一种高效介导外源基因整合的质粒系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效介导外源基因整合的质粒系统及其应用。

背景技术

盐单胞菌(Halomonas)是一种研究聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成的重要微生物，是工业化生产PHA的优势底盘。目前用于盐单胞菌的基因编辑技术手段主要有两种：一种是以自杀质粒为载体的同源重组方法，另一种方法是基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法。上述两种方法都依赖同源重组，而同源重组依赖同源区域或序列的存在，且产生的DNA链断裂是随机的，因此会限制外源DNA序列的长度，此外还需要通过优化同源臂的长度和对应DNA序列的位置，才能达到比较好的基因编辑效果。与之相比，位点特异性重组不依赖于同源重组，而依赖于能与某些酶相结合的短DNA序列，在这些高效特异的重组酶的作用下，发生DNA链的断裂和重新连接。因而具有位点特异性，保证了重组的高度专一性和高度保守性。

位点特异性重组系统来源于噬菌体，噬菌体在侵染细菌时会将其DNA插入到宿主细菌的染色体上，并和宿主同步复制分裂，这一过程需要噬菌体体内的位点特异性重组酶识别专门的“识别位点”—“attP”和“attB”(attP和attB分别存在于噬菌体和宿主染色体中)。重组酶介导attP和attB两个序列之间的重组，这一过程会将噬菌体DNA插入到宿主细菌染色体上，原有的attP和attB序列会在染色体上形成两个新的序列“attL”和“attR”。作为工具，位点特异性重组系统由整合酶的识别位点/序列和识别DNA序列并介导DNA重组的整合酶组成。通过改变重组酶识别位点的位置和序列方向，位点特异性重组酶可以作为一种把特定序列插入到DNA链上或者从DNA链上删除或者翻转特定序列的工具酶，因此被广泛用于不同底盘微生物中，进行基因编辑操作。

重组工程在许多情况下仅有3～4kb的有效载荷大小限制，使得其对高通量DNA盒的基因组整合用处较小。最后，对宿主特异性因子的未知要求或噬菌体重组蛋白的跨物种不相容使得大肠杆菌重组工程系统对适应其他细菌物种有挑战性，因此利用不同的菌株进行基因整合时，需要优化或筛选新的重组酶。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种高效介导外源基因整合的质粒系统及其应用。

本发明提供了一种高效介导外源基因整合的质粒系统，所述质粒系统包括：

(1)第一质粒，所述第一质粒包含整合重组酶的attP核苷酸序列；

(2)第二质粒，所述第二质粒包含整合重组酶的attB核苷酸序列；

(3)第三质粒，所述第三质粒包含切除重组酶的核苷酸序列；

其中，(1)、(2)中所述整合重组酶为int5、int7、bxb1、int12中的任意一种；int5的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示，int7的核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示，bxb1的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示，int12的核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示；

(3)中所述切除重组酶为Scre、Vcre、Dre、Flp中的任意一种；

其中，Scre的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示，Vcre的核苷酸序列如SEQ IDNO.69所示，Dre的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示，Flp的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示。

进一步的，所述int5的attP核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示，所述int7的attP核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示，所述bxb1的attP核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示，所述int12的attP核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示；

所述int5的attB核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示，所述int7的attB核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示，所述bxb1的attB核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示，所述int12的attB核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。

进一步的，所述第一质粒由pRE112质粒构建获得；和/或所述第二质粒由pSEVA321质粒构建获得；和/或所述第三质粒由pSEVA341质粒构建获得。

进一步的，所述第一质粒和/或第二质粒和/或第三质粒还包含启动子，所述启动子为Porin68、Porin58、Porin141、J23115、J23106、J23101中的任意一种或多种。

本发明还提供一种在菌株中整合外源基因的方法，包括如下步骤：

(i)将权利要求1所述第一质粒整合到菌株的基因组中；

(ii)将外源基因的核苷酸序列整合到所述第二质粒中，并将第二质粒导入(i)所述菌株中；

(iii)将权利要求1所述第三质粒导入(i)所述菌株中。

进一步的，(i)所述菌株为盐单胞菌。

进一步的，(i)所述第一质粒的整合方法为同源重组。

本发明还提供一种工程菌，包括所述的质粒系统。

进一步的，所述工程菌为盐单胞菌。

本发明还提供所述的质粒系统或所述的工程菌在基因编辑中的应用。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

1、本发明的质粒系统能够在菌株中整合不同序列长度以及不同表达强度的外源基因，基因整合效率高达100％。

2、本发明的质粒系统能有效的提高构建各类稳定表达菌株的效率，实现各种模型的高效构建，能广泛应用于不同底盘微生物中，进行基因编辑操作。

3、本发明质粒系统构建方法及外源基因整合的操作方法简单、价格低廉，普通的实验室可自行完成构建。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例基因编辑流程示意图；

图2为本发明实施例1使用的pRE112-G7-int5质粒图；

图3本发明实施例1中验证G7位点成功插入整合attP(int5)序列电泳图；

图4为本发明实施例1使用的pRE112-G43-int7质粒图；

图5为本发明实施例1使用的pRE112-G49-bxb1质粒图；

图6为本发明实施例1使用的pRE112-G56-int12质粒图；

图7本发明实施例1中验证G43位点成功插入整合attP(int7)序列电泳图；

图8本发明实施例1中验证G49位点成功插入整合attP(bxb1)序列电泳图；

图9本发明实施例1中验证G56位点成功插入整合attP(int12)序列电泳图；

图10为本发明实施例2使用的pSEVA321-attB-int5-1质粒图；

图11为本发明实施例2使用的pSEVA321-attB-int7-1质粒图；

图12为本发明实施例2使用的pSEVA321-attB-bxb1-1质粒图；

图13为本发明实施例2使用的pSEVA321-attB-int12-1质粒图；

图14为本发明实施例2使用的pSEVA341-Scre质粒图；

图15为本发明实施例2使用的pSEVA341-Vcre质粒图；

图16为本发明实施例2使用的pSEVA341-Dre质粒图；

图17为本发明实施例2使用的pSEVA341-Flp质粒图；

图18为本发明实施例3使用的pSEVA341-attB-bxb1-2质粒图；

图19为本发明实施例3使用的pSEVA341-attB-bxb1-2质粒图；

图20为本发明实施例3使用的pSEVA341-attB-bxb1-2质粒图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明构建了整合酶-切除酶偶联的基因编辑模式，该系统包括整合酶-attP系统和切除酶系统。本发明的基因编辑方法包括3个步骤：(1)首先将整合酶对应的attP位点通过同源重组的方式插到基因组的目标位点；(2)随后带有attB位点的整合酶系统将目标表达基因簇整合到目标位点上，实现有痕插入；(3)最后，用切除酶系统将除表达模块的其他部分切除，得到稳定表达菌株，具体操作步骤如图1所示。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请中使用的Halomonas lutescens MDF-9菌株已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为GDMCC NO.61850。菌株名称为Halomonas lutescensMDF-9，分类命名为盐单胞菌(Halomonas lutescens)。

实施例1attP序列整合质粒及对应整合酶系统质粒构建

整合酶系统主要包括attP位点、整合酶表达模块。本申请中采用盐单胞菌常用的四个插入位点G7、G43、G49、G56进行基因编辑的测试。通过文献调研，采用了4种常见的整合酶：int5，int7，bxb1，int12，其对应的attP和attB的序列如表1所示：

表1整合酶attP与attB对应序列表

1、G7位点attP(int5)序列整合质粒构建

(1)int5-attP整合质粒构建：PCR扩增Halomonas lutescens MDF-9基因组G7位点上游同源臂片段G7L、下游同源臂片段G7R和质粒pRE112骨架，在Gibson连接酶的作用下，G7L片段、G7R片段和pRE112骨架重组形成新的质粒，命名为pRE112-G7-int5，通过引物112-F和112-R进行PCR验证，取部分验证产物送生物公司测序，质粒信息如图2所示。

PCR扩增G7L，G7R片段及对应pRE112质粒骨架的引物序列如下(5’-3’)：

G7L-F：见SEQ ID NO.1；

G7L-R：见SEQ ID NO.2；

G7R-F：见SEQ ID NO.3；

G7R-R：见SEQ ID NO.4；

112-G7-int5-F：见SEQ ID NO.5；

112-G7-int5-R：见SEQ ID NO.6；

112-F：见SEQ ID NO.7；

112-R：见SEQ ID NO.8。

其扩增体系和扩增程序见表2和表3：

表2扩增体系表

表3扩增程序表

PCR反应完成后，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，进行电泳以便观察DNA条带的大小，将凝胶置于紫外灯下，迅速的切下目的DNA片段的凝胶，尽可能的将多余的凝胶切掉。

(2)Gibson Assembly法连接

将回收的DNA检测其浓度，再根据目的片段和骨架的长度、浓度计算DNA的添加比例，并利用Gibson混合酶进行连接，其Gibson Assembly连接体系和程序如表4和表5所示：

表4Gibson Assembly连接体系表

表5Gibson Assembly连接程序

(3)S17-1大肠杆菌转化

步骤1：将提前制备好的S17-1大肠杆菌感受态细胞从-80℃拿出，在冰上解冻，5min后待菌块融化；

步骤2：往感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻的弹管壁将反应液混匀(请勿振荡混匀)。注：连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10；

步骤3：冰上冰浴30min，42℃水浴热激2min后，立即置于冰上冷却2min，注：晃动会降低转化效率；

步骤4：向离心管中加入400μL LB培养基(不含抗生素)，混匀后放入37℃摇床中200rpm复苏60min；

步骤5：5000rpm离心5min收菌，弃掉350μL上清留取100μL轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上；

步骤6：将培养基倒置到37℃培养箱中培养12～16h。

(4)单克隆菌落阳性验证

在相对应的抗性LB板上挑出菌落，并进行菌落PCR验证，将条带大小正确的PCR产物送至生物公司进行测序。

(5)基因组插入菌株的筛选

选择序列正确的单菌落进行扩培，12～16h后与MDF-9在20LB平板中进行接合，8h后挑取少量接合后的菌体涂布于具有相应抗性的60LB板上，36～48h后再进行一次单克隆菌落验证。验证成功即可脱抗。脱抗即深孔板60LB，42℃传代3～7代(24h一代，从3代开始涂板验证)，脱抗后取少许菌液加60LB(约10

(6)产物鉴定

挑选脱抗成功的菌落进行PCR验证，验证成功后即可测序。测序结果表明本实施例MDF-9菌株中成功在G7位点整合attP(int5)序列，并将该菌株命名为MDF-9-1，通过目的产物的大小进行验证，如图3所示，目的片段为2291bp，符合预期结果。

2、G43位点attP(int7)序列整合质粒、G49位点attP序列(bxb1)整合质粒及G56位点attP整合序列构建

PCR分别扩增盐单胞菌基因组G43、G49、G56位点上游同源臂片段G43L、G49L、G56L以及下游同源臂片段G43R、G49R、G56R和质粒pRE112骨架，在Gibson连接酶的作用下，各对应上下游同源臂片段和pRE112骨架重组形成新的质粒，分别命名为pRE112-G43-int7、pRE112-G49-bxb1、pRE112-G56-int12，通过引物112-F和112-R进行PCR验证，取部分验证产物送生物公司测序。具体步骤参考实施例1中G7位点attP(int5)序列整合质粒构建，质粒信息分别如图4、5、6所示。

PCR扩增的引物序列如下(5’-3’)：

G43L-F：见SEQ ID NO.9；G43L-R：见SEQ ID NO.10；

G43R-F：见SEQ ID NO.11；G43R-R：见SEQ ID NO.12；

112-G43-int7-F：见SEQ ID NO.13；112-G43-int7-R：见SEQ ID NO.14；

G49L-F：见SEQ ID NO.15；G49L-R：见SEQ ID NO.16；

G49R-F：见SEQ ID NO.17；G49R-R：见SEQ ID NO.18；

112-G49-bxb1-F：见SEQ ID NO.19；112-G49-bxb1-R：见SEQ ID NO.20；

G56L-F：见SEQ ID NO.21；G56L-R：见SEQ ID NO.22；

G56R-F：见SEQ ID NO.23；G56R-R：见SEQ ID NO.24；

112-G56-int12-F：见SEQ ID NO.25；112-G56-int12-R：见SEQ ID NO.26。

测序结果表明本实施例MDF-9菌株中成功分别在G43、G49、G56位点整合了对应的attP序列，并将各菌株命名为MDF-9-2，MDF-9-3，MDF-9-4，通过目的产物的大小进行验证，分别如图7、8、9所示，目的片段分别为2297bp、2284bp、2296bp，符合预期结果。

实施例2整合酶-切除酶介导的基因组插入系统的质粒构建及表征

1、带有GFP的不同整合酶质粒构建

PCR扩增片段1(GFP基因)和相应带有整合酶表达元件的pSEVA321质粒骨架，在Gibson连接酶的作用下，各片段和相应pSEVA321质粒骨架，分别命名为vector-attB-int5-1，vector-attB-int7-1，vector-attB-bxb1-1，vector-attB-int12-1，质粒信息分别如图10～13所示。具体步骤参考实施例1。片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示。

扩增片段1及对应带有整合酶表达元件的pSEVA321质粒骨架的引物序列如下：

片段1-F：见SEQ ID NO.27；

片段1-R：见SEQ ID NO.28；

pSEVA321-1-F：见SEQ ID NO.29；

pSEVA321-1-R：见SEQ ID NO.30。

2、不同切除酶质粒构建

PCR扩增Vcre、Dre、Flp基因和对应的pSEVA341质粒骨架，以341-Scre为模版，质粒信息如图14所示，在Gibson连接酶的作用下，各基因片段和相应pSEVA341质粒骨架，分别命名为341-Vcre，341-Dre，341-Flp，质粒信息分别如图15～17所示，具体步骤参考实施例1。

Scre整合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示、Vcre整合酶的核苷酸序列如SEQID NO.69所示、Dre整合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示、Flp整合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示。

构建不同切除酶质粒所需引物序列如下：

pSEVA341-Scre-F：见SEQ ID NO.31；pSEVA341-Scre-F：见SEQ ID NO.32；

Scre-F：见SEQ ID NO.33；Scre-R：见SEQ ID NO.34；

pSEVA341-Vcre-F：见SEQ ID NO.35；pSEVA341-Vcre-R：见SEQ ID NO.36；

Vcre-F：见SEQ ID NO.37；Vcre-R：见SEQ ID NO.38；

pSEVA341-Dre-F：见SEQ ID NO.39；pSEVA341-Dre-R：见SEQ ID NO.40；

Dre-F：见SEQ ID NO.41；Dre-R：见SEQ ID NO.42；

pSEVA341-Flp-F：见SEQ ID NO.43；pSEVA341-Flp-R：见SEQ ID NO.44；

Flp-F：见SEQ ID NO.45；Flp-R：见SEQ ID NO.46。

3、以GFP作为报告基因测试不同整合酶-切除酶组合基因组整合效率

以四种不同的整合酶和四种不同的切除酶进行组合测试了16种组合来验证其基因组整合的效率，整合测试过程分为两步，第一步是整合酶的整合过程，第二步是切除酶的切除过程。每一步都通过挑取48个单克隆进行PCR验证，分别计算两步的正确克隆率得到整合效率和切除效率，以及两者相乘最终得到基因组整合效率。

测试结果如表6所示。

表6不同整合酶和切除酶组合基因组整合效率

从上表中可以分别得到4种整合效率较高的组合，分别是int5-Flp(82％)，int7-Vcre(70％)，bxb1-Dre(100％)，int12-Vcre(84％)。bxb1-Dre的整个效率高达100％，因此选择bxb1-Dre组合进行后续验证。

实施例3验证不同序列长度外源基因的插入效率

1、带有不同序列长度外源基因的bxb1整合酶质粒构建

PCR分别扩增片段2(用于1，4-丁二醇转化到4-羟基丁酸的aldD-dhaT基因簇)，片段3(用于葡萄糖从头合成P34HB的4hbd-sucD-ogdA基因簇)以及片段4(用于葡萄糖从头合成P34HB的4hbd-sucD-ogdA基因簇加上来自Ralstonia eutropha H16的phaC-phaA-phaB基因簇)和相应带有整合酶表达元件的pSEVA321质粒骨架，在Gibson连接酶的作用下，各片段和相应pSEVA321质粒骨架，分别命名为vector-attB-bxb1-2，vector-attB-bxb1-3，vector-attB-bxb1-4，质粒信息分别如图18～20所示。具体步骤参考实施例1，片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示、片段3的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示、片段4的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示。

2、不同序列长度外源基因整合测试

(1)将带有vector-attB-bxb1-2，vector-attB-bxb1-3，vector-attB-bxb1-4的大肠S17-1进行一级摇菌管培养，12～16h后与MDF-9-3在20LB平板中进行接合，8h后挑取少量接合后菌体涂布于相对应抗性的60LB板上。

(2)36～48h后进行PCR验证，验证成功后将带有整合酶的切除质粒的大肠S17-1与上述PCR验证的正确菌株接合8h后涂相应抗性(spe)的60LB平板，摇床生长36～48h后进行挑取单克隆划线于60(cm)LB和60LB无抗平板，验证能在无抗平板上生长不能在60cm平板生长的菌株，挑取其中48个符合条件的菌株进行PCR验证，计算整合成功的克隆数占总数的比例，即阳性率。

(3)验证成功后进行脱抗，即深孔板60LB，42℃传代2～4代(12一代)，脱抗后取少许菌液加60LB涂匀在60LB平板。

(4)平板长出单菌落后取单菌落分别划线在60LB及对应抗性60LB平板上，培养12h后，在60LB上能生长，而对应抗性60LB平板上不能生长的即为脱抗成功。

阳性率的统计结果如下：

表7不同序列长度外源基因整合效率

扩增各片段及对应带有整合酶表达元件的pSEVA321质粒骨架的引物序列如下：

片段2-F：见SEQ ID NO.47；片段2-R：见SEQ ID NO.48；

vector-2-F：见SEQ ID NO.49；vector-2-R：见SEQ ID NO.50；

片段3-F：见SEQ ID NO.51；片段3-R：见SEQ ID NO.52；

vector-3-F：见SEQ ID NO.53；vector-3-R：见SEQ ID NO.54；

片段4-F：见SEQ ID NO.55；片段4-R：见SEQ ID NO.56；

vector-4-F：见SEQ ID NO.57；vector-4-R：见SEQ ID NO.58。

int5、int7、bxb1、int12整合酶核苷酸序列如下：int5整合酶核苷酸序列如SEQ IDNO.75所示；int7整合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示；bxb1整合酶核苷酸序列如SEQ IDNO.77所示；int12整合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示。

实施例4验证不同强度启动子介导GFP表达基因簇的插入效率

以vector-attB-bxb1-1质粒为模版分别构建不同表达强度的GFP整合质粒，选择两个启动子系列，分别为porin系列和J23系列和三个不同范围的表达强度，分别是10000以下、10000～50000、50000以上。整合质粒GFP启动子系列及表达强度信息如下表8，具体步骤参考实施例1。

表8不同表达强度GFP启动子选择

将带有不同启动子强度的vector-attB-bxb1-1的大肠S17-1进行一级摇菌管培养，12～16h后与MDF-9-3在20LB平板中进行接合，8h后挑取少量接合后菌体涂布于相对应抗性的60LB板上。(具体步骤参考实施例3中不同序列长度外源基因整合测试)。挑取48个符合条件的菌株进行PCR验证，基因整合效率(即整合成功的克隆数占总数的比例)如表9所示。

表9不同启动子强度GFP基因组整合效率

由上述结果可知，使用不同强度的启动子介导GFP基因的插入，其整合效率均为100％，说明使用不同启动子进行整合时，并不影响外源基因的插入效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。