一种应用桑辛素抑制无乳链球菌的方法及应用

技术领域

本发明属于日常杀菌消毒技术领域，具体涉及一种应用桑辛素抑制无乳链球菌的方法及应用。

背景技术

无乳链球菌（

无乳链球菌是导致亚临床奶牛乳腺炎主要病原菌，该病会引起乳房局部炎症、肿胀、硬化和触摸时有明显的疼痛感。患病奶牛的乳汁浑浊、脓性或带血，产量减少，乳头出现红肿、溢乳、裂口、脱皮等现象，使奶牛体温高达39.5℃以上，精神萎靡、食欲减退、甚至拒绝进食，最终导致奶牛的死亡。该病原菌给整个乳制品行业带来巨大的经济损失。全球亚临床乳房炎的患病率为42.35%。

GBS除了可以感染牛、骆驼、鳄鱼、马和蛙等多种动物外，还可感染罗非鱼、海豚、海鲷和银鲳等多种水生动物，也可以感染人，无乳链球菌作为一种人、哺乳动物和鱼类共患的条件性致病菌已经引起人们的高度关注。无乳链球菌广泛的危害性，已经引起了人们的广泛关注。

通过接触含有GBS的器皿是无乳链球菌感染和传播的主要途径之一，因而需要定期清除其中的无乳链球菌，而普通抗生素的使用不仅容易产生耐药性，效果不尽人意，还会造成污染，而高温灭菌的方式则过于麻烦。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明通过大量研究，在首次发现桑辛素对无乳链球菌有较强杀菌性能的基础上，发明出一种应用桑辛素抑制无乳链球菌的方法及应用。

本发明的一种应用桑辛素抑制无乳链球菌的方法：

将桑辛素配制成浓度不低于8 μg/mL的溶液或药剂，再将这种溶液或药剂与无乳链球菌接触，即可起到抑制作用。

如果是清除和抑制器皿中的无乳链球菌，可以将一定量的桑辛素和水放入喷壶中搅拌或震荡，配制成不低于8 μg/mL的溶液或混悬液，再将喷壶对准器皿喷洒即可。

桑辛素还可制成乳剂、口服制剂等多种形式的药物，用来治疗感染无乳链球菌相关的疾病，也可制成消毒制剂用来杀灭无乳链球菌。

本发明是建立在发现桑辛素对无乳链球菌有较强杀菌性能的基础上，并测定桑了辛素对无乳链球菌的MIC和MBC，研究了桑辛素对无乳链球菌生长曲线的作用，研究了桑辛素对无乳链球菌电导率、蛋白质合成和细胞形态的影响。

桑辛素（Morusin），又名桑根皮素或桑根白皮素，从桑科植物桑根皮提取的一种黄酮类天然化合物，棕黄色粉末，化学分子式为C25H24O6，相对分子质量420，熔点232-235℃；密度1.303 g/cm

桑辛素和庆大霉素对无乳链球菌最低抑菌浓度（Minimal inhibitoryconcentration，MIC）和最低杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）的测定，参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）方法，采用微量肉汤稀释法进行改良。新鲜的菌悬液用BHI培养基梯度稀释到10

最低杀菌浓度测定，将接种环沾取含有MIC以上浓度的培养液，在哥伦比亚血平板上进行划线线，然后将平板置于37℃的培养箱中培养24 h，平板上无活菌生长，此加药浓度为桑辛素抑制无乳链球菌的MBC。

通过微量稀释法检测庆大霉素和桑辛素对无乳链球菌的抗菌活性可知，庆大霉素在浓度为15 µg/mL时抑制率为81.43%，在浓度为30 µg/mL时抑制率达到98.77%，即庆大霉素对无乳链球菌的MIC值为15 µg/mL。桑辛素在4 µg/mL时的抑制率为76.77%，在8 µg/mL时的抑制率达到了89.51%，桑辛素对无乳链球菌的MIC值为4-8 µg/mL之间。可以得出，不同浓度的庆大霉素和桑辛素对无乳链球菌均有抑制作用，通过MIC值的比较可以看出，桑辛素能以更低浓度达到无乳链球菌的MIC，桑辛素在15 µg/mL时抑菌率达到99.6%，庆大霉素在15µg/mL时抑菌率为81.43%，表明桑辛素对无乳链球菌的抑制效果优于庆大霉素对无乳链球菌的抑菌效果。

通过平板划线检测桑辛素对无乳链球菌的最低杀菌浓度，桑辛素浓度为15 µg/mL时无菌落生长，表明桑辛素MBC为15 µg/mL。

桑辛素对无乳链球菌生长曲线的影响：本发明通过48 h内每隔4 h取样测定无乳链球菌的细菌密度值绘制生长曲线，检测桑辛素对GBS的生长曲线的影响。通过对无乳链球菌进行实验，探究了桑辛素对GBS生长过程中的影响，实验结果如图1所示，将实验结果以细菌生长时间为自变量，以菌体吸光度为因变量的曲线图，空白对照组中细菌生长呈现S形曲线，从中可以得出无乳链球菌的对数生长期为16 h，进入稳定期时间为32 h。添加桑辛素后无乳链球菌生长曲线变化明显，且随着药物浓度增加，对无乳链球菌生长的影响也越大。该实验中观察到，当桑辛素的浓度达到1/2MIC时，能够抑制GBS的生长，推迟细菌进入对数增长期。此外，在稳定期中，添加了桑辛素的菌液浓度明显低于未添加桑辛素的对照组，这表明桑辛素具有较强的抑菌作用，且在1/2MIC浓度时即可发挥作用。桑辛素浓度为MIC时，无乳链球菌增殖能力显著下降。当桑辛素浓度为MBC时，发现桑辛素对无乳链球菌的生长曲线没有变化，表明桑辛素完全抑制无乳链球菌的生长。

桑辛素对无乳链球菌细胞膜的影响：菌体的细胞膜完整性、菌体生长增殖和各项生命活动的基本，当细胞膜遭被破坏时，细胞内物质如磷酸盐、离子、DNA和RNA等从细胞膜中泄露出来，导致菌液电导率升高，细胞膜渗透性通过检测菌液的电导率的变化情况得到。经不同浓度的桑辛素理后的无乳链球菌电导率的变化情况如图2所示，空白对照组在0-120min的无乳链球菌正常的代谢过程可能会导致胞外电导率轻微的升高。而对于给药组（MIC和MBC），其电导率值在20-40 min内极速上升，尤其是桑辛素为MBC浓度下的电导率值，由29.3 µs/cm上升至42.1 µs/cm，提高1.43倍，MIC给药组则由25.1 µs/cm上升至 31.3 µs/cm，提高1.24倍；40-60 min内，MBC 给药组电导率值由42.1 µs/cm升至47.4 μs/cm；MIC 给药组电导率值由31.3 µs/cm升至35.7 µs/cm，相较于20-40 min速率有所下降；60-120 min内，MIC和MBC 给药组电导率缓慢上升。在整个实验时间段，MIC和MBC组的电导率分别提高了1.62倍和2.16倍。桑辛素处理后菌液电导率在前 40 min内的上升速率大于后面的时间段，表明添加桑辛素后能快速影响无乳链球菌细胞膜通透性，且和对照组相比差异显著。两种浓度处理下，菌液胞外电导率都有显著性的提高，说明桑辛素导致无乳链球菌细胞膜完整性发生改变，胞内物质流出，胞外电导率升高。

桑辛素对无乳链球菌蛋白质的影响：通过SDS-PAGE电泳分析桑辛素对无乳链球菌蛋白质的影响。如图3所示，对分子量在10-75 KDA的无乳链球菌蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明，空白对照组条带多清晰且明亮，不同浓度的桑辛素对无乳链球菌细胞蛋白合成的影响程度不同，当添加桑辛素时，蛋白条带数量明显少于空白对照组（实线框所示），只有三条带条带清晰可见（虚线框所示），其余的条带基本消失。桑酮的浓度为MIC和MBC进行对比发现，MBC组条带明显浅于MIC组，表明桑辛素能明显影响无乳链球菌的蛋白质合成，随桑辛素浓度的增大，对蛋白质合成的影响越明显。

桑辛素对无乳链球菌细胞形态的影响：采用扫描电镜观察桑辛素对无乳链球菌超微结构和细胞形态的影响，如图4所示。空白对照组的无乳链球菌链形态饱满圆润，表面光滑，细胞之间界限分明，形态正常。加入桑辛素的无乳链球菌细胞结构损伤并破裂，细胞褶皱下凹而畸形，出现扭曲。表明桑辛素会引起无乳链球菌细胞形态改变造成胞内物质外泄使细胞皱缩。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是:

本发明首次发现了桑辛素对无乳链球菌有较强的杀菌性能，并测定了桑辛素对无乳链球菌的MIC和MBC，研究了桑辛素对无乳链球菌生长曲线的作用，研究了桑辛素对无乳链球菌细胞形态的影响，发明了一种应用桑辛素抑制无乳链球菌的方法及应用，该方法不仅能简单、快速、有效的清除无乳链球菌，而且不会产生耐药性，还不会造成污染，填补了一项该领域的技术空白。

无乳链球菌对抗生素产生强大的耐药性，研究者寻找解决方法时，发现天然来源的中草药提取物，其抑菌机制与传统的抗生素存在明显差异，这些中草药提取物具有多个作用靶点、不易产生耐药性、来源广泛以及副作用较少等优点，目前已成为国内外研究热点。本发明初步探索了桑辛素对无乳链球菌的抗菌活性，用微量肉汤稀释法测定桑辛素对GBS的MIC和MBC分别为4-8 µg /mL和15 µg/mL，庆大霉素MIC为15 µg /mL，表明桑辛素对体外无乳链球菌有较强的抗菌性能且优于庆大霉素。此浓度明显低于Sohn等人研究桑辛素抑制表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为25 µg /mL。除此之外，桑辛素对无乳链球菌的MIC也低于其他药物对GBS的MIC和MBC，Peng等人研究小檗碱对无乳链球菌MIC和MBC分别为为78 µg /mL和20 mg/mL

细菌的生长和新陈代谢等多项指标可以用生长曲线进行反映，在培养基中，细菌数量与其所产生的菌体的吸光度呈现出明显的正相关关系，这种关系表明细菌菌体的数量增加会导致菌液吸光度的增大。反之细菌数量越少，吸光度就越小。桑辛素对无乳链球菌共培养的生长曲线的测定表明，空白对照组的细菌生长呈现S型曲线，添加不同浓度桑辛素之后，8 h后GBS的生长明显受到抑制，延缓细菌对数期到来，并且稳定期菌体数量少于对照组。当桑辛素浓度为MBC时，发现GBS菌液的OD

细胞膜是保护细胞的重要屏障，其在物质进出过程中发挥着选择透过性的作用，有效地维持了细胞内外环境的相对稳定。测定细菌溶液电导率试验发现桑辛素能够增加菌体细胞膜的通透性，造成各种离子和大分子物质外流，损伤细胞膜的通透性。扫描电镜结构同样表明，桑辛素在与无乳链球菌相互作用后，可以通过影响细胞膜的结构和功能，形成裂痕并导致细胞皱缩，最终引起细胞形态的改变。综合上述结果，推测桑辛素的作用机制是破坏细菌细胞膜功能和通透性为主，引起膜内物质外泄。这与小檗碱作用于无乳链球菌，4-松油醇作用于无乳链球菌，以及桑辛素作用于金黄色葡萄球菌表现出的抑菌作用方式相同。

蛋白质是生物体重要成分，大多是参与生化反应的酶类，是了解生物代谢繁殖的重要标志之一。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了桑辛素对无乳链球菌蛋白质合成的影响，聚丙烯酰胺凝胶电泳在一定程度上消除了蛋白质带电量的影响，使其具有较高的分辨率和重复性，同时其操作简便迅速，因而成为了蛋白质分离和定量的一种主要方法，并广泛应用于各种生物学领域

综上所述，通过MIC、MBC、生长曲线、电导率、扫描电镜、SDS-PAGE试验方法对桑辛素抑菌活性进行了测定。试验结果表明桑辛素具有较强的抗菌活性，干扰无乳链球菌的细胞膜结构，引起细胞膜发生裂解，从而破坏了菌体的完整性，使细胞内的物质外泄抑制蛋白质的合成，从而影响细菌的正常生长从而导致细菌的死亡。而有关桑辛素对无乳链球菌其他方面的抑菌机制，还需进一步详细研究。所以，桑辛素作为一种潜在的抗菌剂，可用于预防无乳链球菌感染的相关疾病。

附图说明

图1是桑辛素对无乳链球菌生长曲线的影响图。

图2是桑辛素对无乳链球菌电导率的影响图。

图3是桑辛素对无乳链球菌细胞蛋白合成的影响图，其中1：MIC组；2：MBC组；M：marker；3：空白对照组。

图4是桑辛素对无乳链球菌细胞形态的影响图，其中A：空白对照组；B：MIC组；C：MIC组。

具体实施方式

现结合具体实施例，对本发明进一步具体说明。

实施例1

将一定量的桑辛素和水放入喷壶中搅拌，配制成15.3μg/mL的溶液或混悬液，再将喷壶对准奶牛场中感染了无乳链球菌的器皿喷洒，有效抑制和杀灭无乳链球菌，阻断了无乳链球菌传播链，对奶牛无乳链球菌乳腺炎有较好的预防作用，每三天喷洒一次，一个月后，奶牛无乳链球菌感染的乳腺炎发病率较对照组下降80%以上。

实施例2

将一定量的桑辛素和水配制成8μg/mL的溶液，用这种溶液给准备放养且感染有无乳链球菌的鱼苗洗澡一小时再放养，大大降低了鱼苗发病的几率。

实施例3

将一定量的桑辛素和水放入喷壶中搅拌或震荡，配制成11.2μg/mL的消毒制剂，再将喷壶对准感染了无乳链球菌的场地喷洒，具备杀灭和抑制无乳链球菌的效果。

实施例4

将桑辛素做成一定浓度的乳膏，对感染了无乳链球菌的奶牛或者人的乳房进行涂抹，有效降低了乳腺炎的发病率，或者减轻了有关症状。

上述只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。