一种低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的方法及其应用

技术领域

本发明属于物质提取技术领域，涉及一种低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的方法及其应用。

背景技术

使用有机溶剂的常规提取技术用于从植物中分离生物活性化合物已经很多年了。目前，植物中有效成分的提取仍以传统溶剂提取法为主，但其提取耗时长、效率低，提取溶剂多为有机溶剂，而有机溶剂大部分具有易燃、易爆、有毒、强氧化性等不安全因素，在实际生产使用中易对实验结果、环境及人身安全等造成危害，且存在溶剂成本高、污染严重等问题。因此，作为有机溶剂的替代品，绿色溶剂在“绿色化学”概念提出后因其低毒性而在过去十年中受到越来越多的关注。绿色化学被定义为“减少或消除有害物质的使用和产生的化学产品和工艺的设计”。从这个意义上讲，溶剂是绿色化学的一个重要挑战，因为它们占废物质量的绝大多数，它们通常是有毒和挥发性的，因此会导致环境污染，并且对人体健康有害。因此，低共熔溶剂(DESs)的出现备受关注。低共熔溶剂具有不寻常的溶剂特性(不易燃、与水混溶、易降解、生物相容且无毒)，从环境的角度来看，一般来说，DESs由于与传统溶剂相比具有高生物降解性和更低的细菌毒性，因此被认为是绿色溶剂。

DESs对植物中的不同极性物质具有很高的提取能力，近年来，DESs作为一种绿色高效提取介质在中草药活性成分提取方面展现出了惊人的优势。其具有毒性小、表面张力高、溶解性好、可降解等性质。目前主要应用在多酚、黄酮、多糖、皂苷等活性成分的提取方面，且研究表明相比于传统有机溶剂，DESs可以获得更高的提取效率。

可降解性也是评价“绿色化学”原则的一重要指标，一些研究员(Socas-RodríguezB.,Torres-Cornejo M.V.,

柠檬桉叶为芸香科植物柠檬或洋柠檬的叶，全年可采，是一种常绿灌木，上有硬刺。叶柄短，叶片小，长圆形至椭圆状长圆形叶片，边缘有钝锯齿。柠檬桉叶中含黄酮类、香豆精类、有机酸等化学物质。虽然柠檬桉叶已被应用于食用及精油提取，但对于柠檬桉叶中富含的活性物质来说现有的应用是不充分、不完全的。

提取柠檬桉叶黄酮类物质的方法有很多种，目前国内外黄酮粗品的提取的方法主要有：回流提取法、闪式提取法、微波提取法、超声提取法、超临界萃取法等五种方法，不同的提取方法得到的柠檬桉叶黄酮提取物中含有的物质种类相差很大。

专利CN110754661A公开了一种用低共熔溶剂提取草莓多酚的方法，所述方法为：将植物原料干燥粉末与低共熔溶剂水溶液混合，超声辅助提取，然后采用离心进行液-固分离，得到草莓多酚的粗提取液；然后经过适当的大孔树脂吸附洗脱，合并洗脱液，再经旋转蒸发仪浓缩，真空冷冻干燥至恒质量。但该专利没有对原料的抗氧化性进行评价。

专利CN112933131A公开了一种利用天然低共熔溶剂制备杜仲提取物的方法，包括以下步骤：按料液比1:1-1:100g/mL将杜仲粉末加入天然低共熔溶剂中，于20-80℃、50-500W下超声辅助提取10-90min；所述天然低共熔溶剂由氢键供体、氢键受体和蒸馏水以物质的量比1:(1-30):(1-50)组成，所述氢键供体包括L-乳酸、山梨醇、尿素、DL-苹果酸、D-果糖、葡萄糖、柠檬酸，所述氢键受体包括：氯化胆碱、甜菜碱、柠檬酸；离心，取上清液，进一步浓缩、干燥，即为杜仲提取物。但该专利没有对原料进行抗氧化性的评价。

专利CN110623988A公开了一种木芙蓉叶总黄酮的提取制备方法，包括以下步骤：(1)将木芙蓉叶原料烘干、粉碎、过筛；(2)将过筛后的木芙蓉叶粉末与低共熔溶剂混合均匀，经超声辅助提取，抽滤得澄清的含有总黄酮的木芙蓉叶提取液，旋转蒸发浓缩后得到木芙蓉叶总黄酮。但该专利没有对原料进行氧化性评价。

专利CN110934922A公开了一种黑枸杞中总黄酮、提取方法、应用，将黑枸杞洗净干燥后粉碎备用；使用氯化胆碱型低共熔溶剂作为提取剂，采用辅助提取获得黄酮提取液；氯化胆碱型低共熔溶剂中，合成低共熔溶剂的氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为乙酰丙酸、乳酸、乙二醇、尿素和1,3-丁二醇中的至少一种；将黄酮提取液采用大孔树脂吸附并采用有机试剂分离纯化得到纯化的黄酮提取液；将纯化的黄酮提取液旋蒸后添加聚乙二醇，真空冷冻干燥得到产品。但该专利没有考察ABTS自由基的清除能力以及阳性对照。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的方法及其应用，本发明提供的柠檬桉叶黄酮具有提取溶剂绿色环保、提取效率高的特点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一在于，提供一种低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的方法，该方法包括以下步骤：

S1.1、将柠檬桉叶和含水低共熔溶剂第三搅拌混合充分后超声提取，得到提取液；

S1.2、将提取液离心，得到上层液体；

S1.3、将上层液体真空抽滤，得到柠檬桉叶黄酮溶液。

进一步地，步骤S1.1中含水低共熔溶剂的制备包括以下步骤：

S2.1、将受体和供体第一搅拌混合至澄清透明，得到低共熔溶剂；

S2.2、将低共熔溶剂和水第二搅拌混合至澄清透明，得到含水低共熔溶剂。

进一步地，步骤S2.1中受体包括氯化胆碱、甜菜碱或脯氨酸，供体包括乙二醇、丙二醇、尿素、乳酸、乙酸或甘油，受体和供体的摩尔比为1:2。

进一步地，步骤S2.1中第一搅拌混合的温度为80-100℃，时间为60min。

进一步地，步骤S2.2中低共熔溶剂和水的体积比为7:3，第二搅拌混合的时间为2min。

进一步地，步骤S1.1中柠檬桉叶和含水低共熔溶剂的用量比为1g:25mL，第三搅拌混合的时间为1min。

进一步地，步骤S1.1中超声提取的温度为35℃，功率为200W，时间为30min。

进一步地，步骤S1.2中离心的转速为10000r/min，时间为15min。

进一步地，步骤S1.3中真空抽滤的真空度为0.01-0.09MPa，时间为3-5min。

本发明的技术方案之一在于，提供一种低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的应用，采用所述低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的方法制备得到的柠檬桉叶黄酮溶液具有抗氧化性。

低共熔溶剂是一种新型绿色溶剂，具有与离子溶剂(ILs)相同的性质，有可能取代传统溶剂和ILs。尽管ILs不会污染空气，但由于其低蒸气压，它们可能会根据其成分污染水和土壤。DESs仅仅是通过混合两种或多种易获得的、廉价的、可生物降解的成分而产生的，这些成分容易通过氢键相互作用自结合，形成熔点远低于单个化合物熔点的共晶混合物。因此，大多数DESs价格便宜，制作方便；它们通常具有低毒性、优异的热稳定性、广泛的液体范围，并且不易挥发、不易燃和可生物降解。并且当形成共晶溶剂时，不会发生化学反应，它们的相互作用可以在适当的条件下被破坏，而无需应用复杂的程序。

DESs需要考虑的一个重要方面是它们自身的生物活性，它可以保护提取的化合物，从而保持初始的生物活性。对于对环境(氧气、光线、温度和pH)敏感的化合物，共晶溶剂可作为抗氧化剂。基于氢键供体(HBD)与氢键受体(HBA)结合，它们形成了DESs，当化合物暴露于极端条件下时，它们可以在阴离子或阳离子交换中充当替代品。与使用常规溶剂获得的提取物相比，不稳定物质的降解速率得以降低。

在溶剂中添加一定比例的水可达到调节其物理化学性质的效果。研究表明，少量的水能降低DESs黏度以增大传输速率，由于DESs组分间由氢键相连，DESs具有高粘性的特点，不利于提取，因此水等高极性溶剂的存在不仅能改变其理化性质，还会对其提取能力产生影响，当含水量在50％以上时，HBA与HBD的相互作用随水的稀释而减弱甚至消失，超过50％的水含量会导致由共晶溶剂形成的骨架的破坏、DESs的粘度降低导致提取介质扩散到生物质中的速率提高以及溶剂的极性增加。

当DESs由来自植物代谢物或其衍生物的天然共晶化合物形成时，它们被称为天然低共熔溶剂(NADESs)，例如氨基酸、乳酸、甘油等。氯化胆碱(ChCl)这种胺盐天然存在于细胞脂质膜中，ChCl也很容易由三甲胺、环氧乙烷和盐酸合成。由于该化学反应不产生残留物，因此其环境因子(废物与所需产品的质量比)为零，因此被认为是清洁和可持续的过程。

NADESs具有低毒的特点，有些研究者测试了其细胞毒性，它们低毒的证据是，它们中的许多甚至缺乏抗菌活性。具体操作是溶剂对两种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和单核细胞增生杆菌)和两种革兰氏阴性菌(大肠杆菌和肠炎链球菌)的毒性进行了验证，未检测到对微生物生长的抑制。也有研究表明，根据细胞实验证明，DESs几乎没有细胞毒性，不同浓度的DESs作用下的细胞形态没有改变。

利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应及搅拌作用等均可加速有效成分进入溶剂(Rashid R.,Wani S.M.,Manzoor S.,Masoodi F.A.,Dar M.M.Greenextraction of bioactive compounds from apple pomace by ultrasound assistednatural deep eutectic solvent extraction:Optimisation,comparison andbioactivity[J].Food Chemistry,2023,398,133871.Doi:10.1016/j.foodchem.2022.133871)，从而提高浸出率，缩短提取时间，同时可避免高温对提出成分的影响，即被低共熔溶剂溶解，从而提高柠檬桉叶黄酮的提取率。超声提取植物有效成分的效果主要取决于超声波的机械剪切力和时间，即不会破坏柠檬桉叶黄酮的结构，可以使柠檬桉叶黄酮更多的溶出并较快地溶解在低共熔溶剂中，提高其提取效果，因此考虑的参数主要有温度、功率和提取时间。超声提取法的主要特点是安全、提取率高。同时，柠檬桉叶黄酮还具有优异的抗氧化性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的过程中加入水降低粘性，可避免混合液在室温下凝固，并起到稀释的作用，提高传输速率，提高提取率；

(2)本发明采用的低共熔溶剂绿色环保；

(3)本发明采用的超声提取不会破坏柠檬桉叶黄酮的结构，提取安全、提取效率高；

(4)本发明制备的柠檬桉叶黄酮具有优异的抗氧化性。

附图说明

图1为本发明实施例中芦丁标准曲线图；

图2为本发明实施例1至6以及对比例1和2中柠檬桉叶黄酮的总提取率图；

图3为本发明实施例中不同浓度DPPH自由基的清除能力图；

图4为本发明实施例中不同浓度ABTS自由基的清除能力图；

图5为本发明实施例和对比例中DPPH自由基的半抑制率图；

图6为本发明实施例和对比例中ABTS自由基的半抑制率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述各实施例中所采用的设备如无特别说明，则表示均为本领域的常规设备；所采用的试剂如无特别说明，则表示均为市售产品或采用本领域的常规方法制备而成，以下实施例中没有做详细说明的均是采用本领域常规实验手段就能实现。

本实施例中氯化胆碱、甜菜碱和脯氨酸均是白色晶体。

本实施例对柠檬桉叶进行干燥、粉碎、筛分，在避光环境下保存。本实施例的柠檬桉叶采用鲜柠檬桉叶，干燥的设备采用真空冻干机，粉碎的设备采用粉碎机，筛分的设备采用50目筛。

由于不加水的低共熔溶剂黏度过高，会粘附在锥形瓶、离心管、抽滤瓶上，导致误差很大，并且不加水的低共熔溶剂黏度大、流速小，且与柠檬桉叶粉末接触不良，不利于提取，故提取过程前需在低共熔溶剂中加水。

实施例6：

一种低共熔溶剂提取柠檬桉叶黄酮的方法，包括以下步骤：

将脯氨酸23.03g、甘油36.80g置于500mL圆底烧瓶，使二者摩尔比为1:2，摇匀，放入磁子后，将其置于加热式磁力搅拌器中，在85℃下水浴加热搅拌回流60min至溶液透明，然后将烧瓶拿出，得到17.5mL脯氨酸-甘油低共熔溶剂，加入7.5mL水的脯氨酸-甘油低共熔溶剂，用玻璃棒手动搅拌2min后，透明絮状物消失完全溶解(无分层)，放于避光处待用；

用真空冻干机干燥柠檬桉叶，粉碎机粉碎后的柠檬桉叶过50目筛，避光备用；

称取1g柠檬桉叶粉末于锥形瓶中，加入25mL含水脯氨酸-甘油低共熔溶剂，用玻璃棒手动搅拌1min后混合充分，在35℃、200W的条件下超声30min，在10000r/min的条件下离心15min，然后在0.05Mpa的条件下对上层液体进行真空抽滤4min，得到柠檬桉叶黄酮溶液，定义为DES-6。

一种柠檬桉叶黄酮溶液中黄酮含量的标准曲线绘制方法，包括以下步骤：

准确称取芦丁标准5mg，置于25mL容量瓶中，加入适量浓度为60％的乙醇，水浴锅中加热使芦丁溶解，冷却至室温，60％乙醇定容至刻度，摇匀，得0.2mg/mL芦丁标准溶液；

准确称取氢氧化钠固体4.0g，蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，得浓度为4％的氢氧化钠溶液(1mol/L)；

准确称取亚硝酸钠固体5.0g，蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，得浓度为5％的亚硝酸钠溶液；

准确称取硝酸铝固体17.6g，蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，得浓度为10％的硝酸铝溶液；

精确吸取0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL之前配好的芦丁标准溶液，以60％乙醇定容在10mL容量瓶中，依照顺序加入5％亚硝酸钠溶液反应6min，10％硝酸铝溶液反应6min，4％氢氧化钠溶液定容至10mL后反应15min。待反应完成后在510nm吸收波长处测定其吸光值；

以芦丁浓度作横坐标，吸光度作纵坐标，绘制标准曲线，并得出回归方程。

如图1所示，芦丁标准曲线的标准方程为Y＝1.537X+0.04474。式中：Y为吸光度；X为芦丁浓度，单位为mg/mL。

一种柠檬桉叶黄酮溶液中黄酮含量的检测方法，包括以下步骤：

用移液枪取1mL柠檬桉叶黄酮溶液至25mL容量瓶，加水定容，摇匀，再从上述容量瓶取1mL溶液到10mL容量瓶，依次加入0.5mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀静置6min，加入0.5mL10％硝酸铝溶液，摇匀静置6min，加入2mL 4％氢氧化钠溶液，摇匀静置15min，使用酶标仪检测吸光度，检测波长为510nm；

通过芦丁标准曲线法，用紫外吸光度换算柠檬桉叶黄酮溶液中黄酮含量，得出黄酮浓度后，可计算提取率，提取率的计算式为Y＝CNV/M。式中：Y为黄酮总提取量，单位为mg/g；C为黄酮浓度，单位为mg/mL，N为稀释倍数，测得吸光度后，代入标准曲线得出；V为柠檬桉叶黄酮溶液体积，单位为mL；M为柠檬桉叶粉末质量，单位为mg。实验进行三次，取平均值数据，计算标准偏差以及平均值。

一种柠檬桉叶黄酮溶液清除DPPH自由基的抗氧化性测定方法，包括以下步骤：

称取2mg DPPH粉末于40mL体积浓度为95％的乙醇溶液中溶解，超声15min使DPPH溶液混合均匀，超声完毕后取2mL该溶液，在517nm处测其吸光度，调整DPPH溶液吸光度在1.2-1.3之间；

移取不同浓度柠檬桉叶黄酮溶液2mL于试管中，加入2mL DPPH溶液，混匀，黑暗处反应30min，空白对照组取2mL无水乙醇，加入2mL DPPH溶液，并且测定2mL样品，加入2mL无水乙醇。

柠檬桉叶黄酮溶液的DPPH自由基清除率由下式计算：

式中：A

如图3所示，当柠檬桉叶黄酮溶液的浓度为0.2-10.0mg/mL时，随着柠檬桉叶黄酮溶液的浓度逐渐增大使得DPPH的清除率增加得较快，之后随着柠檬桉叶黄酮溶液的浓度增大逐渐增加得更慢且趋于稳定。当柠檬桉叶黄酮溶液的浓度等于10.0mg/mL时，柠檬桉叶黄酮溶液清除DPPH自由基的效率最高，达到79.95％。

一种柠檬桉叶黄酮溶液清除ABTS自由基的抗氧化性测定方法，包括以下步骤：

将5mL 7.4mmol/L ABTS储备溶液与88μL 2.6mmol/L过硫酸钾混合，静置12-16h以制备ABTS的工作溶液；取0.4mL ABTS溶液，用PBS溶液稀释；

取0.2mL的ABTS和10μL的不同浓度柠檬桉叶黄酮溶液，混合，使其在黑暗中于室温放置10min；室温下，平行测量三次在734nm波长处的吸光度。

柠檬桉叶黄酮溶液的ABTS自由基清除率由下式计算：

ABTS自由基清除率＝(A

式中：A

如图4所示，当柠檬桉叶黄酮溶液的浓度为0.2-10.0mg/mL时，ABTS清除率随着黄酮质量浓度的增加而增大，甚至可以达到清除率100％。

实施例1至5以及对比例1和2：

一种溶剂提取柠檬桉叶黄酮的方法及其应用，与实施例1基本相同，区别在于采用的提取溶剂不同。

表1不同提取溶剂对柠檬桉叶黄酮的提取条件和结果

如图2所示，在与常用有机试剂乙醇所提取柠檬桉叶中的黄酮含量相比，大部分DESs试剂所提取的柠檬桉叶中黄酮含量不如用乙醇作为溶剂提取的黄酮，出现这个现象的原因可能有以下几点：

(1)DESs分子与黄酮化合物之间氢键数目及其相互作用的大小；

(2)pH对DESs的影响；

(3)DESs的粘度过高，影响了萃取率。

总结来说，实施例4和实施例6在提高提取效率的同时达到了绿色环保的效果。我们对数据结果进行了统计学差异性分析，发现DES-4，DES-6效果显著与乙醇具有明显统计学差异，HBD和HBA的不同组合导致提取过程中目标和DESs之间的不同相互作用力，从而影响它们的溶解度和溶解目标组分的能力，根据“相似相溶”的原理，表明DES-6形成的分子间作用力更有利于溶解黄酮化合物。相比于乙醇溶剂也表现出更高的提取效率，并且相对于乙醇具有毒性、高挥发性等特点，DESs更适用于化妆品、食品、药物等研究的使用。

DESs的物理性质是影响DESs在提取天然产物中目标活性物质容量的关键因素，包括氢键作用的大小、极性的大小、pH的大小和粘度。除此之外，样品和DESs的固液比、样品的提取时间、DESs的分子量大小，超声的功率大小、搅拌的频率、物料的粒径大小均有可能会影响到目标活性物质的萃取效果。乙醇是相对极性的溶剂，尽管它具有羟基极性，但由于存在非极性和疏水链段，有机溶剂可以溶解非极性化合物。它们的非极性片段使它们能够溶解相对非极性和疏水性的类黄酮化合物，本实施例中，相比较于乙醇，DES-6所得提取液中黄酮含量最高，为18.72mg/g，这可能是因为其极性能够更好的溶解黄酮，因此选用DES-6作为柠檬桉叶黄酮提取溶剂最佳。

对比例3：

一种溶液清除DPPH自由基的抗氧化性测定方法，与实施例1基本相同，区别在于采用的溶液为0.125-1mg/mL维生素C(VC)。

计算IC50值以评估抑制50％ DPPH自由基所需的提取物浓度，IC50的降低对应提取物的抗氧化活性的提高，如图5所示，相比较对比例3的IC50为0.450mg/mL，实施例1的IC50为0.786mg/mL，柠檬桉叶黄酮溶液清除DPPH自由基能力接近高抗氧化性的VC，具有一定抗氧化效果。

对比例4：

一种溶液清除ABTS自由基的抗氧化性测定方法，与实施例1基本相同，区别在于采用的溶液为0.125-1mg/mL VC。

如图6所示，相比较对比例4的IC50为0.202mg/mL，实施例1的IC50为0.484mg/mL，柠檬桉叶黄酮溶液对ABTS自由基清除作用稍差，柠檬桉叶黄酮溶液对ABTS自由基清除效果接近高抗氧化性的VC，具有一定抗氧化效果。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。