一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺

技术领域

本发明涉及一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺，属于胶原蛋白提纯技术领域。

背景技术

胶原蛋白是细胞外基质的最主要结构蛋白，是人体内含量最多的蛋白，存在于人体肌肉、肌腱和皮肤等组织中，在保护组织器官起着重要的作用。胶原蛋白于已在众多领域有广泛的应用。在皮肤衰老的过程中，补充胶原蛋白能够增加肌肤弹性，保持皮肤光滑柔软，起到美容抗衰的功效；在食品和保健方面，胶原蛋白常应用于生产制备香肠肠衣、食品添加剂和营养补充剂等；在医学上常用到手术缝合线、胶原蛋白海绵和生物活性物质的载体等生物材料，也是以胶原蛋白为原料制得。

据此，已有大量关于提取胶原蛋白的研究，目前胶原蛋白主要来源是猪、牛、羊等哺乳动物皮肤和骨骼等，提取手段主要包括碱法、酸法、酶法和盐法等方式。其中酶法常用的酶包括胃蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶等，该方法具有作用温和、反应速度快、底物水解快、无环境污染等优势。因胶原蛋白只能在酸性条件下溶解的特性，而胃蛋白酶在酸性条件下才有活性，使得酸加胃蛋白酶的提取方式成为有效的胶原蛋白提取方法，尤其是生产工艺中的低成本、高效率提取方式。提取中一般采用提高溶液pH值，使胃蛋白酶失活而终止酶切反应，同时析出胶原蛋白沉淀后进行固液分离。这种常规操作虽然可以控制胶原蛋白酶切的程度，但未有有效的手段去除胃蛋白酶，容易造成提取的胶原蛋白中存在胃蛋白酶残留，而市面上的胃蛋白酶基本提取自猪胃，从而造成生产提取的胶原蛋白存在新的病毒隐患风险，造成临床应用风险。

酶固定化主要途径是将酶封闭在一定的固定空间内，在能够发挥酶作用的同时做到能够回收利用。已有研究表明了固定化酶较普通酶储存时间更长、保持活力较高、易于分离回收，达到重复使用率高、降低成本的效果。

利用海藻酸钠对钙离子的敏感特性，制备海藻酸钙固定胃蛋白酶微球，应用到胶原蛋白生产提取工艺中，一方面，固定化胃蛋白酶仍能定点切断胶原端肽，得到分子质量较均一、具有三股螺旋结构的胶原蛋白；另一方面，能够通过快捷简便的离心或过滤方式将固定化胃蛋白酶微球与胶原蛋白分离开。因此本发明提供一种简单有效的去除胶原蛋白提取工艺中胃蛋白酶残留的方法，以改进胶原蛋白生产工艺、降低热源及病毒风险，以提高临床使用安全性。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺，采用将胃蛋白酶固定化后进行酶切反应，酶解后进行分离，以达到去除胃蛋白酶残留的目的。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺，包括下述内容：

S100：制备海藻酸钙胃蛋白酶微球；

S200：将海藻酸钙胃蛋白酶用于提取胶原蛋白。

前述的一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺中，所述步骤S200还包括以下内容：将猪皮块用脱脂液脱脂后盐洗，将猪皮块在乙酸溶液中浸泡，在乙酸溶液中加入海藻酸钙胃蛋白酶，酶解后去除溶液中海藻酸钙胃蛋白酶微球及其他固体杂质，得干净酶解液；将酶解液pH值调至7至8，析出胶原蛋白。

前述的一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺中，步骤S200具体包括以下步骤：

S210：将猪皮刮毛刮脂后，剪成小块，用脱脂液脱脂处理后，进行盐洗，盐洗后猪皮小块水洗干净；

S220：将步骤S210处理后猪皮小块泡入0.5M乙酸溶液中，浸泡12-36h，将浸泡后的猪皮小块均质匀浆，固液比为1:50～100；浸泡是为了更充分的破碎均浆，不然猪皮很难破碎完全。均浆越完全的猪皮胶原提取率越高。

S230：加入海藻酸钙胃蛋白酶微球，海藻酸钙胃蛋白酶微球质量与猪皮小块质量比为1:100～200，酶解温度为10-20℃，酶解时间为12-24h；酶解，用胃蛋白酶对胶原进行酶切，切除致敏性端肽。

S240：酶解结束后，将反应液离心或筛网过滤，去掉海藻酸钙胃蛋白酶微球及其他固体杂质，得干净酶解液；

S250：将步骤S240所得酶解液用氢氧化钠调节pH值到7～8，析出胶原蛋白沉淀，然后加入10％氯化钠溶液，盐析12-24h；

S260：盐析后胶原蛋白沉淀经离心后收取，水洗2遍，得无胃蛋白酶残留的去端肽胶原蛋白。

前述的一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺中，步骤S200具体包括以下步骤：

S210：将猪皮刮毛刮脂后，剪成5mm*5mm小块，用脱脂液脱脂处理后，加入盐洗，盐洗后猪皮小块水洗干净；

S220：将步骤S210处理后猪皮小块泡入0.5M乙酸溶液中，浸泡18h，将浸泡后的猪皮小块均质匀浆，固液比为1:67；

S230：加入海藻酸钙胃蛋白酶微球，海藻酸钙胃蛋白酶微球质量与猪皮小块质量比为1:100，酶解温度为12℃，酶解时间为15h；

S240：酶解结束后，将反应液离心或筛网过滤，去掉海藻酸钙胃蛋白酶微球及其他固体杂质，得干净酶解液；

S250：将步骤S240所得酶解液用氢氧化钠调节pH值到7，析出胶原蛋白沉淀，然后加入10％氯化钠溶液，盐析19h；

S260：盐析后胶原蛋白沉淀经离心后收取，水洗2遍，得无胃蛋白酶残留的去端肽胶原蛋白。

前述的一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺中，步骤S100包括以下内容：将海藻酸钠加入纯水溶解，制备得海藻酸钠溶液；在海藻酸钠溶液中加入不同质量的胃蛋白酶，获得海藻酸钠-胃蛋白酶溶液；将海藻酸钠-胃蛋白酶溶液滴加至氯化钙溶液，使海藻酸钙凝固成微球；去除融和液中杂质，得胃蛋白酶固定化微球。

前述的一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺中，步骤S100具体包括以下步骤：

S110：将海藻酸钠加入纯水溶解，制备得1％～4％浓度的海藻酸钠溶液；

S120：在海藻酸钠溶液中加入不同质量的胃蛋白酶，充分搅拌均匀并静置去除气泡，获得1mg/ml～3mg/ml浓度的海藻酸钠-胃蛋白酶溶液；

S130：将海藻酸钠-胃蛋白酶溶液滴加至0.5％～2.5％含量的氯化钙溶液中，静置使海藻酸钙凝固成微球，于4℃固化过夜；

S140：将步骤S130中溶液多余的氯化钙溶液去除，加入纯水静置洗涤3次，离心去除上清水溶液获得胃蛋白酶固定化微球。

前述的一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺中，步骤S100具体包括以下步骤：

S110：将海藻酸钠加入纯水溶解，制备得2％浓度的海藻酸钠溶液；

S120：在海藻酸钠溶液中加入不同质量的胃蛋白酶，充分搅拌均匀并静置去除气泡，获得1mg/ml浓度的海藻酸钠-胃蛋白酶溶液；

S130：将海藻酸钠-胃蛋白酶溶液滴加至1.5％含量的氯化钙溶液中，静置使海藻酸钙凝固成微球，于4℃固化过夜；

S140：将步骤S130中溶液多余的氯化钙溶液去除，加入纯水静置洗涤3次，离心去除上清水溶液获得胃蛋白酶固定化微球。

与现有技术相比，本发明固定化胃蛋白酶微球制作方式简单、操作简便且反应条件温和。在胶原蛋白提取过程中，能够有效剪切去除胶原蛋白致敏性端肽，并且能够通过简单的离心方式进行分离去除，达到提取的胶原蛋白中无胃蛋白酶残留的目的，制备出更适合临床应用的胶原蛋白材料。

附图说明

图1是固定化后的海藻酸钠胃蛋白酶微球外观图；

图2是实施例1使用固定化胃蛋白酶微球酶切制备的胶原蛋白质谱结果；

图3是实施例2使用固定化胃蛋白酶微球酶切制备的胶原蛋白质谱结果；

图4是实施例3使用固定化胃蛋白酶微球酶切制备的胶原蛋白质谱结果。

具体实施方式

本发明的实施例1：一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺，包括下述内容：

首先，S100：制备海藻酸钙胃蛋白酶微球。

制备海藻酸钙胃蛋白酶微球具体包括以下步骤：

S110：将海藻酸钠加入纯水溶解，制备得1％浓度的海藻酸钠溶液；

S120：在海藻酸钠溶液中加入不同质量的胃蛋白酶，充分搅拌均匀并静置去除气泡，获得1mg/ml浓度的海藻酸钠-胃蛋白酶溶液；

S130：将海藻酸钠-胃蛋白酶溶液滴加至0.5％含量的氯化钙溶液中，静置使海藻酸钙凝固成微球，于4℃固化过夜；

S140：将步骤S130中溶液多余的氯化钙溶液去除，加入纯水静置洗涤3次，离心去除上清水溶液获得胃蛋白酶固定化微球。

然后，S200：将海藻酸钙胃蛋白酶用于提取胶原蛋白。

采用海藻酸钙胃蛋白酶微球用于提取胶原蛋白具体包括下述步骤：

S210：将猪皮刮毛刮脂后，剪成5mm*5mm小块，用脱脂液脱脂处理后，加入盐洗，盐洗后猪皮小块水洗干净；

S220：将步骤S210处理后猪皮小块泡入0.5M乙酸溶液中，浸泡18h，将浸泡后的猪皮小块均质匀浆，固液比为1:100；

S230：加入海藻酸钙胃蛋白酶微球，海藻酸钙胃蛋白酶微球质量与猪皮小块质量比为1:100，酶解温度为12℃，酶解时间为15h；

S240：酶解结束后，将反应液离心或筛网过滤，去掉海藻酸钙胃蛋白酶微球及其他固体杂质，得干净酶解液；

S250：将步骤S240所得酶解液用氢氧化钠调节pH值到7，析出胶原蛋白沉淀，然后加入10％氯化钠溶液，盐析19h；

S260：盐析后胶原蛋白沉淀经离心后收取，水洗2遍，得无胃蛋白酶残留的去端肽胶原蛋白。

实施例2：一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺，包括下述内容：

首先，S100：制备海藻酸钙胃蛋白酶微球。

制备海藻酸钙胃蛋白酶微球具体包括以下步骤：

S110：将海藻酸钠加入纯水溶解，制备得4％浓度的海藻酸钠溶液；

S120：在海藻酸钠溶液中加入不同质量的胃蛋白酶，充分搅拌均匀并静置去除气泡，获得3mg/ml浓度的海藻酸钠-胃蛋白酶溶液；

S130：将海藻酸钠-胃蛋白酶溶液滴加至2.5％含量的氯化钙溶液中，静置使海藻酸钙凝固成微球，于4℃固化过夜；

S140：将步骤S130中溶液多余的氯化钙溶液去除，加入纯水静置洗涤3次，离心去除上清水溶液获得胃蛋白酶固定化微球。

然后，S200：将海藻酸钙胃蛋白酶用于提取胶原蛋白。

采用海藻酸钙胃蛋白酶微球用于提取胶原蛋白具体包括下述步骤：

S210：将猪皮刮毛刮脂后，剪成5mm*5mm小块，用脱脂液脱脂处理后，加入盐洗，盐洗后猪皮小块水洗干净；

S220：将步骤S210处理后猪皮小块泡入0.5M乙酸溶液中，浸泡18h，将浸泡后的猪皮小块均质匀浆，固液比为1:100；

S230：加入海藻酸钙胃蛋白酶微球，海藻酸钙胃蛋白酶微球质量与猪皮小块质量比为1:100，酶解温度为12℃，酶解时间为15h；

S240：酶解结束后，将反应液离心或筛网过滤，去掉海藻酸钙胃蛋白酶微球及其他固体杂质，得干净酶解液；

S250：将步骤S240所得酶解液用氢氧化钠调节pH值到7，析出胶原蛋白沉淀，然后加入10％氯化钠溶液，盐析19h；

S260：盐析后胶原蛋白沉淀经离心后收取，水洗2遍，得无胃蛋白酶残留的去端肽胶原蛋白。

实施例3：一种去除胃蛋白酶残留的胶原蛋白提取工艺，包括下述内容：

首先，S100：制备海藻酸钙胃蛋白酶微球。

制备海藻酸钙胃蛋白酶微球具体包括以下步骤：

S110：将海藻酸钠加入纯水溶解，制备得2％浓度的海藻酸钠溶液；

S120：在海藻酸钠溶液中加入不同质量的胃蛋白酶，充分搅拌均匀并静置去除气泡，获得1mg/ml浓度的海藻酸钠-胃蛋白酶溶液；

S130：将海藻酸钠-胃蛋白酶溶液滴加至1.5％含量的氯化钙溶液中，静置使海藻酸钙凝固成微球，于4℃固化过夜；

S140：将步骤S130中溶液多余的氯化钙溶液去除，加入纯水静置洗涤3次，离心去除上清水溶液获得胃蛋白酶固定化微球。

然后，S200：将海藻酸钙胃蛋白酶用于提取胶原蛋白。

采用海藻酸钙胃蛋白酶微球用于提取胶原蛋白具体包括下述步骤：

S210：将猪皮刮毛刮脂后，剪成5mm*5mm小块，用脱脂液脱脂处理后，加入盐洗，盐洗后猪皮小块水洗干净；

S220：将步骤S210处理后猪皮小块泡入0.5M乙酸溶液中，浸泡18h，将浸泡后的猪皮小块均质匀浆，固液比为1:100；

S230：加入海藻酸钙胃蛋白酶微球，海藻酸钙胃蛋白酶微球质量与猪皮小块质量比为1:100，酶解温度为12℃，酶解时间为15h；

S240：酶解结束后，将反应液离心或筛网过滤，去掉海藻酸钙胃蛋白酶微球及其他固体杂质，得干净酶解液；

S250：将步骤S240所得酶解液用氢氧化钠调节pH值到7，析出胶原蛋白沉淀，然后加入10％氯化钠溶液，盐析19h；

S260：盐析后胶原蛋白沉淀经离心后收取，水洗2遍，得无胃蛋白酶残留的去端肽胶原蛋白。

相应的，为了满足生产中无菌制剂的要求，可以将S240步骤所得干净酶解液进行0.22μm膜无菌过滤后，无菌操作获得无菌胶原蛋白产品。或者将步骤S260中获得的胶原蛋白进行冻干后辐照灭菌。满足不同的工艺需要。本发明主要提供一种去除生产中胃蛋白酶残留的胶原蛋白的制备方法，以优化生产工艺，提高胶原蛋白生产质量。

效果测定：

酶切效果：按实施例获得胶原蛋白进行质谱检测，对比猪I型胶原α1链氨基酸序列，如图2所示，被标注的序列为实施例获得的胶原蛋白氨基酸序列，结果表明已经将N端和C端端肽序列切除，证明固定化后的胃蛋白酶微球具有同样的酶切效果。

残留测定：使用上海科艾博生物公司的猪胃蛋白酶(PG)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，测定制备的胶原蛋白固体样品中胃蛋白酶残留量，检测限在ng/ml，未加任何胃蛋白酶制备的胶原样品做对照。所得结果显示(表一)，对比未固定化胃蛋白酶，使用海藻酸钙固定的胃蛋白酶酶切制备的胶原蛋白已检测不出胃蛋白酶残留，可以实现不含胃蛋白酶残留的胶原蛋白制剂，提高产品质量和临床应用安全性。

表一胃蛋白酶残留量测定

备注：N.D.＝未检出 。