一种类器官组织消化液

技术领域

本发明属于类器官培养技术领域，涉及一种类器官组织消化液。

背景技术

类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。类器官培养是将从生物体获得的一部分组织经过处理后，再将其与基质胶混合进行3D培养所得。因此，如何高效、低损伤且具有较大广谱性的将细胞或细胞团完好的从组织中解离出来是类器官培养的重中之重。

目前使用较多的消化液多由单一胶原酶、金属盐、苯甲基磺酰氟(phenyl methanesulfonyl fluoride, PMSF)等配制而成。而仅仅使用单一胶原酶，使得可消化组织类型也变得狭窄，且消化力度不够，导致细胞获得率减少；而且在使用过程中胶原酶极易出现活性丧失，降低消化作用，严重的将导致无法实现对肿瘤细胞的消化分离。PMSF为有毒化合物，有较大的安全隐患。现有的消化酶溶液未添加缓冲物质和酶保护剂，使得整个消化酶体系的pH无法保持稳定，这也容易造成消化失败。

发明内容

针对目前类器官组织消化液中存在的问题，本发明提供一种类器官组织消化液，细胞获取率高且细胞具有较高的活性，各组分间协同作用，使得其消化效率高，对细胞损伤较小，污染率低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种类器官组织消化液，包括溶解于基础培养基的以下浓度的原料：

胶原酶Ⅳ 550-1100U/mL；

脱氧核糖核酸酶Ⅰ 75-225U/mL；

中性蛋白酶II 0.065-0.195U/mL；

透明质酸酶 12.375-20.625U/mL；

ROCK抑制剂 10-12.5μM；

氢化可的松 450-550ng/mL；

抗生素 0.1-1mg/mL；

表皮细胞生长因子（EGF） 50-60ng/mL；

牛血清白蛋白（BSA）1-3% (v/v)；

4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 10mM-20mM。

在上述组分的浓度范围内，所述类器官组织消化液可以消化多种正常组织和实体肿瘤组织，且消化速度优于现有商业化组织消化液；此外，相对商业化组织消化液，在上述浓度范围内的类器官组织消化液消化后的细胞或细胞团能够减少细胞损伤，提高细胞活率，增加类器官类器官形成几率。

在一些实施例中，所述ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂为azaindole 1、gsk269962a、at13148、gsk429286a、ripasudil、Y27632和hydroxyfasudil中的至少一种。

所述基础培养基可以根据消化对象的不同选择本领域已知的培养基。在一些实施例中，基础培养基为DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、MEM培养基、IMDM培养基、Ham’s F-12K培养基或RPIM1640培养基。

在一些实施例中，抗生素为青霉素、链霉素和Primocin

在一些实施例中，类器官组织消化液，包括溶解于培养基的以下浓度的原料：胶原酶Ⅳ 550U/mL，脱氧核糖核酸酶Ⅰ 150U/mL，中性蛋白酶Ⅱ 0.13U/mL，透明质酸酶20.625U/mL，ROCK抑制剂10μM，氢化可的松500ng/mL，抗生素100μg/mL，EGF 50ng/mL，BSA 1%（v/v），HEPES 10mM。

上述类器官组织消化液的配制可以采用本领域公知的方法进行配制，如，将各组分以适当溶剂溶解后分别加入到基础培养基，所述适当溶剂为对细胞无毒或低毒的良溶剂、缓冲溶液、培养基或水。在一些实施例中，溶剂为DMSO（二甲基亚砜）、PBS缓冲溶液、基础培养基。

上述类器官组织消化液，还可以根据具体消化的组织器官调节合适的pH值，在一些实施例中，pH为6.5-8，如，6.5、7.0、7.2、7.4、7.8、8，或者上述pH之间的任何数值。为了多数细胞的正常生长，pH为7.0-7.4。

本发明的组织消化液成分简单明确，使用BSA替代成分复杂的FBS，并且BSA含多种蛋白质、多肽和激素，促进细胞生长的同时还能稳定其他酶的活性，防止酶的分解和非特异性吸附到管壁上；使用的ROCK抑制剂可以减少细胞凋亡，可以保证组织在消化过程中依然可以具有较高的活性；EGF的加入可以促进细胞增殖和活性并使细胞形态保持较好，并能保证细胞的较高活性；不添加青链霉素双抗或两性霉素，而是采用的Primocin

本发明具有以下优点：

本发明所提供的组织消化液添加多种酶显著地提高了消化效率，减少消化时间；多种组分协同作用，保持组织在消化过程中依然可以具有较高的活性。该组织消化液可应用于多种组织器官的效果过程，消化时间短、消化后活性高。

附图说明

图1是不同组织消化液消化人结直肠癌、人胃癌组织和小鼠胰腺组织后的细胞图片；

图2是培养不同组织消化液消化人结直肠癌、人胃癌组织和小鼠胰腺组织后的细胞团图片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 类器官组织消化液的制备

根据表1配方1中的浓度、按照以下方法配制组织消化液：

S1、按照浓度要求取10mg氢化可的松粉末溶于1mL DMSO配置成氢化可的松母液，然后取10μL氢化可的松母液溶于90μL Advanced DMEM/F12中，配置成氢化可的松工作液；

S2、按照浓度要求用含有1%BSA的500μL无菌水溶解50μg EGF粉末，配置成EGF母液；

S3、于Advanced DMEM/F12培养基中依次加入胶原酶Ⅳ、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、中性蛋白酶、透明质酸酶、Y27632、氢化可的松工作液、Primocin

S4、将上述配置的组织消化液通过0.22μm滤膜过滤，得到无菌的组织消化液1。

表1 不同组织消化液的配制

按照同样的方法按照配方2和3配制组织消化液2-3。

应用例1 组织消化液对不同组织的消化

1. 不同组织的获取

人结直肠癌和人胃癌组织的获取均已签署知情同意书，手术切除/取样后于0-4℃的样本保存液中保存，于24h内进行组织消化。小鼠麻醉并引颈牺牲解剖获得胰腺组织。

2. 组织消化

S1：将获得的组织平分四份置于不同平皿中，用移液器向组织分别滴加1mL组织消化液1、2或3防止干燥，以市售组织消化液(伯桢生物，Cat. K601003)为对照；

S2：利用无菌剪刀将组织切碎成0.1mm

S3：用移液器将组织和消化液转移到15mL离心管中，再次向平皿中添加2-4倍组织体积的消化液，冲洗平皿后，继续转移至上述15mL离心管中；

S4：37℃下消化10-30min，每10min进行取样观察防止消化过度，当观察到较多单个细胞和70μm以下细胞团簇即可认为消化完全；

S5：消化完全后，加入2倍体积的Advanced DMEM/F12（含2%-5%FBS）终止消化，然后用100μm滤网过滤，并将滤液400g离心5min；

S6：离心结束后，缓慢吸取上清并丢弃，利用3mL Advanced DMEM/F12充分混匀下层细胞沉淀，得到细胞/细胞团悬液；

S7：从上述细胞/细胞团悬液中取20μL加入到EP管中，然后再加入20μL台盼蓝试剂混匀后，取20μL加入countstar计数板中，并插入countstar计数仪进行记数；

S8：将剩余细胞/细胞团悬液400g离心5min后，缓慢吸取上清并丢弃，即可得目的细胞/细胞团沉淀。

结果如表2和图1所示。

表2 不同组织消化液对人结直肠癌、人胃癌组织和小鼠胰腺组织的消化

经过上述实验得知，对同一组织相同大小和重量部分用不同消化液进行消化，添加透明质酸酶，会极大地提高细胞从组织消化解离出来的速度和数量，从而减少酶与细胞接触时间，减少细胞损伤，提高细胞活率，增加类器官类器官形成几率。另一方面，氢化可的松的添加具有抗氧化功能，可以提高细胞活性，增大类器官类器官形成几率。

3. 类器官培养

S1：向消化所得的细胞/细胞团沉淀中加入适量的基质胶，并轻缓混匀；

S2：按照50μL/孔将上述基质胶混合物快速接种到24孔板上，并静置3min；

S3：将上述24孔板倒置于37℃培养箱中孵育20min；

S4：取出上述24孔板，每孔加入500μL类器官培养基，然后放入二氧化碳培养箱，37℃，5%CO

S4、将上述配置的组织消化液通过0.22μm滤膜过滤，得到无菌的组织消化液1。

将培养后获得的不同组织的类器官在10×物镜下进行镜检，并统计细胞团数量，结果如表3和图2所示。

表3 人结直肠癌、人胃癌组织和小鼠胰腺组织消化后细胞成团率

经过上述实验得知，添加透明质酸酶，会减少酶与细胞接触时间，防止细胞团被解离成单个细胞，大量细胞团会提高类器官形成速度。