一种飞秒激光剥蚀质谱流式一体机及其使用方法

技术领域

本发明属于激光剥蚀技术领域，尤其涉及一种飞秒激光剥蚀质谱流式一体机及其使用方法。

背景技术

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种生物学技术，是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞术能够从单细胞水平同时分析细胞样本中的基因表达和蛋白表达，还可以检测细胞活性、细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖和细胞氧化等细胞功能。流式细胞术常规操作流程主要包括制备单细胞悬液、标记荧光抗体、流式细胞仪上机检测及数据处理等，详细参见图1。

传统的流式细胞术

传统的流式细胞仪（流式细胞术），是基于荧光的检测系统，发展了40 多年，已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。

流式细胞仪是利用激光作为光源产生散射光和荧光信号，并将这些信号由光电二极管或光电倍增管等检测器进行检测，从而对溶液中的单个细胞进行快速筛选和分析或对特定的细胞亚群进行分析并进行分离纯化的仪器。流式细胞仪的具体结构参见图2。

流式细胞仪分析细胞的各种参数都是通过光信号来实现的。光信号包括了散射光信号和荧光信号。散射光信号可以用来反映细胞的大小和颗粒度等物理信息，包括前向角（即0角）散射（forward scatter，FSC）和侧向角散射（又称90角散射）（side scatter,SSC），一般的流式细胞仪都具有这两个通道。荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色，细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。荧光信号可以用来反映细胞的抗原表达等化学特性。荧光通道的多少则是根据流式细胞仪的不同来确定的。

流式细胞仪（Flow cytometer，FCM ）独特的单细胞分析技术，分析数百万甚至更多细胞上的多个荧光参数的能力，使得流式能够帮助我们理解复杂的生物过程。然而，传统流式技术在发展过程中遇到了瓶颈，同时还存在一些缺陷，主要表现为在三个方面，一是荧光染料的限制，无法避免光谱渗漏、自发荧光等问题，二是不同荧光基团发射光谱的重叠会导致通道间的信号会相互干扰；三是传统流式细胞仪的检测通道数量（<20个）已经很难有质的提升；所有这些均使实验设计和补偿计算已经变得相当复杂，实验操作相当不方便。

质谱流式细胞技术：针对传统流式细胞术存在的瓶颈与缺陷，科学家们的研究出了质谱流式细胞技术。质谱流式细胞技术（Mass Cytometry, CyTOF）采用带有金属同位素标签的抗体对细胞进行标记，通过飞行时间质谱分析各细胞上的标签组成，进行细胞表型和功能的深入研究。

不同于传统的流式细胞仪采用光电二极管或光电倍增管等检测器进行检测，质谱流式采用的是飞行时间质谱（TOF-MS， Time of Flight Mass Spectrometer ）。TOF-MS采集瞬时全谱信息，大幅提升了仪器的分析速度和灵敏度，确保任何重要信息不会丢失，是一种具备超高质量分辨率和高精确质量的分析仪器。

质谱流式细胞术是指用稳定的重金属同位素（主要是镧系元素）代替荧光基团来标记抗体。然后将细胞引入CyTOF分析仪并雾化成液滴，液滴被汽化、雾化、电离，然后通过电势加速被带入质谱仪。最后，用TOF探测器对过滤后的离子云进行分析。质谱流式细胞术原理图如图3所示。

液滴雾化环节是质谱流式细胞术中很重要的一个环节，直接影响检测的灵敏度，具体的流程示意图如图4所示。质谱流式样本制备完毕后以细胞悬液的状态进入仪器，通过雾化器（Nebulizer）被分成小液滴，每个液滴包含一个细胞。包含细胞的液滴随后进入雾化室（Spray chamber），在雾化室中高流量的氩气将气溶胶液滴雾化（部分仪器还在雾化室外部设有加热装置，温度可达到200 ˚C），雾化后的气溶胶传输到ICP源进行等离子体化。

质谱流式细胞术具有以下优点：

1、超高通量；质谱流式具有非常宽的原子量检测范围，理论上可以同时检测135个通道；

2、临近通道间无干扰，无需计算补偿；金属标签替代荧光标签，无串色干扰,TOF质谱具有超高的分辨能力，可以完全区分用来标记的各种元素。实验数据表明，相邻通道间的干扰<0.3%，基本可以忽略不计，无需计算补偿。这样不仅使实验流程得到简化，也节约了标本和试剂

3、使用稀土元素作为标签，背景干扰小，信噪比极高；质谱流式使用生命体中不存在的稀土元素作为检测标签，金属标签是通过多聚螯合物实现与抗体的共价偶联，这种金属螯合物与细胞组分的非特异性结合极低可以实现超高的检测信噪比。

4、高灵敏度；质谱流式兼具质谱仪和聚合物-金属螯合技术双重优势。

同时，现有技术也具有以下缺陷：

1、采用高流量氩气进行雾化，部分公司设备还需要将雾化室加热到200摄氏度来进行雾化，目前雾化效率普遍在10-20%之间；

2、传输效率低，导致工作效率十分低，常规传输效率在10%以下；

3，影响检测的灵敏度与准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种飞秒激光剥蚀质谱流式一体机及其使用方法，能够通过激光剥蚀大大提高了雾化效率，提高了质谱流式细胞术的灵敏度与可靠性，并且单细胞采样区域实现全覆盖同时大大提升细胞的采样量及分析速度。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种飞秒激光剥蚀质谱流式一体机，包括：液路进样模块、激光剥蚀模块、质谱检测模块和样品池；

所述液路进样模块用于获取带有质谱检测标签的单细胞悬浮液并将其送入所述样品池；

所述激光剥蚀模块用于生成剥蚀激光对所述样品池中的样品进行激光剥蚀，并将所得的气溶胶送入所述质谱检测模块，所述激光剥蚀模块包括同轴观察模块和三维振镜模块，所述同轴观察模块用于观察聚焦位置；所述三维振镜模块用于在一个预设的剥蚀范围内高速调节所述剥蚀激光的聚焦位置；所述剥蚀范围的大小至少为一个单细胞的体积；所述激光剥蚀模块为飞秒激光剥蚀模块；

所述质谱检测模块用于生成质谱检测信号；

所述样品池包括样品支架，所述样品支架为凹形结构；所述样品支架包括剥蚀管和液位传感器，所述剥蚀管为直角弯管，所述剥蚀管的一端与所述液路进样模块连接，所述剥蚀管的另一端的中心与所述剥蚀激光同轴并且设置有单细胞剥蚀口；所述液位传感器设置在邻近所述单细胞剥蚀口的位置，所述液位传感器用于向所述液路进样模块反馈液位高度信息，所述液路进样模块根据所述液位高度信息控制将所述单细胞悬浮液送入所述样品池的流速。

优选地，所述样品支架还包括至少一个组织样品固定装置，所述组织样品固定装置包括载玻片和支撑弹簧；

所述样品池还包括一三维移动台，所述样品支架设置在三维移动台上。

优选地，所述三维移动台还包括一照明光源，所述样品支架的底部为高透光材料。

优选地，所述样品池还包括一样品杯、载气出口和载气入口，所述样品杯设置在样品支架上方。

本发明另一方面提供了一种飞秒激光剥蚀质谱流式一体机的使用方法，使用上述飞秒激光剥蚀质谱流式一体机，所述样品为细胞悬液，所述使用方法包括：

步骤S1：制备细胞悬液：将样品处理成单细胞悬液；

步骤S2：标记：通过带有金属同位素标签的抗体对所述单细胞悬液进行标记，所述金属同位素标签用于产生质谱检测信号；

步骤S3：调节所述剥蚀激光的聚焦位置和光斑大小，使剥蚀区域可以覆盖所述单细胞剥蚀口；

步骤S4：所述液路进样模块将步骤S2所得的单细胞悬液以稳定流速缓慢输送至所述单细胞剥蚀口；

步骤S5：所述激光剥蚀模块对到达单细胞剥蚀口的单个细胞进行全细胞的激光剥蚀；

步骤S6：通过载气将激光剥蚀后产生的气溶胶送至质谱检测模块，获取检测信号；

步骤S7：数据记录及分析。

本发明另一方面提供了一种飞秒激光剥蚀质谱流式一体机的使用方法，使用上述包括组织样品固定装置的飞秒激光剥蚀质谱流式一体机，所述样品为细胞组织切片，所述使用方法包括：

步骤S1：制备细胞组织切片；

步骤S2：标记：通过带有金属同位素标签的抗体对所述细胞组织切片进行标记，所述金属同位素标签用于产生质谱检测信号；

步骤S3：将标记后的所述细胞组织切片固定在组织样品固定装置上；

步骤S4：在所述样品池通入载气和保护气，调节相关的条件参数；

步骤S5：所述激光剥蚀模块对所述细胞组织切片进行激光剥蚀扫描；

步骤S6：通过载气将激光剥蚀后产生的气溶胶送至质谱检测模块，获取检测信号；

步骤S7：数据记录及分析。

本发明具有以下有益效果：

1）本发明的飞秒激光剥蚀质谱流式一体机的细胞悬液流式分析方法采用飞秒激光剥蚀代替目前的质谱流式氩气高速雾化技术（部分还采用高温加热雾化技术），雾化效率接近100%，提高了质谱流式细胞术的灵敏度与可靠性；

2）本发明进一步集成了三维成像功能，通过应用飞秒激光与三轴高速振镜，单细胞采样区域实现全覆盖，基本没有遗漏，可完整地获得单细胞的全细胞质谱信息；并且由于秒激光剥蚀效率极高，大大提升细胞的采样量及分析速度，传输效率可以达到90%以上；

3）本装置为二合一设备，将飞秒激光剥蚀质谱流式与组织成像质谱合为一体，提高了分析效率，降低了使用者的成本，并且利用本装置组织成像质谱不仅可以二维组织元素成像，还可以三维组织元素成像。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1至图4为现有技术的流式细胞术的示意图；

图5为本发明的飞秒激光剥蚀质谱流式一体机的结构示意图；

图6为本发明的三维振镜模块的结构示意图；

图7为本发明的组织样品固定装置的结构示意图；

图8为本发明飞秒激光剥蚀质谱流式一体机的使用方法的流程示意图；

其中：

100 液路进样模块；101 激光发射器；102 注射泵；200 激光剥蚀模块；201 剥蚀激光发射器；202 三维振镜模块；2021 移动镜头；2022 聚焦镜头；2023 X轴振镜；2024 Y轴振镜；203 场镜；204 激光束；205 载气；206 保护气；207 样品杯；208 样品支架；209 照明光源；300 质谱检测模块；301 样品；302 检测器；303 分光棱镜；304 三维移动台；305 带通滤镜；306 电脑；401 细胞；402 单细胞悬液；403 加标后样品；404 雾化器；405 等离子炬；406 气溶胶；407 加热雾化器；408 激光剥蚀；501 载玻片；502 支撑弹簧；503 剥蚀管；504 单细胞剥蚀口；505 液位传感器；506 高透光材料。

具体实施方式

本发明的核心之一在于提供一种飞秒激光剥蚀质谱流式一体机及其使用方法，能够通过激光剥蚀大大提高了雾化效率，提高了质谱流式细胞术的灵敏度与可靠性，并且单细胞采样区域实现全覆盖同时大大提升细胞的采样量及分析速度。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请首先参考图5，本实施例中所公开的飞秒激光剥蚀质谱流式一体机，包括：液路进样模块100、激光剥蚀模块200、质谱检测模块300和样品池；液路进样模块100用于获取带有质谱检测标签的单细胞悬浮液402并将其送入样品池；激光剥蚀模块200用于生成剥蚀激光对样品池中的样品301进行激光剥蚀，并将所得的气溶胶406送入质谱检测模块300，激光剥蚀模块200包括同轴观察模块，同轴观察模块用于观察聚焦位置；质谱检测模块300用于生成质谱检测信号。

在本实施例中，液路进样模块100：由样品管、工作溶液管、高精度的注射泵102、定量环和冲洗站等组成。样品管储存带标记的单细胞悬液402，工作溶液管储存载液与工作液。高精度的注射泵102可以精确调节样品流动速度，并以极低的稳定的流速运行，如10 µL/min。

样品池包括三维移动台和样品支架208，样品支架208设置在三维移动台304上，如图6所示，本实施例的样品支架208为凹形结构，样品支架208包括剥蚀管503和液位传感器505，剥蚀管503为直角弯管，剥蚀管503的一端与液路进样模块100连接（即图中单细胞悬液402进样方向），剥蚀管503的另一端的中心与剥蚀激光同轴并且设置有单细胞剥蚀口504；液位传感器505设置在邻近单细胞剥蚀口504的位置，液位传感器505用于向液路进样模块100反馈液位高度信息，液路进样模块100根据液位高度信息控制将单细胞悬浮液送入样品池的流速。在该实施例中，样品支架208底部为为高透光材料506（如高透光有机玻璃），同时三维移动台304设置有照明光源209，较佳地，样品支架208底部还带有均匀分布小孔，便于与蘑菇钉配合，用于固定各种形状的样品或者样品容器；样品池还包括一样品杯207、载气出口和载气入口，样品杯207设置在样品支架208上方。为了方便对组织样品进行检测，样品支架208还包括至少一个组织样品固定装置，组织样品固定装置包括载玻片501和支撑弹簧502

在本实施例中，激光剥蚀模块200包括三维振镜模块，三维振镜模块用于高速调节剥蚀激光的聚焦位置，如图7所示，三维振镜模块202包括移动镜头2021、聚焦镜头2022、X轴振镜2023和Y轴振镜2024；移动镜头2021可以轴向移动，移动镜头2021通过调节其与聚焦镜头2022的距离，使剥蚀激光聚焦的位置在样品301表面沿Z轴发生改变；X轴振镜2023和Y轴振镜2024可以分别进行高频绕轴往复转动，X轴振镜2023和Y轴振镜2024用于调节在样品301表面的水平方向的聚焦位置。在该实施例中，激光剥蚀模块200使用氩气作为载气205，氦气作为保护气206（也可以根据情况进行选择何种气体）；飞秒激光模块激光器基频为1030nm，通过倍频器输出515nm及343nm,脉冲宽度小于600 fs，重复频率1KHz - 1MHz。

由于本实施例采用了可以高速切换聚焦位置的三维振镜模块202，在流式检测时，可以将聚焦位置在剥蚀区域范围内高速扫描以提高激光剥蚀的通量，从而提高剥蚀检测的速度。

本实施例还公开了上述飞秒激光剥蚀质谱流式一体机的使用方法，对于常规样品如细胞悬液（即飞秒激光剥蚀质谱流式细胞术方法），如图8所示，方法如下：

1.细胞的制备：将样品（包括来自培养物、细菌、酵母、血液和组织的非贴壁细胞等）培养并处理成单细胞悬液402。

2.标记抗体：采用带有金属同位素标签的抗体对细胞进行标记，形成带有标记的单细胞悬液402。

3.样品池通入载气205与保护气206；

4.通过同轴观察系统，调节三维移动台304高度，让激光聚焦于剥蚀管剥蚀区域中心；

5.设置激光剥蚀参数，如激光的频率、能量密度、光斑尺寸及载气流速等参数，确保剥蚀的区域可以完全覆盖单个细胞；

6.飞秒激光剥蚀质谱流式细胞术装置在计算机控制下按照预先设置的参数开始工作；

7.液路进样模块100通过注射泵102装载单细胞悬液402并以极低的稳定流速将单细胞悬液402精确地输送到剥蚀检测区域；

8.激光剥蚀模块200产生剥蚀激光通过光路系统，经过三维振镜模块202高速聚焦于细胞，进行单细胞的全细胞剥蚀；

9.激光剥蚀细胞后直接形成微小的纳米颗粒，与载气205形成气溶胶406，沿管路传输到质谱检测模块300，如：ICP-TOFMS；

10.气溶胶406通过电感耦合等离子体源(ICP)，等离子化后，进入飞行时间质谱进行元素检测。

对于样品为细胞组织切片时（即飞秒激光剥蚀组织成像质谱），方法如下：

1.先在制样室采用金属标签抗体标记生物组织切片；

2.将标记后的组织切片移到载玻片501上；（如果是组织靶，则不需要移到载玻片上）

3.将载玻片（或者组织靶）采用支撑弹簧502与蘑菇钉固定到样品支架上；

4.样品池通入载气205与保护气206；

5.将场镜203更换为物镜；

6.通过同轴观察系统，调节三维移动台304高度，让激光聚焦于组织切片中心，选取成像区域；

7.设置激光剥蚀参数，如激光的频率、能量密度、光斑尺寸（小于1um）及载气流速等参数，

8.计算机发出激光剥蚀指令，同时质谱进行分析；

9.激光剥蚀模块200产生剥蚀激光，剥蚀激光通过光路系统后，经过三维振镜模块202高速聚焦于细胞，对选定区域细胞进行高速2D或3D剥蚀；

10.激光剥蚀细胞后直接形成微小的颗粒，与载气205形成气溶胶406，气溶胶406沿管路传输到质谱检测模块300，如：ICP-TOFMS；

11.气溶胶406通过电感耦合等离子体源(ICP)，等离子化后，进入质谱进行元素检测；

12.检测数据经过软件处理后可形成组织二维或三维元素成像图。

本实施例与现有技术相比的具有以下优势：

1.从原理上解决了传统免疫荧光串色以及组织自发荧光的信号干扰的问题

2.飞秒激光器短脉冲、非常高的瞬时功率等特点，减少了元素的分馏效应；

3.采用飞秒激光剥蚀代替目前的质谱流式氩气高速雾化技术（部分还采用高温加热雾化技术），雾化效率接近100%，提高了质谱流式细胞术的灵敏度与可靠性；

4.通过应用飞秒激光与三轴高速振镜，单细胞采样区域实现全覆盖，基本没有遗漏，可完整地获得单细胞的全细胞质谱信息；并且由于秒激光剥蚀效率极高，大大提升细胞的采样量及分析速度，传输效率可以达到90%以上；

5.本装置为二合一设备，将飞秒激光剥蚀质谱流式与组织成像质谱合为一体，提高了分析效率，降低了使用者的成本，并且利用本装置组织成像质谱不仅可以二维组织元素成像，还可以三维组织元素成像，同时还可以对同一组织采用两种方法进行交叉印证；

6.该方法不仅可以检测细胞的金属标记，同时可以检测细胞中几乎所有元素（包括重金属元素），对于疾病的诊断及细胞的深入研究提供了强大的工具。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。