ISLR蛋白作为肝纤维化作用靶点的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体涉及一种ISLR蛋白作为肝纤维化作用靶点的应用。

背景技术

肝纤维化(liver fibrosis)是可逆的伤口愈合反应，特征是在肝损伤后细胞外基质(ECM)的积累。如果损伤是急性且短暂的话，这些变化是暂时的，肝脏结构最终会恢复到正常状态。然而，如果损伤持续，这些慢性炎症和ECM会持续积累，并最终导致疤痕组织替代肝实质(Roehlen et al.,2020)。这一过程导致肝硬化，当肝纤维化进展为肝硬化时会导致严重的发病率和死亡率。尽管有许多治疗方法可用，但肝纤维化仍然是一个严重的医疗问题。目前，肝纤维化的治疗局限于对症治疗和支持性治疗，缺乏有效的治疗手段(Schaffnerand Poper,1963)。因此，寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。研究表明，TGFβ1的蛋白水平与肝纤维化的严重程度和生存率相关。因此，降低TGFβ1的蛋白水平可能成为肝纤维化治疗的新策略。

ISLR是一个富含亮氨酸重复序列和Ig样区域的特殊蛋白质，可以在溶液或细胞中与其他蛋白质粘附，结合并发挥后续作用。并且已经有报道指出ISLR可以抑制心脏中间充质干细胞向成纤维方向的分化(Hara et al.,2019)，然而其在肝纤维化中的作用仍不确定。本研究旨在阐明ISLR在小鼠肝纤维化中的作用和机制，并提供一种在临床应用上具备前景的、新颖的肝纤维化治疗剂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种ISLR蛋白作为肝纤维化作用靶点的应用。

较为完整的，本发明基于以下发现提出主要技术思路：

我们首次发现，肝脏中的蛋白质ISLR，其结构中含有亮氨酸重复序列(LRR)和Ig样区域。经实验室研究表明，在肝损伤模型动物中敲除ISLR能够有效降低肝脏中包括TGFβ1的水平，进而降低下游a-SMA和COL1α1的表达量，从而抑制肝脏中胞外基质的沉积，达到治疗肝纤维化的目的。因此ISLR蛋白是一个潜在的肝纤维化治疗的新靶点。基于此，我们

完成了本发明申请，具体有以下几个方面：

较为具体地，本发明第一方面提供了一种ISLR蛋白的抑制剂在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

其中，所述ISLR蛋白的抑制剂选自ISLR蛋白的抗体和/或ISLR蛋白的结合蛋白。

其中，所述蛋白抑制剂的调控机理是通过降低包括TGFβ1的蛋白水平，进而降低下游a-SMA和COL1α1的表达量，从而抑制肝脏中胞外基质的沉积。

其中，所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为ISLR蛋白的抑制剂。

较为具体地，本发明第二方面提供了一种ISLR基因的抑制剂在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

其中，所述ISLR基因的抑制剂选自ISLR基因特异性的RNAi、ISLR基因特异性的microRNA、或抑制ISLR基因启动子的抑制剂中的一种或多种，以及抑制ISLR蛋白合成的阻断剂和干扰素。

其中，所述基因抑制剂的调控机理是通过降低包括TGFβ1的蛋白水平，进而降低下游a-SMA和COL1α1的表达量，从而抑制肝脏中胞外基质的沉积。

其中，所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为ISLR基因的抑制剂。

较为具体地，本发明第三方面提供了一种预防和/或治疗肝纤维化的药物，其中，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：ISLR蛋白的抑制剂和/或ISLR基因的抑制剂；

所述ISLR蛋白的抑制剂选自ISLR蛋白的抗体和/或ISLR蛋白的结合蛋白；

所述ISLR基因的抑制剂选自ISLR基因特异性的RNAi、ISLR基因特异性的microRNA、或抑制ISLR基因启动子的抑制剂中的一种或多种。

较为具体地，本发明第四方面提供了一种体外非治疗性抑制肝纤维化的方法，其中，在肝脏的类器官培养或普通的细胞培养过程中，在ISLR蛋白抑制剂或ISLR基因抑制剂存在的条件下，对于细胞炎症，胞外基质的累积以及肝纤维化的发生有抑制作用；

所述ISLR蛋白的抑制剂选自ISLR蛋白的抗体和/或ISLR蛋白的结合蛋白；

所述ISLR基因的抑制剂选自ISLR基因特异性的RNAi、ISLR基因特异性的microRNA、或抑制ISLR基因启动子的抑制剂中的一种或多种。

需要说明的是，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药途径等。

综上所述，本发明主要具有以下有益效果：

1、ISLR是一种鲜有报道的蛋白质，本发明提供了肝纤维化的新的治疗靶点，该靶点具有潜在的治疗肝纤维化的潜力。在本研究中，敲除ISLR能够有效降低TGFβ1的蛋白水平，从而抑制胞外基质的积累，进而改善肝纤维化。从而为本领域提供了一种新颖的肝纤维化治疗剂，具有临床应用前景。

2、敲除ISLR能够降低包括TGFβ1的蛋白水平，导致TGFβ1下游的信号a-SMA和COL1α1的蛋白水平降低，进而发挥的抗肝纤维化的作用。

3、探索了ISLR敲除质粒的治疗意义。

4、同时未来我们还将探索ISLR抑制剂与其他治疗肝纤维化的药物的联合应用，以提高治疗效果。

因此，本申请所提到的ISLR有望成为治疗肝纤维化的新靶点，为肝硬化患者提供一种新的治疗方案。

附图说明

图1随着四氯化碳损伤时间的延长，小鼠肝脏中ISLR的蛋白水平下调表达的电泳图。

图2随着胆管结扎时间的延长，小鼠肝脏中ISLR的蛋白水平下调表达的电泳图。

图3为动物模型上评估ISLR对肝纤维化的治疗潜力的技术路线图。

图4为四氯化碳损伤后敲除ISLR下调TGFβ1的蛋白水平表达的电泳图。

图5为胆管结扎后敲除ISLR下调COL1α1的蛋白水平表达的电泳图。

图6为四氯化碳损伤后敲除ISLR下调COL11α1、a-SMA和COL1α1的蛋白水平表达电泳图。

图7为马松染色结果显示，四氯化碳损伤后，ISLR小鼠肝脏的纤维化沉积减弱。

图8为血清ALT检测结果显示，四氯化碳损伤后，ISLR敲除小鼠的肝功能强于对照组。

图9血清AST检测结果显示，四氯化碳损伤后，ISLR敲除小鼠的肝功能强于对照组。

图10为未损伤组、四氯化碳损伤组中对照和敲除小鼠的肝实质细胞数量对比图。

图11为未损伤组、四氯化碳损伤组中对照和敲除小鼠的肝实质细胞数量对比统计图。

图12为四氯化碳损伤后，通过尾静脉注射ISLR敲除质粒的小鼠活体取材图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本研究自主设计ISLR全身性敲除小鼠，并对对照和敲除小鼠进行四氯化碳(SIGMA)腹腔注射造模和胆管结扎造模。确认小鼠的肝脏分别通过这两种方法成功发生纤维化后，通过Wester Blot(Thermo Fisher Scientific)检测对照和敲除小鼠中纤维化相关指针蛋白的表达量变化；通过马松染色(北京索莱宝科技有限公司)检测对照和敲除小鼠中纤维化的严重程度；通过血清AST和ALT检测(武汉赛维尔生物科技有限公司)，确认对照和敲除小鼠肝功能损伤程度的差异；通过HE染色比较对照和敲除小鼠肝细胞的增殖能力的差异；通过尾静脉向肝纤维化小鼠注射ISLR敲除质粒，探究ISLR对于肝纤维化的治疗潜力。通过以上实验探究了ISLR对TGFβ1蛋白水平的影响，并评估其对肝纤维化的治疗潜力。

目标一：研究ISLR对TGFβ1的蛋白水平的影响。以及对TGFβ1的下游信号a-SMA和COL1α1的影响。ISLR的核苷酸序列参照序列表。

目标二：评估ISLR对肝纤维化的治疗潜力。我们将使用四氯化碳(carbontetrachloride,CCL4)损伤肝纤维化模型和胆管结扎(bileduct ligation,BDL)肝纤维化模型来评估ISLR对肝纤维化的治疗潜力。

实施例1：

1)四氯化碳肝纤维化动物模型的建立及TGFβ1蛋白质表达量的检测

选择遗传背景一致的3月龄野生小鼠，应用溶剂为玉米油，浓度为50％的四氯化碳对小鼠进行腹腔注射。按照一周两次的注射频率，持续注射六周后即可进行样本的收集。随后提取肝脏组织的蛋白，对TGFβ1蛋白质表达量进行检测。

2)BDL肝纤维化动物模型的建立及TGFβ1蛋白质表达量的检测

BDL肝纤维化动物模型的建立：通过打开腹腔，于肝脏和肠道的连接处找到胆管，用不可吸收的缝合线于胆管的两处不同位置进行结扎，后缝合胸腔。分别于手术7天、14天、21天后，提取肝脏组织的蛋白，进行TGFβ1蛋白质表达量的检测。

3)ISLR的蛋白水平在肝纤维化模型中下调表达

参照图1和图2所示，在野生型小鼠肝脏中，当分别进行四氯化碳腹腔注射损伤和胆管结扎后，ISLR的蛋白水平下调；说明ISLR蛋白表达量变化响应肝脏的纤维化，ISLR可能是治疗肝纤维化的潜在靶点。

实施例2

1)在四氯化碳肝纤维化动物模型上评估ISLR对肝纤维化的治疗潜力

参照图3所示，选择遗传背景一致的3月龄对照和ISLR敲除小鼠，应用溶剂为玉米油，浓度为50％的四氯化碳对小鼠进行腹腔注射。按照一周两次的注射频率，持续注射六周后即可进行对照组和敲除组样本的收集。随后提取肝脏组织的蛋白，对TGFβ1、a-SMA和COL1α1蛋白质表达量进行检测，同时通过马松染色、HE染色以及血清检测评估ISLR对肝纤维化的影响。

1.1)敲除ISLR下调TGFβ1、a-SMA和COL1α1的蛋白水平

参照图4-6所示，在同时进行四氯化碳损伤后，与对照组相比，当敲除ISLR后，TGFβ1，a-SMA和COL1α1的蛋白水平下调表达；并且小鼠进行BDL手术后，敲除组中的COL1α1蛋白水平也下调表达。已有文献报道(Devaraj etal.,2022)，TGFβ1，a-SMA和COL1α1蛋白水平的增加，使肝脏中胞外基质沉积增加，进而导致肝纤维化的发生。所以，敲除ISLR可以降低TGFβ1，a-SMA和COL1α1蛋白水平，发挥抵抗纤维化作用。

1.2)动物模型上敲除ISLR抵抗四氯化碳诱导的肝纤维化

1.2.1)敲除ISLR后可抵抗四氯化碳所诱导的胞外基质的增加

参照图7所示，用四氯化碳损伤对照和敲除小鼠6周后，敲除组的马松染色结果显示胞外基质沉积显著降低。

1.2.2)敲除ISLR抵抗四氯化碳所诱导的肝功能的降低

参照图图8和图9所示，用四氯化碳损伤对照和敲除小鼠6周后，敲除组的ALT,AST指标显著低于对照组，说明敲除组的整体肝功能强于对照组。

1.2.3)与对照组相比，敲除ISLR组在四氯化碳损伤后肝实质细胞数量增多

参照图10、11所示，用四氯化碳损伤对照和敲除小鼠6周后的HE染色，敲除组在四氯化碳损伤后肝实质细胞数量增多，表示细胞损伤修复进程加快，进说明敲除ISLR后抵抗四氯化碳所诱导肝损伤。

实施例3：

1)在四氯化碳小鼠模型中，利用ISLR敲除质粒检测ISLR的治疗潜力

参照图3所示，选择遗传背景一致的3月龄野生型小鼠，分为两组，将质粒溶解于生理盐水中。其中一组尾静脉注射GFP过表达质粒，另外一组尾静脉注射ISLR敲除质粒和GFP过表达质粒。一周后收样，提取蛋白进行a-SMA和COL1α1的表达量检测，同时通过马松染色、HE染色以及血清检测评估ISLR的治疗潜力。

2)尾静脉注射ISLR敲除质粒抵抗四氯化碳诱导的肝纤维化

参照图12所示，对照组尾静脉注射GFP过表达质粒，治疗组尾静脉注射ISLR敲除质粒和GFP过表达质粒。收样后显示，注射ISLR敲除质粒后缓解了肝脏的损伤程度。

综上，本申请研究涉及一种肝脏中的蛋白质ISLR，其结构中含有亮氨酸重复序列(LRR)和Ig样区域。经实验室研究表明，在肝损伤模型动物中敲除ISLR能够有效降低肝脏中TGFβ1的水平，进而降低下游a-SMA和COL1α1的表达量，从而抑制肝脏中胞外基质的沉积，达到治疗肝纤维化的目的。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

参考文献

1.Hara,A.,Kobayashi,H.,Asai,N.,Saito,S.,Higuchi,T.,Kato,K.,Okumura,T.,Bando,Y.K.,Takefuji,M.,Mizutani,Y.,et al.(2019).Roles of the MesenchymalStromal/Stem Cell

Marker Meflin in Cardiac Tissue Repair and the Development ofDiastolic Dysfunction.

Circulation research 125,414-430.

2.Roehlen,N.,Crouchet,E.,and Baumert,T.F.(2020).Liver Fibrosis:Mechanistic Concepts

and Therapeutic Perspectives.Cells 9.

3.Schaffner,F.,and Poper,H.(1963).Capillarization of hepaticsinusoids in man.

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4.Devaraj,E.,Perumal,E.,Subramaniyan,R.,and Mustapha,N.(2022).Liverfibrosis:Extracellular vesicles mediated intercellular communication inperisinusoidal space.Hepatology(Baltimore,Md)76,275-285。