一种痰液样本核酸提取装置及提取方法

技术领域

本发明涉及痰液样本核酸提取技术领域，尤其涉及一种可直接提取痰液核酸的简便、低成本处理装置，以及采用该装置直接提取痰液核酸的方法。

背景技术

痰液是临床上最为常见的检测样本之一，尤其是对呼吸系统疾病，如肺结核、肺炎、肺吸虫等，痰液样本中病原体的检测，对疾病诊断和用药治疗有着重要意义。痰液是肺泡、支气管和气管的分泌物，一般情况下分泌量很少，而病理情况下，呼吸道黏膜和肺泡受刺激后黏液分泌增多，夹带各种细胞、纤维蛋白以及病原体等混合形成病理性痰液。

分子生物学的检测，得益于其快速、准确的特点逐渐应用于临床呼吸道感染病原及耐药的检测，而痰液样本进行分子检测的前提是核酸提取。由于痰液样本粘度较高，常规核酸提取试剂和装置难以直接应用。专利CN113203611A设计了一种简便的痰液预处理装置，但无法实现核酸的自动提取；专利CN211972356U设计了一种可以实现痰液核酸自动提取的装置，但其装置结构复杂，部件众多，整个装置生产制造成本较高，不利于在临床端的应用和推广。

发明内容

本发明的旨在提供一种痰液样本核酸提取装置和提取方法，以解决目前临床痰液样本难以直接、简便、低成本地进行核酸提取的技术问题。

本发明是采用如下技术方案实现的：

本发明的目的之一是提供一种痰液样本核酸提取装置，包括：

样品管本体，所述样品管本体通过第一隔层和第二隔层分隔成第一腔体、第二腔体和第三腔体；

第一通道，所述第一通道安装于样品管本体的一侧，所述第一通道的一端露出样品管本体的上端面，另一端穿过第一隔层进入第二腔体；

第二通道，所述第二通道安装于样品管本体的一侧且与第一通道位于同一侧，所述第二通道的一端露出样品管本体的上端面，另一端穿过第二隔层进入第三腔体；所述第一隔层和第二隔层在相对第一通道的另一侧与样品管本体内壁之间有中间通道；在样品管本体底部靠近中间通道一侧有一核酸出口；

管盖，所述管盖活动安装在样品管本体的上端面，用于封闭开口、第一通道和第二通道的上端口。

优选的，管盖通过螺纹或嵌套方式活动安装于样品管本体的上端面。当然，可以采用本领域通用的其他方式实现管盖的安装，只要能实现样品管本体的封闭确保密封即可。

优选的，在样品管本体靠近中间通道的一侧还有一临床屏障层，所述临床屏障层为固体石蜡；核酸出口、开口、第一通道和第二通道的上端口分别用可撕膜封闭；第一腔体内有液化裂解液，第二腔体内有洗涤液；第三腔体内有含磁珠的洗脱液。

优选的，所述可撕膜为铝膜。

优选的，所述可撕膜在开口(2)、第一通道(3)和第二通道(4)之间有预压半切割。

所述液化裂解液由以下组分组成：

液化剂：2％-10％ NaOH、40-100mM DTT、0.1％-1％ N-乙酰-L-半胱氨酸的一种或几种；

蛋白变性剂：1M-5M异硫氰酸胍、0.1M-2M盐酸胍的一种或两种；

表面活性剂：1％-3％ Triton X-100、1％-3％ PVP40、1％-3％ N-月桂酰肌氨酸钠；以及

缓存盐：10-50mM EDTA、10-100mM Tris-HCl(PH6.8)的一种或几种；余量为水。

所述液化裂解液的用量以能获得足够检测量的核酸为宜，优选的用量为

6-10mL。

所述洗涤液是质量浓度为60％以上的乙醇水溶液或无水乙醇，用量优选0.5-1mL。

所述洗脱液选自纯水、pH 6.0-9.0Tris-EDTA缓冲液的一种或两种。

所述磁珠优选羟基修饰磁珠或羧基修饰磁珠，粒径优选100-600nm，磁珠的添加量为10-50μL(100mg/mL)。

所述含磁珠的洗涤液的用量优选50-100μL。

本发明的目的之二是提供上述痰液样本核酸提取试剂管的试剂封装方法，具体包括如下步骤：

S1，用可撕膜将核酸出口封闭，将样品管本体横向放置，中间通道一侧置于底层，通过开口加入适量熔融石蜡以完全覆盖中间通道，静置直至石蜡完全凝固，形成临床屏障层；

S2，将样品管本体竖直放置，通过开口向第一腔体内加入适量液化裂解液；通过第一通道向第二腔体内加入适量洗涤液；通过第二通道向第三腔体内加入适量含磁珠的洗脱液；

S3，用可撕膜分别将开口、第一通道和第二通道封口；

S4，安装管盖以封闭样品管本体上端口。

本发明的目的之三是提供一种采用上述装置提取痰液样本核酸的方法，具体包括如下步骤：

S1，将样品管本体竖直放置，打开管盖，撕去开口上面的铝膜，注入适量痰液，重新安装管盖，手动上下震荡数次；

S2，将样品管本体以临床屏障层为顶层横向放置；

S3，加热使石蜡逐渐融化，同时第一腔体内痰液样本开始液化和裂解；

S4，待痰液样本充分液化和裂解后，通过磁转移将第三腔体内的磁珠经中间通道带入第一腔体内；

S5，通过震荡使磁珠和核酸充分结合；

S6，通过磁转移将第一腔体内的磁珠经中间通道带入第二腔体内，开始震荡洗涤；

S7，充分洗涤后，通过磁转移将第二腔体内的磁珠经中间通道带入第三腔体，开始震荡洗脱；

S8，洗脱完成后，经核酸出口转移提取核酸。

与现有技术相比，本技术方案具有以下优点：

1、本发明设计了一种有数个开口、通道和腔体的装置，该装置除管盖外可以一次开模生产，中间无需超声焊接、键合等方式进行组装。

2、该装置内试剂填充方便，无需特殊装备，常规移液器即可实现生产。

以下结合附图及实施例进一步说明本发明。

附图说明

图1为本发明痰液样本核酸提取装置的结构示意图。

图2为分别采用本发明装置及对照试剂提取核酸的扩增图谱对比。

图中：1管盖、2开口、3第一通道、4第二通道、5第一腔体、6第二腔体、7第三腔体、8临床屏障层、9中间通道、10核酸出口、11样品管本体、12第一隔层、13第二隔层。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

实施例1

如图1所示，本发明痰液样本核酸提取装置，包括：

样品管本体11，所述样品管本体11通过第一隔层12和第二隔层13分隔成第一腔体5、第二腔体6和第三腔体7；

第一通道3，所述第一通道3安装于样品管本体11的一侧，所述第一通道3的一端露出样品管本体11的上端面，另一端穿过第一隔层12进入第二腔体6；

第二通道4，所述第二通道4安装于样品管本体11的一侧且与第一通道3位于同一侧，所述第二通道4的一端露出样品管本体11的上端面，另一端穿过第二隔层13进入第三腔体7；所述第一隔层12和第二隔层13在相对第一通道3的另一侧与样品管本体11内壁之间有中间通道9；在样品管本体11底部靠近中间通道9一侧有一核酸出口10；

管盖1，所述管盖1活动安装在样品管本体11的上端面，用于封闭开口2、第一通道3和第二通道4的上端口。

实施例2

痰液样本核酸提取装置的试剂封装方法：

1、用铝膜将核酸出口10封口，将样品管本体11横向放置，中间通道9一侧置于底层，通过开口2加入适量熔融石蜡以完全覆盖中间通道9，静置直至石蜡完全凝固，形成临床屏障层8；

2、将样品管本体11竖直放置，通过开口2向第一腔体5内加入8mL液化裂解液；通过第一通道3向第二腔体6内加入0.8mL洗涤液；通过第二通道4向第三腔体7内加入75μL含磁珠的洗脱液；

3、用铝膜分别将开口2、第一通道3和第二通道4封口，铝膜在开口2、第一通道3和第二通道4之间有预压半切割，使用时撕开开口2覆盖铝膜不会使第一通道3、第二通道4封口处铝膜也被撕开；

4、安装管盖1以封闭样品管本体11上端口。

所述液化裂解液由以下组分组成：

液化剂：50％ NaOH、50mM DTT；

蛋白变性剂：3M异硫氰酸胍、1M盐酸胍；

表面活性剂：1％ Triton X-100；以及

缓存盐：20mM EDTA、50mM Tris-HCl(PH6.8)；余量为水。

所述洗涤液是质量浓度为80％的乙醇水溶液。

所述洗脱液为pH 8.0Tris-EDTA缓冲液。

所述磁珠优选羟基修饰磁珠粒径优选400nm，磁珠的添加量为20μL(100mg/mL)。

实施例3

痰液样本核酸提取方法：

1、将样品管本体11竖直放置，打开管盖1，撕去开口2上面的铝膜，吐入1mL左右痰液，重新安装管盖1，手动上下震荡数次；

2、将样品管本体11以临床屏障层8为顶层横向放置；

3、加热使石蜡逐渐融化，同时第一腔体5内痰液样本开始液化和裂解；

4、待痰液样本充分液化和裂解后，通过磁转移将第三腔体7内的磁珠经中间通道9带入第一腔体5内；

5、通过震荡促进磁珠和核酸充分结合；

6、通过磁转移将第一腔体5内的磁珠经中间通道9带入第二腔体6内，开始震荡洗涤；

7、充分洗涤后，通过磁转移将第二腔体6内的磁珠经中间通道9带入第三腔体7，开始震荡洗脱；

8、洗脱完成后，经核酸出口10转移提取核酸。

为评价本发明对痰液样本的核酸提取效果，选取了3例不同程度的结核分枝杆菌阳性痰液样本(已灭活处理)，配制了相应试剂，并选取了一款市场上常用的核酸试剂作为对照(病原DNA提取试剂盒，货号：A181230-50，深圳市南科征途有限公司)，使用本发明装置对3例样本(每个样本重复测试3次)进行了核酸提取。然后在实时荧光定量PCR仪器(ABI7500)上，使用结核分枝杆菌特异性的靶标IS6110基因、IS1081基因，以及人内参基因GAPDH，评价是否有效提取目的基因核酸，以及相对浓度。

实验结果扩增图谱见图2，扩增Ct值见表1。

表1样品扩增Ct值

结果表明：1、本发明的提取装置和配套试剂可以有效提取痰液样本，对3例结核分枝杆菌阳性痰液样本提取的核酸中，均检测到结核分枝杆菌特异性基因。2、本发明使用的配套试剂优于市场上其他的提取试剂，尤其是对样本中目的病原体(如结核分枝杆菌)基因的提取。在不同浓度痰液样本中，本发明试剂目的基因(IS6110、IS1081)的平均Ct值均明显比对照试剂提前。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利采用范围，即凡依本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。