CsWS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜果实贮藏中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CsWS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜果实贮藏中的应用。

背景技术

黄瓜(cucumis sativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(cucumis)一年蔓生的草本植物。黄瓜具有产量高、效益好等特点，是世界十大重要的蔬菜作物之一。黄瓜果实含水量高达98％以上、组织脆嫩、生理代谢活跃，果皮易褪绿黄化、变硬，果肉腐烂，是一种较难贮藏的果菜([1]孙情,杨炎,罗冬兰,巴良杰.黄瓜采后贮藏保鲜技术研究进展.南方农业2018,12:54-55.[2]Patel C.and Panigrahi J.Starch glucose coating-inducedpostharvest shelf-life extension of cucumber.Food Chem.2019,288:208-214.)。

高湿、高温生长条件极易改变黄瓜植株的蒸腾状况和水分养分吸收速率，影响果实细胞壁果胶和角质层形成等，减弱细胞稳定性和细胞壁强度，降低黄瓜贮藏性，严重影响采后贮藏保鲜和运输销售。

不同黄瓜品种间贮藏性差异显著，通常果皮颜色较深、刺瘤较少、果实硬度大、果皮厚的黄瓜果实较耐贮藏。除此之外钙在控制瓜果的营养品质和耐贮藏方面具有非常重要的作用(周卫,汪洪.植物钙吸收、转运及代谢的生理和分子机制.植物学通报,2007,24:762-778.关军锋.钙与果实生理病害和耐贮藏性.中国工程科技论坛144场暨第四届国际苹果学术研讨会,09/2012.)。

外源钙喷施在瓜果表面不仅可以保持其品质不变而且还可延长其贮藏性。如外源喷施钙可以提高葡萄果实硬度，延长贮藏时间(管雪强,杨阳,王恒振,郭成士,关军锋.喷钙对红地球葡萄果实钙、果胶含量和品质的影响.植物营养与肥料学报2014,1:179-185.)，表面涂抹钙制剂可以有效提高黄瓜耐贮藏性、延长货架保质期(张继武,付莹.钙制剂涂膜黄瓜保鲜的研究.食品工业科技2007,7:189-191.)，钙还可以与果胶形成果胶钙桥、强化细胞壁结构。

发明内容

本申请团队前期通过EMS诱变获得一个黄瓜弱贮藏性突变体Csws1，其表现为黄瓜果皮黄绿色、果实硬度低和果皮钙含量减少，相对于对照WT高温条件下表现出果实失水快且果皮易褪绿发黄，基因敲除也进一步验证此表型。

本发明首先提供了CsWS1基因或其编码的蛋白在调控黄瓜果实贮藏中的应用。

优选的，所述调控果实贮藏体现在延长黄瓜果实高温条件下的贮藏时间。

所述CsWS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。CsWS1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明又提供了一种果实耐贮藏的黄瓜种质筛选方法，通过检测黄瓜中CsWS1基因的表达量，选择CsWS1基因表达量高的黄瓜种质进行培育。CsWS1基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明还提供了一种果实耐贮藏的转基因黄瓜培育方法，将黄瓜中CsWS1基因进行过表达。CsWS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过筛选发现了黄瓜CsWS1基因与黄瓜果实贮藏相关，黄瓜突变体商品果实较‘649’(WT)贮藏期显著缩短。该基因能够应用于筛选耐贮藏黄瓜果实，延长黄瓜商品果实货架期。

附图说明

图1为黄瓜野生型植株649和突变体Csws1贮藏变化图；其中图1a，图1b为黄瓜高代自交系植株649和突变体Csws1商品果实；图1c为649和突变体采摘后每天失水率统计图，图1c中的数据为平均值±SD(n＝5)；图1d为WT和Csws1突变体商品果实硬度测定统计图，图1d中的数据为平均值±SD(n＝15)。*表示Csws1突变体与对照649比较差异有统计学意义(**P<0.01by ANOVA test)。

图2为CsWS1启动子的组织驱动特性分析结果图，其中，图2a为ProCsWS1:GUS酶切位点图谱；图2b为阴性对照WT；图2c为ProCsWS1:GUS阳性转基因苗。

图3为pCBSG015质粒图谱。

图4为基因敲除Cs WS1基因靶点的示意图和CsWS1基因中的Target 1和Target 2测序检测示意图，*代表终止密码子。

图5为黄瓜CsWS1基因敲除贮藏变化图；其中图5a，5b，5c为黄瓜植株KT和以KT为背景CsWS1基因敲除株系商品果实；图5d为WT和突变体采摘后每天失水率统计图，图5d中的数据为平均值±SD(n＝5)；图5e为KT和CsWS1基因敲除株系商品果实硬度测定统计图，图5e中的数据为平均值±SD(n＝15)。*表示KT和以KT为背景CsWS1基因敲除株系比较差异有统计学意义(*P<0.05，**P<0.01by ANOVA test)。

图6为果皮渗透性分析结果图，其中，图6a为649与Csws1突变体商品果实甲苯胺蓝渗透48h表型图，图6b为KT和CsWS1基因敲除纯合株系CsWS1-CR#1和CsWS1-CR#7商品果实甲苯胺蓝渗透48h表型图。

图7为果实钙含量检测结果图，其中，图7a为野生型649和突变体Csws1开花0d果实钙含量测定、图7b为KT和CsWS1基因敲除纯合株系CsWS1-CR#1开花0d果实钙含量测定。图7a，7b中的数据为平均值±SD(n＝3)，*表示两组数据比较差异有统计学意义(**P<0.01byANOVA test)。

具体实施方式

黄瓜高代自交系‘649’原始取得为东北农业大学赠送，获取时间2013年9月。

实施例1

控制黄瓜商品果实贮藏性SNP位点的发现及贮藏表型变化。

利用2％的EMS诱变剂(v/v，甲基磺酸乙酯)对黄瓜高代自交系欧洲温室型水果黄瓜‘649’进行诱变，并从诱变体库中筛选获得一株稳定遗传的黄瓜弱贮藏性突变体WeakStorage‘Csws1’，通过mutmap和KASP基因分型等方法定位于2号染色体的CsWS1基因，该基因的野生型碱基序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在相对温度为37℃和相对湿度为56％RH贮藏条件下，选取开花后10天(d)的野生型及突变体商品果实进行贮藏试验，随着贮藏期延长，可以明显观察到突变体Csws1果实果面在4天时开始褪绿发黄，并且花萼端开始发黄萎蔫；而野生型649果实果面在6天时花萼端才有这种现象(图1a和b)。

图1c为野生型649和突变体采摘后每天失水率统计图。贮藏1天起突变体Csws1单果失水百分比显著高于野生型649失水，近乎约为其二倍，此后随着贮藏期延长突变体每天失水量显著高于649，贮藏7天时突变体Csws1平均单果失水约为33.2％，野生型649单果仅为22.6％(图1c)。

果实硬度也是影响贮藏的因素之一，图1d为野生型649和Csws1突变体商品果实硬度测定统计图，图1d的果实采用称重法记录采摘0-7天内每天果实失水量相对百分比。对采摘当天商品果实硬度测定发现突变体Csws1果实硬度显著低于野生型649(图1d)。

实施例2

CsWS1启动子的组织驱动特性分析。

克隆CsWS1启动子序列2000bp(序列如SEQ ID NO.3所示)，在CsWS1启动子的5'和3'端分别添加酶切位点HindIII和XbaI，通过双酶切将CsWS1启动子连接PU6gRNA载体中，获得CsWS1启动子驱动GUS报告基因表达的载体ProCsWS1:GUS(图2a)。GUS染色结果显示，对照果实透明且不能被GUS染液染色(图2b)，ProCsWS1:GUS果实可被染成蓝色(图2c)，着色的部位除维管束和部分果肉外，在果皮的蓝色最深，说明CsWS1基因在果皮能特异表达，进而影响果实耐贮藏性。

实施例3

CsWS1基因敲除导致果实易失水、贮藏性减弱。

为了进一步验证CsWS1基因突变导致黄瓜果实贮藏性降低，通过CRISPR/Cas9技术对黄瓜“凯特98”(KT)品种(寿光市凯特种业有限公司)遗传转化，植物表达载体为pCBSG015(图3)，基因敲除针对的靶点为双靶点，序列为：

(1)CCAATGTTAAGAAAGGGCCATGG；

(2)TGTAGTCTCTATGTTAGTATTGG。

获得两个编辑纯合株系CsWS1-CR#1和CsWS1-CR#7(图4)。

设置与野生型649和突变体Csws1相同的贮藏条件，由于与突变体Csws1黄瓜果实生态类型不同，两者果实发黄萎蔫部位也有所不同。CsWS1-CR#1在3天时首先从果把开始发黄，5天时果面全部褪绿发黄(图5b)；CsWS1-CR#7在4天时果把处开始萎蔫，在6天时果面整体褪绿发黄，7天时果把萎蔫处开始腐烂(图5c)；对照KT果实仅在6天时果把开始发黄，果实颜色变浅(图5a)。

图5d中的数据为平均值±SD(n＝5)。通过单果称重发现，两个敲除株系在2天时单果失水百分比与KT差异开始显著，且CsWS1-CR#1失水最快；7天时CsWS1-CR#1和CsWS1-CR#7相对失水百分比分别为32.9％和30.1％，KT单果失水18.7％(图5d)。除CsWS1敲除突变体与KT单果失水差异大之外，两个敲除株系采摘当天商品果实硬度也是显著低于KT(图5e)。

实施例4

Csws1突变体果皮渗透性分析。

不同黄瓜品种角质层差异会导致果实的贮藏性有所差异。为了验证CsWS1基因突变导致果实角质层发生变化，使用1％甲苯胺蓝溶液对突变体和敲除株系商品果实浸泡48h进而观察果实渗透性。通过对浸泡48h的野生型649和Csws1突变体果肉观察，可以明显的观察到突变体渗透性更强，果肉渗透到更多的甲苯胺蓝染液，而野生型649果肉中甲苯胺蓝染液较少(图6a)。

对CsWS1基因敲除两个株系也是观察到相同的结果，CsWS1-CR#1和CsWS1-CR#7果肉中渗透到更多的甲苯胺蓝染液，而对照KT很少有甲苯胺蓝染液渗透进去(图6b)这说CsWS1基因突变导致果实表面发生变化，影响果实的贮藏性。

实施例5

CsWS1突变体果实钙含量降低。

钙能与果胶形成果胶钙桥，钙具有稳定细胞膜、增强细胞壁等生物学功能，从而提高瓜果耐贮藏性。使用ICP-MS分析法检测Csws1突变体和敲除株系开花当天果实钙含量，WT果实中平均钙含量为15.67mg/g，Csws1果实中平均钙含量为7.13mg/g，突变体Csws1果实中的钙含量显著低于野生型WT(图7a)；KT果实中平均钙含量为13.18mg/g，CsWS1-CR#1敲除果实中平均钙含量为7.95mg/g，CsWS1-CR#1敲除果实中钙含量显著也是低于对照KT，这说明CsWS1基因突变会导致果实中钙含量下降，也是导致果实表现出弱贮藏性的一个因素(图7b)。