MOTS-c在制备改善卵母细胞和早期胚胎质量药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及MOTS-c在制备改善卵母细胞和早期胚胎质量药物中的应用。

背景技术

肥胖会导致月经失调，卵子质量下降，不排卵甚至不孕，并显著增加了流产、死产和致胎儿畸形的风险。如何改善肥胖和高龄妇女的生育问题成了女性生殖健康的难题。

卵子质量和早期胚胎发育异常是导致生育缺陷的重要源头，可用卵子数量不足是影响肥胖患者生育的重要因素之一。目前，通过控制饮食和加强锻炼是改善肥胖和高龄女性卵子质量和数量的主要途径，但效果极其有限。临床上急需可增加肥胖患者卵子数量和质量，以及改善胚胎发育的技术和方案。

MOTS-c是由线粒体产生的一种内源性多肽，其氨基酸序列为MRWQEMGYIFYPRKLR，最初在2015年的研究中被发现。研究表明，MOTS-c能够增加脂肪氧化、改善胰岛素敏感性、抑制脂肪堆积和降低血糖水平。它还可以通过调节线粒体功能、抗氧化应激和抗炎作用来发挥保护细胞和组织的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供MOTS-c在制备改善卵母细胞和早期胚胎质量药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

第一个方面，本发明提供MOTS-c在制备药物中的应用，所述药物为改善肥胖患者卵母细胞和胚胎发育质量的药物。

在一些实例中，所述MOTS-c在制备促进H3K4me3组蛋白修饰的擦除的药物中的应用。

在一些实例中，所述MOTS-c在制备促进早期胚胎合子基因组激活的药物中的应用。

在一些实例中，所述药物为注射制剂。

第二个方面，本发明提供一种改善肥胖患者生育力的药物组合物，包含第一个方面所述的MOTS-c及其衍生物。

在一些实例中，所述药物组合物为液体剂型。

在一些实例中，所述MOTS-c在药物组合物中的浓度为0.04～0.06mg/mL。

在一些实例中，所述MOTS-c在药物组合物中的浓度为0.05mg/mL。

在一些实例中，所述药物组合物还包括药学上可接受、适合医药用途的赋形剂、载体、保护剂。

在一些实例中，所述MOTS-c的氨基酸序列为：MRWQEMGYIFYPRKLR或该序列的保守替代序列。

本发明的有益效果是：

本发明发现进行MOTS-c以及其衍生物的注射，可获得更多的卵子，并改善卵母细胞和胚胎发育质量，以恢复肥胖患者的生育或增加临床上的辅助生殖的成功率，MOTS-c及其衍生物具备制备改善肥胖患者生育情况药物的潜在价值。

附图说明

图1为腹腔注射MOTS-c对肥胖小鼠卵母细胞成熟，即排极体的影响。

图2为腹腔注射MOTS-c对肥胖小鼠胚胎H3K4me3擦除的影响。

图3为腹腔注射MOTS-c对肥胖小鼠胚胎的胚胎基因组激活的影响。

图4为腹腔注射MOTS-c对肥胖小鼠胚胎活性氧的影响。

图5为腹腔注射MOTS-c对肥胖小鼠胚胎囊胚发育率的影响。

具体实施方式

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。

实施例

1)建立肥胖小鼠模型

SPF级ICR小鼠，雌性，断乳3周开始饲养。检疫合格后，随机分为空白对照组(Normal Diet，ND)、高脂饮食组(High-Fat Diet，HFD)。其中空白对照组喂养普通饲料，高脂饮食组用糖、脂肪和蛋白质的热卡量分别为75％、12％和13％的饲料(上海起福D12492)喂养。喂养至3月龄后，体重比同龄对照组小鼠增加20％以上，则视为肥胖模型造模成功。

2)药物处理

将高脂饮食组分为两组：一组为普通实验组，继续进行高脂饮食饲喂；一组为MOTS-c实验组，按0.1mL/10g体重的体积，对其腹腔进行MOTS-c注射(浓度0.05mg/mL)。持续实验两个月后，恢复为普通饲料，并停止MOTS-c的注射，接下来对其母细胞数量和胚胎质量进行检测。

3)卵母细胞和胚胎获取

为了获取卵母细胞和胚胎，对雌性小鼠进行腹腔注射绒毛膜促性腺激素(PMSG，宁波动物激素厂)，剂量为5IU/10g体重。48小时后对小鼠进行腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG，宁波动物激素厂)，剂量为5IU/10g体重。若获取胚胎，则与雄鼠合笼，并通过观察是否有阴道栓形成来检查交配是否成功，若获取卵母细胞，则与雌鼠一起饲养。在HCG注射后18小时，通过断颈处死小鼠，从输卵管中获取卵母细胞或合子，计数并将其培养在KSOM培养基(Merck Milipore公司)中，进行后续实验。

4)H3K4me3检测

卵母细胞和早期胚胎放入酸性台氏液中，镜下观察透明带情况，透明带变薄消失后迅速移出并在培养液中洗涤3遍。后续免疫荧光染色操作步骤如下：

4％PFA固定液做滴，移入卵母细胞或胚胎，放于湿盒中，室温20分钟；

洗液洗涤，放于湿盒中，室温1次×5min；

0.3％TritonX-100透膜液做滴，移入卵母细胞或胚胎，放于湿盒中，室温20分钟；

洗液洗涤，放于湿盒中，室温1次×5min；

封闭液做滴，移入卵母细胞或胚胎放于湿盒中，室温60分钟，或4℃过夜封闭；

孵育一抗，按照一抗说明书推荐的比例，用封闭液稀释抗体后做滴，移入卵母细胞或胚胎放于湿盒中，室温120分钟，或4℃过夜孵育；

一抗洗涤，放于湿盒中，室温5次×5min；

孵育二抗，选择相应二抗，按照一抗说明书推荐的比例，用封闭液稀释抗体后做滴，移入卵母细胞或胚胎，放于湿盒中，室温120分钟，或4℃过夜孵育；

二抗洗涤，放于湿盒中，室温避光5次×5min；

Hoechst染核，Hoechst按说明书用洗液稀释，过滤或离心。做滴，移入卵母细胞或胚胎，放于湿盒中，室温孵育1小时，或4℃过夜孵育；

封片，荧光共聚焦显微镜显像。

5)活性氧检测

本研究采用碧云天生物技术公司提供的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)检测试剂盒，其原理是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。DCFH-DA不能自发荧光，其分子属性可自由穿过细胞膜结构，被细胞中存在的酯酶水解生成DCFH。水解代谢产物DCFH不能穿过细胞膜而装载在细胞内。细胞内的活性氧如ROS等可以将无荧光的DCFH氧化成有荧光的DCF。因此检测DCF的荧光强度就可以反映细胞内活性氧水平。具体实验步骤如下：

试剂稀释：用无血清培养液，按照1:1000的比例稀释DCFH-DA成工作液，浓度10μmol/L；

工作液做成体积约为30μL的液滴，覆盖矿物油；

将卵母细胞用口吸管移入液滴，放入37℃，5％CO

将卵母细胞移出工作液，在培养液中洗涤2次，每次5分钟；

移入培养滴，在荧光共聚焦显微镜下选择相应波长激发光成像。

以上操作步骤均需注意避光。

6)早期胚胎中的转录激活检测

细胞培养液中加入尿嘧啶核苷类似物5-乙炔基尿苷(5-ethynyl uridine，EU)，在RNA转录时期，EU代替尿嘧啶(U)参与RNA分子合成。通过检测EU的掺入情况可说RNA的转录情况。本研究中使用碧云天公司提供的Cell-LightTM Apollo Stain Kit试剂盒，检测早期胚胎转录水平。操作步骤如下：

KSOM将EU稀释成1×浓度工作液，做液滴覆盖矿物油并于37℃，5％CO2培养箱中平衡1小时；

胚胎移入平衡完成的液滴，培养2小时；

细胞固定，4％PFA固定液做滴，移入卵母细胞或胚胎，室温固定20分钟；

洗液洗涤，避光室温1次×5min；

0.3％TritonX-100通透液做滴，移入卵母细胞或胚胎，室温透膜20分钟；

洗液洗涤，室温2次×5min；

1X

洗液洗涤，避光、室温2次×5min；

Hoechst染核，Hoechst工作液做滴，避光、室温孵育1小时；

封片，荧光共聚焦显微镜显像。

结果分析

在卵子的发育过程中，原始的卵母细胞会经历两次减数分裂，第一极体是在第一次减数分裂中形成的，它的染色体数量减半，成为一个极小的细胞排出在卵母细胞之外，第一极体的排出代表卵母细胞的成熟，可以指征卵母细胞的发育质量。从图1中可以看出，对小鼠进行MOTS-c注射后，极体的排出得到显著改善。

H3K4me3是一种表观遗传学修饰，它指的是在染色质中的特定位置上存在的一种化学标记。在这种修饰中，一个甲基基团(me3)被添加到染色质蛋白质H3的第4位赖氨酸残基上。H3K4me3是一种常见的组蛋白修饰，对基因表达的调控起着重要的作用。在胚胎早期发育阶段，胚胎需要将从卵母细胞和精子中继承过来的H3K4me3进行擦除，从而启动受精卵基因组的激活。H3K4me3擦除是胚胎能够正常发育下去的重要条件，一定程度上可代表胚胎的发育质量。从图2中可以看出，肥胖影响H3K4me3的擦除，而腹腔注射MOTS-c后可显著改善肥胖小鼠胚胎的H3K4me3，表明MOTS-c具有改善小鼠胚胎表观遗传的潜力。

ZGA指合子基因组激活，是指在胚胎发育过程中，从受精卵到胚胎自身基因表达开启的转变。在早期胚胎发育阶段，受精卵中的发育主要依赖于母源RNA和蛋白质的储备，而胚胎自身的基因表达非常有限。随着胚胎发育的进行，ZGA标志着胚胎基因组的激活，胚胎开始依赖自身合成RNA和蛋白质来支持发育，因此，常用早期胚胎的转录水平来代表早期胚胎基因组激活情况。同H3K4me3擦除，ZGA是胚胎能够正常发育下去的重要条件，一定程度上可代表胚胎的发育质量。从图3中可以看出，肥胖可影响早期胚胎基因组的激活，对小鼠进行MOTS-c注射后，小鼠胚胎基因组的激活得到显著改善，表明MOTS-c具有帮助肥胖患者改善其胚胎发育过程中胚胎基因组激活的潜力。

活性氧浓度增加，其氧化性可损伤细胞内的氧化还原环境，对膜蛋白的还原性氨基酸残基进行氧化性修饰，改变其结构功能，使膜结构功能失活，结构不稳定，胞质骨架蛋白坍塌，进而导致胞质碎裂。从图4中可以看出，肥胖导致小鼠胚胎中的活性氧增加，而对小鼠进行MOTS-c的腹腔注射后，可以有效降低肥胖小鼠胚胎活性氧的产生。

从图5中可以看出，腹腔注射MOTS-c后，能够显著恢复肥胖小鼠胚胎囊胚发育率。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。