一种医药中间体2'-O-丙炔基-鸟苷的合成方法

技术领域

本发明属于核苷酸合成技术领域，尤其涉及一种医药中间体2'-O-丙炔基-鸟苷的合成方法。

背景技术

寡核苷酸在癌症治疗和遗传学中具有广泛的应用前景，如：寡核苷酸是一种短的单链DNA或RNA，通常由几个到几十个核苷酸组成。它们可以与互补的DNA或RNA序列结合，形成稳定的双链结构，具体的，寡核苷酸可以与细胞内的DNA或RNA的内部或末端位置进行交联，这种交联可以阻止细胞的复制。因此，寡核苷酸可以被用作一种特殊的药物，与癌细胞的DNA或RNA结合，阻止癌细胞的复制，从而杀死癌细胞。这种治疗方法被称为基因靶向治疗，因为它针对的是特定的基因突变，而不是所有的健康或患病的细胞。

在遗传学中，寡核苷酸被用作探针，用于研究DNA和RNA的结构和功能。它们也可以被用于基因治疗，即通过修改DNA或RNA序列来治疗遗传性疾病。在这个过程中，寡核苷酸可以被设计成与异常基因序列结合，从而阻止有害基因的表达。

RNAi是一种生物体内常见的基因表达调控机制，它可以通过降解目标RNA来抑制特定基因的表达。在RNAi过程中，双链RNA（dsRNA）是关键的效应分子，它可以被细胞内的RNaseIII酶切割成多个小片段，这些小片段被称为siRNA（小干扰RNA）。siRNA可以与目标RNA结合，导致目标RNA被降解，从而抑制特定基因的表达。

在siRNA的合成过程中，2'的位置是一个很重要的修饰位点。在这个位置上，可以通过添加化学基团（如甲基、乙基等）来改变siRNA的理化性质和功能。这些修饰可以增加siRNA的稳定性和特异性，使其更加有效地结合目标RNA，从而更有效地抑制特定基因的表达。其中：糖修饰的寡核苷酸就是改变siRNA的理化性质和功能的非常重要的物质，如：糖修饰的寡核苷酸可以激活RNaseH的2'-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷的亚序列，从而促进对目标核酸的降解。

因此，合成糖修饰的寡核苷酸是非常重要的，2'-O-丙炔基是一种有机化学基团，通常与核苷酸中的糖部分结合，这种基团的存在可以改变核苷酸的化学性质和生物学活性。2'-O-丙炔基-鸟苷作为一种含有2'-O-丙炔基的医药中间体，也是合成糖修饰的寡核苷酸的中间体，其合成受到广泛关注。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供了一种新的思路合成医药中间体2'-O-丙炔基-鸟苷。

为实现上述目的，本申请是通过如下方案来实现的：

本申请提供了一种医药中间体2'-O-丙炔基-鸟苷的合成方法，包括如下步骤：

S1、于-5℃～5℃下，将第一有机溶剂置于第一反应容器内，向所述第一反应容器内持续通入惰性气体，在惰性气体气氛下，依次向所述第一反应容器内加入2-氨基腺嘌呤核苷、氢化钠，充分搅拌反应，再向所述第一反应容器内加入3-溴丙炔在第一有机溶剂内的混合溶液，于20℃～30℃下，充分搅拌反应完全，进行淬灭、第一减压浓缩、柱层析纯化、第二减压浓缩，得到2-氨基-2'-O-丙炔基-腺苷；

S2、将2-氨基-2'-O-丙炔基-腺苷置于第二反应容器中，向所述第二反应容器内持续通入惰性气体，在惰性气体气氛下，向第二反应容器内加入pH值为7.4~7.5的缓冲溶液，溶解2-氨基-2'-O-丙炔基-腺苷，再向所述反应容器内加入腺苷脱氨酶，于20℃～30℃下，充分搅拌反应完全，经过第三减压浓缩，在惰性气体气氛下，水洗涤并过滤，真空干燥，得到2'-O-丙炔基-鸟苷。

作为本申请进一步的改进，步骤S1和步骤S2中，所述惰性气体可以为但不仅仅限于氮气、氦气、氖气、氩气等中的任意一种。

作为本申请进一步的改进，步骤S1中，所述2-氨基腺嘌呤核苷与所述氢化钠的摩尔比为1:1～1:3，优选为1:1.3～1:1.35。

作为本申请进一步的改进，步骤S1中，所述2-氨基腺嘌呤核苷与所述3-溴丙炔的摩尔比为1:1～1:5，优选为1:1.25～1:1.30。

作为本申请进一步的改进，步骤S1中，所述氢化钠的质量分数为60%。

作为本申请进一步的改进，所述氢化钠是通过分多批次的方式加入到所述第一反应容器内的。

作为本申请进一步的改进，步骤S2中，所述腺苷脱氨酶的规格为74.9U/mg。

作为本申请进一步的改进，所述2-氨基-2'-O-丙炔基-腺苷和所述腺苷脱氨酶的摩尔质量比为2mol/g～4mol/g，优选为3.1mol/g～3.2mol/g。

作为本申请进一步的改进，步骤S2中，所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。优选的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，其pH为7.5；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，其pH为7.4。

作为本申请进一步的改进，所述缓冲溶液的加入步骤具体如下：先加入预设量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，再加入预设量的磷酸盐缓冲液。优选的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1:2～3:1，优选为1:1.8～1:2。

作为本申请进一步的改进，步骤S1中，所述第一有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的任意一种。

本申请的有益效果在于，本申请设计了一种新的特定的工艺路线合成2'-O-丙炔基-鸟苷，相对于现有的四步法合成2'-O-丙炔基-鸟苷，简化了工艺路线，提升了收率，有利于产业化推广。

附图说明

图1为实施例1制备出的2'-O-丙炔基-鸟苷的核磁共振谱图；

图2为实施例2制备出的2'-O-丙炔基-鸟苷的HPLC纯度分析谱图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

为解决上述技术问题，本申请提供了一种新的思路合成医药中间体2'-O-丙炔基-鸟苷，包括如下步骤：

S1、于-5℃～5℃下，将第一有机溶剂置于第一反应容器内，向所述第一反应容器内持续通入惰性气体，在惰性气体气氛下，依次向所述第一反应容器内加入2-氨基腺嘌呤核苷、氢化钠，充分搅拌反应，再向所述第一反应容器内加入3-溴丙炔在第一有机溶剂内的混合溶液，于20℃～30℃下，充分搅拌反应完全，依次进行淬灭、第一减压浓缩、柱层析纯化、第二减压浓缩，得到2-氨基-2'-O-丙炔基-腺苷（化合物16）；

S2、将化合物16置于第二反应容器中，向所述第二反应容器内持续通入惰性气体，在惰性气体气氛下，向第二反应容器内加入pH值为7.4~7.5的缓冲溶液，溶解2-氨基-2'-O-丙炔基-腺苷，再向所述反应容器内加入腺苷脱氨酶，于20℃～30℃下，充分搅拌反应完全，经过第三减压浓缩，在惰性气体气氛下，水洗涤并过滤，真空干燥，得到2'-O-丙炔基-鸟苷。

在可选的实施方案中，步骤S1和步骤S2中，所述惰性气体可以为但不仅仅限于氮气、氦气、氖气、氩气等中的任意一种。

在可选的实施方案中，步骤S1中，所述2-氨基腺嘌呤核苷与所述氢化钠的摩尔比为1:1～1:3，优选为1:1.3～1:1.35。

在可选的实施方案中，步骤S1中，所述2-氨基腺嘌呤核苷与所述3-溴丙炔的摩尔比为1:1～1:5，优选为1:1.25～1:1.30。

在可选的实施方案中，步骤S1中，所述氢化钠的质量分数为60%。

在可选的实施方案中，所述氢化钠通过分多批次的方式加入到所述第一反应容器内的。优选的，所述多批次至少为2次，进一步优选的，所述多批次可以为2次、3次、4次、5次等等。

在可选的实施方案中，步骤S2中，所述腺苷脱氨酶的规格为74.9U/mg。

在可选的实施方案中，所述2-氨基-2'-O-丙炔基-腺苷和所述腺苷脱氨酶的摩尔质量比为2mol/g～4mol/g，优选为3.1mol/g～3.2mol/g。

在可选的实施方案中，步骤S2中，所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。优选的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，其pH为7.5；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，其pH为7.4。

在可选的实施方案中，所述缓冲溶液的加入步骤具体如下：先加入预设量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，再加入预设量的磷酸盐缓冲液。优选的，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1:2～3:1，优选为1:1.8～1:2。

在可选的实施方案中，步骤S1中，所述第一有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的任意一种。

在可选的实施方案中，步骤S1中，-5℃～5℃充分反应完全的时间为第一预设时间段，第一预设时间段可根据2-氨基腺嘌呤核苷、氢化钠等加入量而设定，其可以为但不仅仅限于10min～1.5h，具体的可以为但不仅仅限于10min、20min、30min、40min、50min、60min、1h、1.5h等等；20℃～30℃所述充分反应完全的时间为第二预设时间段，第二预设时间段可根据3-溴丙炔等加入量而设定，其可以为但不仅仅限于7h～20h，具体的可以为但不仅仅限于7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、20h等等。

在可选的实施方案中，步骤S2中，20℃～30℃所述充分反应完全的时间为第三预设时间段，第三预设时间段可根据腺苷脱氨酶、缓冲溶液等加入量而设定，其可以为但不仅仅限于3天～10天，具体的可以为但不仅仅限于3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天等等。

根据上述设计思路，在一个具体的实施方案中，合成医药中间体2'-O-丙炔基-鸟苷的具体步骤如下：

步骤一：在-5~5℃下，将400mL N,N-二甲基甲酰胺置于第一反应容器内，氮气保护；向第一反应容器内加354mmol (100g) 2-氨基腺嘌呤核苷（化合物14）；再分多批次将463mmol (18.4~18.5g，60%w/w)氢化钠加入第一反应容器内，氮气保护；于-5～5℃下，搅拌30~60分钟；将453.9mmol（55g）3-溴丙炔（化合物15）与50mL N,N-二甲基甲酰胺的溶液加入第一反应容器内，氮气保护；于20℃～30℃搅拌12~16小时，氮气保护；采用HPLC中控反应的进程，直至反应完全。在-5℃~5℃下并在氮气保护氛围下，缓慢加入2mL~3mL水，搅拌30分钟，于50℃~60℃下减压浓缩后，柱层析纯化，柱层析纯化过程中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，洗脱的过程中可以采用一次性添加洗脱剂，也可以采用多次添加洗脱剂的方式进行洗涤，按添加顺序，所述二氯甲烷和甲醇的体积比梯度降低，如：二氯甲烷和甲醇的体积比可以从20:1~10:1范围内梯度降低，具体的：如采用三次洗脱剂的方式，第一次添加二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1，第二次添加二氯甲烷和甲醇的体积比为15:1，第三次添加二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。然后再在20℃~30℃温度下减压浓缩，得到195mmol（62.5g）化合物16，纯度90%，收率55%。本步骤在制备化合物16的过程中，优化了原料组分，并设计了特定的制备工艺，收率提高到了55%。

步骤二：

将312mmol（100g）化合物16置于第二反应容器中，氮气保护；向第二反应容器内加入1500ml三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH值为7.5；再向第二反应容器内加入800ml磷酸盐缓冲液，其中：磷酸盐缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH值为7.4；再向第二反应容器内加入0.1g规格为74.9U/mg的腺苷脱氨酶（化合物17）；于20℃~30℃下搅拌5~6天，通过HPLC中控反应的进程，直至反应完全，于50℃~60℃下减压浓缩，再向第二反应容器内加入100mL水，在20℃~30℃温度下并在氮气保护氛围下搅拌1~2小时，氮气保护过滤，然后在20℃~30℃真空干燥，得到299.1mmol（96.1g）2'-O-丙炔基-鸟苷（化合物18），纯度95.2%，收率95.8%。

本申请的合成2'-O-丙炔基-鸟苷的技术路线如下式Ⅰ：

式Ⅰ。

本申请中：化合物14到化合物18的主要反应机理如下反应机理式Ⅱ：

式Ⅱ，

2-氨基腺嘌呤核苷化合物14的2'位置的羟基被氢化钠夺去氢离子，放出氢气，使得2'位置的羟基氧带负电去进攻溴丙炔中处于缺电子状态的亚甲基碳，随后溴丙炔脱去溴负离子，得到化合物16。

2-氨基腺嘌呤核苷化合物14的3'位置的羟基也存在被氢化钠夺去氢离子的概率，并放出氢气，使得3'位置的羟基氧带负电去进攻溴丙炔中处于缺电子状态的亚甲基碳，随后溴丙炔脱去溴负离子，就得到异构体1。

在腺苷脱氨酶的催化作用下，化合物16的顶端氨基发生水解反应，一分子水进攻4位置的碳，脱去一分子氨，得到目标产物化合物18。

本申请的技术方案中：

步骤一中：2-氨基腺嘌呤核苷和3-溴丙炔均是参与合成目标产物的非常重要的原料；N,N-二甲基甲酰胺是一种常用的极性溶剂，在此反应中主要的作用是溶解其他反应物，使其更好地进行反应；氢化钠是一种强碱，它在此反应中的主要作用是去质子化，帮助2-氨基腺嘌呤核苷更好地与3-溴丙炔进行反应。温度控制在-5℃~5℃是为了确保反应的稳定性，防止不必要的副反应发生；氮气保护是为了排除氧气和水的影响，保证反应的纯度；反应时间和搅拌速度的选择是为了确保反应能够充分进行；柱层析纯化时采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，这是因为这种混合溶液可以使化合物16与3'-O-丙炔基-2-氨基腺嘌呤核苷异构体1进行有效的分离。

步骤二中：步骤一中的产物化合物16作为本步骤的参与合成2'-O-丙炔基-鸟苷的主要原料；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的作用均是维持反应的pH值稳定，确保反应能够顺利进行；腺苷脱氨酶作为一种酶，它的作用是催化水解化合物16转化为2'-O-丙炔基-鸟苷。温度控制在20℃~30℃是为了确保酶的活性，使反应能够顺利进行；搅拌时间和速度的选择是为了确保反应能够充分进行；减压浓缩是为了去除多余的水分和溶剂，得到纯度更高的产物；过滤和真空干燥是为了得到干燥的产物，方便后续的储存和使用。

实施例1

本实施例合成2'-O-丙炔基-鸟苷的具体步骤如下：

步骤一：在0℃下，将400mL N,N-二甲基甲酰胺置于第一反应容器内，氮气保护；向第一反应容器内加354mmol (100g) 2-氨基腺嘌呤核苷（化合物14）；再分多批次将463mmol(18.5g，60%w/w)氢化钠加入第一反应容器内，氮气保护；于0℃下，搅拌45分钟；将453.9mmol（55g）3-溴丙炔（化合物15）与50mL N,N-二甲基甲酰胺的溶液加入第一反应容器内，氮气保护；于25℃搅拌14小时，氮气保护；采用HPLC中控反应的进程，直至反应完全。在0℃下并在氮气保护氛围下，缓慢加入2.5mL水，搅拌30分钟，于55℃下减压浓缩后，柱层析纯化，柱层析纯化过程中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，洗脱的过程中采用三次洗脱剂的方式，第一次添加二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1，第二次添加二氯甲烷和甲醇的体积比为15:1，第三次添加二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。然后再在25℃温度下减压浓缩，得到195mmol（62.5g）化合物16，纯度90%，收率55%。本步骤在制备化合物16的过程中，优化了原料组分，并设计了特定的制备工艺，收率提高到了55%。

步骤二：

将312mmol（100g）化合物16置于第二反应容器中，氮气保护；向第二反应容器内加入1500ml三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，其中：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH值为7.5；再向第二反应容器内加入800ml磷酸盐缓冲液，其中：磷酸盐缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH值为7.4；再向第二反应容器内加入0.1g规格为74.9U/mg的腺苷脱氨酶化合物17；于25℃下搅拌6天，通过HPLC控制反应的进程，直至反应完全，于55℃下减压浓缩，再向第二反应容器内加入100mL水，在25℃温度下并在氮气保护氛围下搅拌1.5小时，氮气保护过滤，然后在25℃真空干燥，得到299.1mmol（96.1g）2'-O-丙炔基-鸟苷（化合物18），纯度95.2%，收率95.8%。

本实施中，针对制备出的2'-O-丙炔基-鸟苷的核磁共振谱图如图1所示，其

1

本实施中，针对制备出的2'-O-丙炔基-鸟苷的HPLC纯度分析谱图如图2所示，HPLC纯度大于95%。

本实施例所用原料的来源具体如下：N,N-二甲基甲酰胺置为上海泰坦科技股份有限公司生产的批号为P02637042的产品，2-氨基腺嘌呤核苷为芜湖诺威化学技术有限公司生产的批号为190721-11的产品，氢化钠为安徽泽升科技股份有限公司生产的批号为8ODHRREU的产品，3-溴丙炔为上海泰坦科技股份有限公司生产的批号为P2316836的产品，三羟甲基氨基甲烷为上海泰坦科技股份有限公司生产的批号为P2710956的产品，盐酸为江苏强盛功能化学股份有限公司白茆分公司生产的批号为20230527的产品，磷酸二氢钠为江苏强盛功能化学股份有限公司生产的批号为20230621的产品，磷酸氢二钠为江苏强盛功能化学股份有限公司生产的批号为20230525的产品，甲醇是江苏强盛功能化学股份有限公司白茆分公司生产的批号为20230711的产品，二氯甲烷为江苏强盛功能化学股份有限公司白茆分公司生产的批号为20230611的产品，腺苷脱氨酶为南京都莱生物技术有限公司生产的批号为20230522的产品。

对比例1

为了佐证本申请的技术方案具有优异的技术效果，提供了本对比例1，现有技术中采用鸟苷作为制备2'-O-丙炔基-鸟苷，具体步骤如下：

步骤一：

在氮气保护下，将2.47mol(700 g)鸟苷（化合物1），溶解在7L N,N-二甲基甲酰胺中，加入7.41mol(504g)咪唑（化合物3），在20℃下，搅拌并滴加入2.44 mol（770 g）1,3二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷（化合物2），在20℃下，搅拌16小时，反应液倒入 70L 冰水里搅拌，过滤真空干燥，得到2.28mol（1200 g）白色固体（化合物4），收率为92.4%。

步骤二：

将2.28mol（1200 g）白色固体（化合物4）溶解在1.8L二氯甲烷中，加入273.9mmol（75.28 g）叔丁基二苯基氯硅烷（化合物5），加入684mmol （69.16g）三乙胺（化合物7），再加入45.6mmol（5.57g）4-二甲氨基吡啶（化合物6），室温下，搅拌8小时，用磷酸盐缓冲液1.8L洗反应液，再用1.8L氯化钠的饱和水溶液洗有机相，用60g无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得到的化合物8粗品。

步骤三：

在氮气保护下，将10mmol化合物8 (7.64g) 溶解在115mL无水乙腈中，冰浴下，加入25mmol (6.86g) 2-叔丁基亚氨基-2-二乙基氨基-1,3-二甲基全氢-1,3,2-二氮杂磷（化合物9），然后加入50mmol（5.95g）溴丙炔（化合物10），在0℃下，搅拌10分钟后，在室温下继续搅拌，当原料剩余小于20%时，或者2~3小时后，反应变化非常明显时，反应结束，溴丙炔反应时间一般是2小时。减压浓缩，加入乙酸乙酯，用115mL磷酸盐缓冲溶液(pH 7)和115mL饱和氯化钠水溶液各洗一次有机相，有机相用20g无水硫酸钠干燥后，过滤。减压浓缩，得到粗品化合物11。

步骤四：

将10mmol（8.02g）化合物11加入120mL四氢呋喃中，加入12mmol（3.14g）四丁基氟化铵（化合物12），在室温下继续搅拌4个小时，减压浓缩，柱层析纯化，得到化合物13，收率为37.2%。其中：柱层析纯化过程中的洗脱剂为乙醇和二氯甲烷的混合液，乙醇和二氯甲烷的体积比为1:5～1:20。

本对比例的合成2'-O-丙炔基-鸟苷的技术路线如下式Ⅲ：

式Ⅲ，

通过技术路线可知，本对比例1采用的原材料是鸟苷，加入的辅助材料包括1,3二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷、叔丁基二苯基氯硅烷、4-二甲氨基吡啶等，其最终的收率为34.4%。

综上，现有合成2'-O-丙炔基-鸟苷的技术路线比较复杂且收率低。因此，本申请提供了一种新的思路合成2'-O-丙炔基-鸟苷，采用2-氨基腺嘌呤核苷为底物，通过两步反应合成2'-O-丙炔基-鸟苷，缩短了合成步骤，提高了收率。

虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。