进行促增殖指标测定：

OD值：测定菌液在600nm波长处的吸光值；

自聚集能力：测定原菌液的OD

总蛋白：制备粗酶液，BCA法总测定蛋白。

有机酸测定：高效液相色谱法，液相条件：检测柱：Kromasil 100-5-C18；柱温：25℃；检测波长210nm；流动相：甲醇：0.2％磷酸＝2.5:97.5；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。

1.1不同产地黄芪茎叶比较

收集到八个不同产地的黄芪茎叶，通过对不同产地的黄芪茎叶提取物中活性成分的含量以及促植物乳杆菌生长活性进行比较，发现宁夏彭阳地区采收的黄芪茎叶提取得率最高(如表2所示)，如图1所示，液相图谱显示宁夏彭阳的AME成分较多。

如图2所示，宁夏地区采收的黄芪茎叶还原糖含量最高，而多酚、黄酮、皂苷的含量在榆林采收的黄芪茎叶中含量最高，但榆林采收的黄芪茎叶对植物乳杆菌的促增殖作用并不突出，因此综合考虑选择宁夏彭阳地区采收的黄芪茎叶进行提取条件优化。

表2不同产地的得率

1.2不同提取方式比较

如图3和图4所示，比较超声与煎煮提取得到的AME中的活性物质与促LP增殖的活性，实验结果表明超声提取得到的提取物活性成分含量比煎煮得到的提取物高，促LP增殖的活性也更加显著，因此选择超声提取进行下一步实验，并对超声提取条件进行优化。

1.3提取条件优化

1.3.1料液比优化

通过考察不同的料液比提取得率、活性成分含量及促LP增殖活性，如表3、图5和图6所示，可以看出当料液比为1:40时，提取得率、四大类活性成分含量及促LP生长活性较高，因此综合考虑选择1:40为最佳提取料液比。

表3不同料液比得率

1.3.2提取功率优化

通过考察不同提取功率下的提取得率、活性成分含量及促LP增殖活性，对提取功率进行优化。如表4实验结果表明，当提取功率为500W时，皂苷含量与提取得率最高；如图7和图8所示，还原糖含量随着提取功率的增加呈现出升高的趋势，多酚与黄酮的含量则呈现出降低的趋势；促LP增殖活性不同组之间差别较小，出于节能环保的考虑选择500W为最佳提取功率。

表4不同提取功率得率

1.3.3提取时间优化

通过考察不同提取时间下的提取得率、活性成分含量及促LP增殖活性，对提取时间进行优化。如表5、图9和图10所示，实验结果表明，随着提取时间的延长，提取得率和皂苷含量有升高的趋势；多酚和黄酮的含量呈现出下降的趋势；当提取时间为25min时有较好的促LP增殖活性，因此择25min为最佳提取时间。

表5不同提取时间得率

1.3.4提取温度优化

通过考察不同提取温度下的提取得率、活性成分含量及促LP增殖活性，对提取温度进行优化。如表6、图11和图12所示，实验结果表明，随着提取温度的升高，提取得率有升高的趋势；还原糖含量呈现出先升后降的趋势，多酚和皂苷的含量各组间无显著差异；当提取温度为50℃时有较好的促LP增殖活性，因此择50℃为最佳提取温度。

表6不同提取温度得率

1.3.5提取pH优化

通过考察不同提取pH下的提取得率、活性成分含量及促LP增殖活性，对提取pH进行优化。如表7、图13和图14所示，实验结果表明，当pH＝6时提取得率最高，还原糖含量随着pH升高呈现下降的趋势，多酚含量各组间无显著差异。当pH＝7时黄酮和皂苷的含量最高，同时也显示出较好的促增值活性，因此选择7为最佳提取pH。

表7不同提取pH得率

实施例2功效物质分离

通过制备色谱收集一级馏分，旋转蒸发浓缩后将馏分冻干，以生物活性为导向对馏分进行筛选，确定对LP有促增殖作用的馏分并通过LC/MS确定功效物质。制备色谱条件如表8所示。

表8

黄芪茎叶提取物(AME)通过制备色谱收集到九个馏分，馏分收集条件见表9，通过测定F2-F8对植物乳植杆菌(LP)的自聚集能力(图15)，以生物活性为导向筛选能够对植物乳植杆菌(LP)有促定植作用的馏分，实验结果表明馏分F7对LP有促进定植的作用。然后测定F7对枯草芽孢杆菌(BS)的促定植作用，实验结果表明，黄芪茎叶粗提物AME不仅没有促进BS定植作用，反而对其定植能力有所抑制，而馏分F7对BS有一定的促定植作用(图16)。对馏分F7中的还原糖进行测定，还原糖含量为20mg/g，说明促进植物乳植杆菌定植的主要活性成分不是还原糖(图17)。以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。