神经肽衍生物的生物缀合物

本发明旨在提出新的神经肽衍生物，特别是纳米颗粒形式的神经肽衍生物，含有其的组合物及其治疗用途。

疼痛是重要的全球健康挑战，其原因有很多，包括高患病率、严重的相关后遗症以及有效治疗的相对不足，特别是在缓和神经性疼痛方面。与疼痛相关的疾病例如关节炎、癌症和神经系统病变非常普遍，并且给患者带来极大的不便和痛苦。慢性疼痛不仅对患者自身有重大影响，而且对更广泛的社区和经济也有重大影响。通过激活μ-阿片受体，目前临床实践上最强效且广泛使用的止痛药是吗啡及相关的合成阿片类物质。但是吗啡治疗与严重的副作用相关，例如与阿片类物质耐受和依赖的发展有关的呼吸抑制和成瘾。根据CDC/NCHS，在美国的国家生命统计系统中每天有多于115个人在过量服用阿片类物质后死亡。阿片类物质特别是吗啡的误用和成瘾是美国(也可能是其他国家)的一场严重国家危机，其影响了公共健康以及社会和经济福利。这凸显了寻找新止痛药的迫切需要。

在这种情况下，内源性神经肽，例如脑啡肽仍然是一个有吸引力的选择。脑啡肽激活μ-阿片受体和δ-阿片受体，但对δ-阿片受体的亲和力高10倍。与μ-阿片受体激动剂相比，δ-阿片受体配体被认为具有低得多的滥用可能性，并且减少了呼吸、胃肠和认知损害。然而，因为药代动力学的问题和快速的血浆代谢，脑啡肽在历史上受到限制。

迄今为止，提高阿片肽的镇痛活性的两种主要方法依赖于(i)使用脑啡肽酶抑制剂来提高内源性肽的稳定性，或(ii)具有增强的亲油性和抗降解性的外源性肽的化学合成。然而，由于酶的特异性不足，脑啡肽酶抑制剂通常具有耐受性差的副作用。在另一方面，肽的衍生化通常以生物学上非活性的化合物结束，这同样适用于共价连接至血脑屏障转运载体的神经肽。这解释了为什么从数十年前开始进行的研究工作都没有导致药物上市。

因此，需要新的安全的抗痛觉过敏或镇痛化合物，当将它们施用于需要的对象时，其在治疗上有效而不产生副作用。

本发明的目的正是提出新的安全的神经肽衍生物。

因此，根据本发明的其中一个方面，本发明旨在提供新的神经肽衍生物，其能够在外周限制它们的活性并优化损伤部位的神经肽浓度，这可以克服这些问题。

根据本发明的另一个方面，本发明旨在提出新的神经肽衍生物，其在血清或血浆中显示增加的稳定性。

根据本发明的另一个方面，本发明旨在提出新的神经肽衍生物，其被保护免于快速代谢并且不穿过血脑屏障。

根据本发明的另一个方面，本发明旨在提出新的神经肽衍生物，其具有抗痛觉过敏性。

根据本发明的另一个方面，本发明旨在提出新的神经肽衍生物，其特异性地靶向外周阿片受体，并因此防止和逆转在受损组织中表达的多种兴奋剂的作用。

根据本发明的另一个方面，本发明旨在提出新的神经肽衍生物，其避免与使用吗啡或相关合成的阿片类物质有关的严重副作用。有利地，本发明的新的神经肽衍生物与呼吸抑制和/或成瘾无关。

最后，根据本发明的另一个方面，本发明旨在提出用于有效治疗疼痛疾病的新的神经肽衍生物。

出人意料地，本发明人发现神经肽与至少一种特定分子的共价偶联在这些方面的表现令人满意。

因此，本发明涉及生物缀合物，其包含与至少一种角鲨烯结构(SQ)的烃化合物共价键合的至少一种神经肽，角鲨烯结构如下所示，

其中m1为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，并且

m2为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，

并且其中

特别地，发明人已经显示了本发明的生物缀合物能够在外周限制它们的活性并能够在损伤部位使神经肽浓度最优化。通过靶向外周的阿片受体，本发明的生物缀合物允许防止和逆转在受损组织中表达的多种兴奋剂的作用。此外，发明人已经显示了本发明的生物缀合物提供了疼痛疾病的有效治疗，而不发展与使用吗啡或相关合成的阿片类物质有关的严重副作用，例如呼吸抑制和/或成瘾。

在本发明的上下文中，术语“生物缀合物”指具有治疗性质的生物分子，其由至少一种神经肽与至少一种角鲨烯性质的烃化合物的缀合反应形成。在本发明的上下文中，术语“缀合”表示至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价键合。

在本发明的上下文中，术语“角鲨烯结构”旨在表示由异戊二烯单元形成的直链或环状烃基结构。有利地，直链或环状烃基结构由至少2个异戊二烯单元形成，有利地由至少3个异戊二烯单元形成，有利地由至少4个异戊二烯单元形成，有利地由至少5个异戊二烯单元形成，有利地由至少6个异戊二烯单元形成，例如角鲨烯，至少6个或多于6个异戊二烯单元。在本发明的特定实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由5个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个特定实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由6个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由多于6个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由7个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由8个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由9个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由10个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由11个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由12个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由13个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由14个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由15个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由16个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由17个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由18个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由19个异戊二烯单元形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的角鲨烯结构的烃化合物由20个异戊二烯单元形成。

在本发明的特定实施方案中，至少一种角鲨烯结构的烃化合物可以由如下通式(SQ1)表示：

其中m1为2且m2为1，其中

在本发明的特定实施方案中，至少一种角鲨烯结构的烃化合物可以由如下通式(SQ2)表示：

其中m1为2并且m2为2，其中

如发明人所发现的，这种角鲨烯结构在本发明的上下文中特别重要，因为当将它置于与极性介质和更具体地与水接触时，它自发地显示出紧凑的构象。

在一些实施方案中，术语“至少一种角鲨烯结构的烃化合物”指一种与神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物。在一些实施方案中，术语“至少一种角鲨烯结构的烃化合物”指两种与神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物。在一些实施方案中，术语“至少一种角鲨烯结构的烃化合物”指三种与神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物。在一些实施方案中，术语“至少一种角鲨烯结构的烃化合物”指四种与神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物。在一些实施方案中，术语“至少一种角鲨烯结构的烃化合物”指五种与神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物。在一些实施方案中，术语“至少一种角鲨烯结构的烃化合物”指根据神经肽的大小，六种或多于六种与神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物。

在本发明特别有利的实施方案中，至少一种角鲨烯结构的烃化合物包含11至102个碳原子，有利地11至32个碳原子，有利地11至27个碳原子。

作为能够形成本发明的生物缀合物的基于烃的角鲨烯结构的实例，可以更具体地提到角鲨烯酸及其衍生物，例如1,1',2-三-正-角鲨烯酸、1,1',2-三-正-角鲨烯胺、1,1',2-三-正-角鲨烯醇、1,1',2-三-正-角鲨烯硫醇、角鲨烯乙酸、角鲨烯乙醇、角鲨烯乙硫醇、角鲨烯乙胺。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自1,1',2-三-正-角鲨烯酸分子的角鲨烯结构的烃化合物。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自1,1',2-三-正-角鲨烯醇分子的角鲨烯结构的烃化合物。

在本发明特别有利的实施方案中，至少一种角鲨烯结构的烃化合物是1,1',2-三-正-角鲨烯酸或1,1',2-三-正-角鲨烯醇。

在本发明的上下文中，术语“神经肽”指多肽或小的蛋白质物质，其由神经元通过调节的分泌途径产生和释放并作用于神经基质。术语“神经肽”也指小的合成化合物，例如作用于神经底物的内源性多肽或蛋白质的肽模拟物或类似物。有利地，至少一种神经肽是内源性神经肽。

在一些实施的方案中，术语“至少一种神经肽”是指一种与角鲨烯结构的烃化合物共价键合的神经肽。在一些实施的方案中，术语“至少一种神经肽”是指两种与角鲨烯结构的烃化合物共价键合的神经肽。在一些实施的方案中，术语“至少一种神经肽”是指三种与角鲨烯结构的烃化合物共价键合的神经肽。在一些实施的方案中，术语“至少一种神经肽”是指四种与角鲨烯结构的烃化合物共价键合的神经肽。

在一些实施的方案中，角鲨烯结构的烃化合物由至少2个异戊二烯单元形成，有利地由至少3个异戊二烯单元形成，有利地由至少4个异戊二烯单元形成，有利地由至少5个异戊二烯单元形成，有利地由至少6个异戊二烯单元形成，例如角鲨烯，或当角鲨烯结构的烃化合物与多于一种神经肽共价键合时，由多于6个异戊二烯单元形成。

作为能够与两种神经肽共价键合的基于烃的角鲨烯结构的实例，可以提到角鲨烯结构的烃化合物，其由如下通式(SQ’)表示：

其中m1为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，并且

m2为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，

并且其中

在本发明的特定实施方案中，能够与两种神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物可以由如下通式(SQ’1)表示：

其中m1为2且m2为1，其中

在本发明的特定实施方案中，能够与两种神经肽共价键合的角鲨烯结构的烃化合物可以由如下通式(SQ’2)表示：

其中m1为2并且m2为2，其中

在本发明特别有利的实施方案中，至少一种神经肽是阿片肽。在本发明的上下文中，术语“阿片类物质”指结合对象的中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)中的特定阿片受体的自然或合成的化合物，并且其对这些受体具有激动剂(活化)或拮抗剂(失活)作用。阿片类物质可以是内源性的(源于对象体内)或外源性的(源于对象体外)。对阿片受体具有激动剂(活化)作用的阿片类物质产生镇痛作用。阿片类化合物的实例包括但不限于阿片类生物碱(例如激动剂，吗啡和羟考酮，和拮抗剂，纳洛酮和纳曲酮)和阿片肽。在本发明的有利实施方案中，阿片肽是内源性阿片肽，并且选自亮氨酸脑啡肽(也称亮脑啡肽，缩写为LENK)、甲硫氨酸脑啡肽(也称甲硫脑啡肽，缩写为MENK)、达拉根、京都啡肽、内吗啡肽、内啡肽或其衍生物。

如本文所用，术语“衍生物”或“类似物”指结构对应于内源性神经肽，但与内源性神经肽相比展示了其结构的一些变化的化合物。特别是，术语“衍生物”或“类似物”包括如下化合物，其中神经肽的氨基酸序列或神经肽的N-末端氨基酸序列已被一种或多于一种氨基酸的添加、缺失或置换所改变，所述氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。术语“衍生物”或“类似物”还包括如下化合物，其中神经肽结构可以被一种或多于一种脂肪族保护基团例如甲基、乙基、丙基、环丙基、丁基、烯丙基等所取代。

在本发明特别有利的实施方案中，阿片肽是亮氨酸脑啡肽(LENK)或其衍生物。

在本发明特别有利的实施方案中，阿片肽是甲硫氨酸脑啡肽(MENK)或其衍生物。

在本发明特别有利的实施方案中，阿片肽是达拉根或其衍生物。

在本发明特别有利的实施方案中，阿片肽是京都啡肽或其衍生物。

在本发明特别有利的实施方案中，阿片肽是内吗啡肽或其衍生物。

在本发明特别有利的实施方案中，阿片肽是内腓呔或其衍生物。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自亮氨酸脑啡肽(LENK)或其衍生物的共价结合的神经肽。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自甲硫氨酸脑啡肽(MENK)或其衍生物的共价结合的神经肽。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自达拉根或其衍生物的共价结合的神经肽。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自京都啡肽或其衍生物的共价结合的神经肽。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自内吗啡肽或其衍生物的共价结合的神经肽。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的生物缀合物包含至少一种衍生自内腓呔或其衍生物的共价结合的神经肽。

在本发明的特定实施方案中，生物缀合物包含与至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价键合的至少一种神经肽，其由如下通式(SQ)表示：

其中m1为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，并且

m2为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，

并且其中

在本发明的上下文中，与符号

因此，结合位点可能直接涉及至少一种角鲨烯结构的烃化合物和至少一种神经肽之间的单个共价键，或可以由官能团表示，所述官能团由两个反应性官能团之间的相互作用产生，例如羧基官能团和醇官能团、羧基官能团和胺官能团之间的相互作用，或者可以由间隔基表示。因此，至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物可以通过共价键或通过间隔基或酯、磷酸盐/酯、二硫化物或酰胺型的官能团彼此连接。有利地，至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物可以通过间隔基彼此连接。

在本发明的上下文中，术语“间隔基”表示如下化合物，其在至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物之间形成共价键并作为至少一种神经肽的N-末端胺或C-末端酸和至少一种角鲨烯结构的烃化合物之间的接头。

在本发明有利的实施方案中，间隔基选自二氧羰基间隔基、二甘醇酸酯间隔基、碳酸酯间隔基、氨基甲酸酯间隔基和酰胺间隔基。

根据本发明，术语“碳酸酯间隔基”指用作间隔基的含有碳酸酯基团–O-(CO)-O-的有机化合物。

根据本发明，术语“氨基甲酸酯间隔基”指用作间隔基的含有氨基甲酸酯基团–O-(CO)-NH-的有机化合物。氨基甲酸酯间隔基还包括经取代的氨基甲酸酯，其中氨基甲酸酯的至少一个氢已经被基团所替代，所述基团选自烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、环烷基、经取代的环烷基和聚异戊二烯基。氨基甲酸酯间隔基还包括氨基甲酸酯。

根据本发明，术语“酰胺间隔基”(-NH-CO-)指通过用-NH-取代羟基-OH-而衍生自羧酸的有机化合物。术语“酰胺间隔基”包括伯酰胺和仲酰胺。对于仲酰胺，酰胺可以被烷基、烯基、经取代的烯基、环烷基和经取代的环烷基和聚异戊二烯基取代。酰胺还可以是含有一个氮原子的5元或6元杂环的形式。

在本发明特别有利的实施方案中，间隔基选自二氧羰基间隔基、二甘醇酸酯间隔基和酰胺间隔基。

根据本发明，生物缀合物的形成要求接触的至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物分别具有所谓的反应性官能团，即能够通过它们的相互作用形成期望的共价键。这些官能团可能会或可能不会天然存在于两个初始对象上。如果它们不天然存在于两个初始对象上，则初始对象在偶联反应之前将不得不经受修饰。

更准确地说，根据本发明的至少一种角鲨烯结构的烃化合物通常带有能够与所讨论的神经肽上存在的官能团反应的官能团，以建立两个实体之间的共价键，例如酯、磷酸盐/酯、二硫化物或酰胺键，从而形成共价生物缀合物。

有利地，能够与所讨论的神经肽上存在的官能团反应的官能团是酸或其衍生物，以任选地通过间隔基形成酰胺键或酯键。例如，能够与神经肽反应以形成上述复合物的角鲨烯结构的烃化合物是1,1',2-三-正-角鲨烯酸或其衍生物，例如其与氯甲酸乙酯混合的酸酐。优选地，使用衍生自1,1',2-三-正-角鲨烯酸的酰基氯。

根据另一个变体，它是醇官能团。例如，能够任选地通过间隔基与神经肽反应以形成上述缀合物的角鲨烯结构的烃化合物是衍生自1,1',2-三-正-角鲨烯醛(被LiAlH

根据另一个实施方案，两类分子之间存在的共价键可以由间隔基表示。在本发明特别有利的实施方案中，本发明的生物缀合物包含与至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价键合的至少一种神经肽，其中至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物通过间隔基彼此连接。

有利地，本发明的生物缀合物包含与至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价键合的至少一种神经肽，其中至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物通过间隔基彼此连接，间隔基选自二氧羰基间隔基、二甘醇酸酯间隔基、碳酸酯间隔基、氨基甲酸酯间隔基和酰胺间隔基。

有利地，本发明的生物缀合物包含与至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价键合的至少一种神经肽，其中通过使用二氧羰基间隔基共价键合至少一种神经肽的C-末端酸和至少一种角鲨烯结构的烃化合物。

有利地，本发明的生物缀合物包含与至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价连接的至少一种神经肽，其中通过使用二甘醇酸酯间隔基共价键合至少一种神经肽的N-末端胺和至少一种角鲨烯结构的烃化合物。

有利地，本发明的生物缀合物包含与至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价连接的至少一种神经肽，其中通过使用酰胺间隔基共价键合至少一种神经肽的N-末端胺和至少一种角鲨烯结构的烃化合物。

根据本发明在至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物之间建立至少一个共价键所需的偶联反应可以在标准条件下进行，因此它的实现显然是本领域技术人员知识的一部分。该反应通常在溶液中在根据的本发明所认为的至少一种角鲨烯结构的烃化合物的存在下进行，所述角鲨烯结构的烃化合物与根据本发明所使用的神经肽有关，并且在要求产生至少一种神经肽的C-末端酸或N-末端胺和至少一种角鲨烯结构的烃化合物的反应性官能团相互反应的标准条件下进行。

有利地，用于合成根据本发明的生物缀合物的角鲨烯结构的起始烃化合物是角鲨烯酸，例如1,1',2-三-正-角鲨烯酸，其可以通过琼斯试剂氧化1,1',2-三-正-角鲨烯醛来制备。

有利地，用于合成根据本发明的生物缀合物的角鲨烯结构的另一种起始烃化合物是角鲨烯酸衍生物，例如1,1',2-三-正-角鲨烯醇，其可以通过LiAlH

在本发明特别有利的实施方案中，本发明的生物缀合物选自：

有利地，本发明的生物缀合物(1)包含通过使用二氧羰基间隔基与1,1',2-三-正-角鲨烯酸共价键合的亮氨酸脑啡肽。

有利地，本发明的生物缀合物(2)包含通过使用二甘醇酸酯间隔基与1,1',2-三-正-角鲨烯醇共价键合的亮氨酸脑啡肽。

有利地，本发明的生物缀合物(3)包含通过使用酰胺间隔基与1,1',2-三-正-角鲨烯酸共价键合的亮氨酸脑啡肽。

本发明的生物缀合物可以通过本领域技术人员众所周知的方法来合成。

有利地，根据本发明的生物缀合物(1)通过以下方法合成：

-使1,1',2-三-正-角鲨烯酸与氯甲基氯磺酸酯接触以获得1,1',2-三-正-角鲨烯酸的氯甲酯，

-用Alloc基团保护亮氨酸脑啡肽的N-末端胺，

-使亮氨酸脑啡肽的羧酸酯官能团与1,1',2-三-正-角鲨烯酸的氯甲酯发生烷基化反应，

-使亮氨酸脑啡肽的N-末端胺脱保护以获得生物缀合物(1)。

用于制备根据本发明的生物缀合物(1)的方法能够获得一定量所述生物缀合物(1)，其中收率至少为9％，有利地为9.5％。

有利地，根据本发明的生物缀合物(2)通过以下方法合成：

-使1,1',2-三-正-角鲨烯醇与二甘醇酸酐接触以获得角鲨烯-二甘醇酸的溶液，

-使亮氨酸脑啡肽的胺官能团与角鲨烯-二甘醇酸的溶液发生缩合反应以获得生物缀合物(2)。

用于制备根据本发明的生物缀合物(2)的方法能够获得一定量所述生物缀合物(2)，其中收率至少为60％，有利地为69％。

有利地，根据本发明的生物缀合物(3)通过以下方法合成：

-使用氯甲酸乙酯对1,1',2-三-正-角鲨烯酸进行酸活化以获得混合的角鲨烯酸酐溶液，

-使亮氨酸脑啡肽的胺官能团与混合的角鲨烯酸酐溶液发生缩合反应以获得生物缀合物(3)。

用于制备根据本发明的生物缀合物(3)的方法能够获得一定量所述生物缀合物(3)，其中收率至少为70％，有利地为73％。

本发明的另一方面涉及如上定义的生物缀合物，其用作药物，优选用作抗痛觉过敏药物。

根据本发明，本发明的生物缀合物特别有利于减轻热痛觉过敏，并且与吗啡治疗相比具有更长的抗痛觉过敏作用。

根据本发明，生物缀合物特别有利于治疗疼痛疾病。如本文所用，术语“治疗”或“治愈性治疗”或“缓和”定义为导致治愈的治疗或减轻、改善和/或消除、减少和/或稳定疾病症状或其引起的痛苦的治疗。

有利地，疼痛疾病包括周围性和中枢性疼痛。在本发明的上下文中，周围性疼痛包括伤害性疼痛、炎性疼痛和神经性疼痛。

在本发明的上下文中，伤害性疼痛指生理性疼痛，并且在整个动物界中充当防御机制。在本发明的上下文中，由严重创伤引起和/或与炎性浸润有关的炎性疼痛可以由非甾体抗炎药(NSAID)类药物、类固醇和阿片类药物很好地控制。在本发明的上下文中，认为神经性疼痛是由感觉的固有缺陷引起的，并作为交感神经元的结果，且可以继发于创伤。

根据本发明，疼痛疾病包括由组织损伤引起的疼痛，例如炎症、感染、局部缺血、与肌肉骨骼疾病相关的疼痛(例如关节痛、牙痛)、头痛(例如偏头痛)、与手术相关的疼痛、与炎症相关的疼痛(例如肠易激综合征或关节炎)或胸痛。

根据本发明，疼痛疾病还包括复杂局部疼痛综合征(CRPS)、反射性交感神经营养不良(RSD)、灼痛、神经痛、中枢性疼痛和感觉障碍综合征、颈动脉痛、神经源性疼痛、难治性颈肋痛综合征、肌筋膜痛综合征、颅下颌疼痛功能障碍综合征、慢性特发性疼痛综合征、关节炎、类风湿性多关节炎病、贝氏病、纤维肌痛、考斯顿疼痛功能障碍、急性胸痛综合征、妇科疼痛综合征、髌股疼痛综合征、膝前区疼痛综合征、儿童复发性腹痛、绞痛、下腰痛综合征、神经性疼痛、截肢幻痛、幻牙痛或疼痛无感症。

根据本发明，疼痛疾病还可以包括癌症疼痛，例如与脑癌、骨癌、肺癌或前列腺癌有关的疼痛。

在本发明的有利实施方案中，本发明的生物缀合物特别有利于治疗疼痛疾病，特别是周围性和中枢性疼痛。在本发明的有利实施方案中，本发明的生物缀合物特别有利于治疗周围性疼痛，例如伤害性疼痛、炎性疼痛、神经性疼痛。

在本发明更特别有利的实施方案中，本发明的生物缀合物特别有利于治疗疼痛疾病，其包括由组织损伤引起的疼痛，例如炎症、感染、局部缺血；与肌肉骨骼疾病相关的疼痛(例如关节痛、牙痛)、头痛(例如偏头痛)、与手术相关的疼痛、与炎症相关的疼痛(例如肠易激综合征或关节炎)、胸痛、复杂局部疼痛综合征(CRPS)、反射性交感神经营养不良(RSD)、灼痛、神经痛、中枢性疼痛和感觉障碍综合征、颈动脉痛、神经源性疼痛、难治性颈肋痛综合征、肌筋膜痛综合征、颅下颌疼痛功能障碍综合征、慢性特发性疼痛综合征、关节炎、类风湿性多关节炎病、贝氏病、纤维肌痛、考斯顿疼痛功能障碍、急性胸痛综合征、妇科疼痛综合征、髌股疼痛综合征、膝前区疼痛综合征、儿童复发性腹痛、绞痛、下腰痛综合征、神经性疼痛、截肢幻痛、幻牙痛、疼痛无感症和癌症疼痛，例如与脑癌、骨癌、肺癌或前列腺癌有关的疼痛。

本发明的另一方面涉及包含如上定义的生物缀合物的纳米颗粒。

出人意料地，发明人发现，由根据本发明所认为的至少一种神经肽与本发明意义上的至少一种角鲨烯结构的烃化合物共价偶联形成的生物缀合物显示出在极性溶剂介质中以紧密形式自组织的能力，从而导致纳米颗粒的形成。

因此，根据本发明的另一个方面，本发明涉及根据本发明的生物缀合物的纳米颗粒。

在本发明的有利实施方案中，由此获得的纳米颗粒的平均直径为10nm至500nm，有利地10nm至250nm，有利地10nm至200nm，有利地60nm至120nm，有利地61nm至112nm，其使用电位分析仪((Malvern的注册商标)，Malvern仪器，英国)通过动态光散射来测量。有利地，纳米颗粒的平均直径为10nm至500nm、10nm至250nm、10nm至200nm，有利地60nm至120nm，有利地61nm至112nm。

因此，这些颗粒的尺寸证明了与任何施用方法相容，特别是经口、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼部、阴道、直肠、囊内、静脉内、经皮和腹膜内施用。

如上所述，纳米颗粒制剂是有利的，因为它显著地防止了至少一种神经肽的血浆降解并赋予神经肽显著的抗痛觉过敏作用，其持续时间比用吗啡治疗后的持续时间更长。纳米颗粒制剂还允许将神经肽特异性递送至发炎的组织中用于控制疼痛。

当然，根据本发明的纳米颗粒能够在其表面上带有许多反应性官能团，例如羧基或胺官能团。因此，可以想到将各种分子固定在这些官能团上，特别是通过共价键固定。

作为可能与纳米颗粒相关的这种类型的分子的说明性、非限制性实例，可以特别提到标记类型的分子(即任何荧光探针或在近红外发射的探针，如氟硼二吡咯-胆固醇或DilC18)、MRI造影剂(即钆或氧化铁)、能够提供靶向官能团的化合物以及能够赋予它们特定药代动力学特性的任意化合物。关于最后提到的这个方面，可以因此设想在这些纳米颗粒的表面上固定聚乙二醇的亲脂性衍生物，例如聚乙二醇/胆固醇缀合物、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺或更好的聚乙二醇/角鲨烯。事实上，考虑到角鲨烯残基彼此之间的天然亲和性，在当前情况下，聚乙二醇/角鲨烯缀合物与根据本发明的纳米颗粒结合，并因此导致形成表面涂覆了聚乙二醇的纳米颗粒。而且，如已提到的，在根据本发明的纳米颗粒的形成过程中，聚乙二醇/角鲨烯缀合物由于其两亲性行为而有利地充当表面活性剂，并因此稳定胶体悬浮液，从而减小所形成的纳米颗粒的尺寸。

在特别有利的实施方案中，包含如上定义的生物缀合物的纳米颗粒还可以包括抗炎化合物。作为抗炎化合物的说明性、非限制性实例，抗炎化合物可以是可的松、氢化可的松、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、吲哚美辛和任何其它AINS。

根据有利的实施方案，根据本发明的纳米颗粒被配制为水分散体。

根据另一个有利的实施方案，根据本发明的纳米颗粒是冷冻干产物的形式。

有利地，它们是通过如上定义的间隔基共价键合至少一种神经肽和至少一种角鲨烯结构的烃化合物而形成的纳米颗粒。

它们还可以有利地为亮氨酸脑啡肽角鲨烯与二氧羰基间隔基或亮氨酸脑啡肽角鲨烯与二甘醇间隔基或亮氨酸脑啡肽角鲨烯与酰胺间隔基的纳米颗粒。

更准确地说，纳米颗粒是通过使生物缀合物与水介质在有利于其以纳米颗粒形式聚集的条件下接触而形成的。它们特别可以是所谓的纳米沉淀方法或乳液/溶剂蒸发方法。

根据本发明的纳米颗粒可以有利地按照以下方法获得。根据本发明的生物缀合物分散在至少一种有机溶剂(例如，醇例如乙醇、或丙酮)中，其浓度足以在搅拌下向水相中通常逐滴加入所得混合物时瞬时形成在所述水相中悬浮的根据本发明纳米颗粒。如果适用，通过本领域技术人员众所周知的技术分离所述纳米颗粒。

在本发明特定的实施方案中，至少一种有机溶剂可以是乙醇并且至少一种有机溶剂的浓度为1mg/ml至10mg/ml，有利地6mg/ml至9mg/ml，有利地7mg/ml至9mg/ml，有利地至少一种有机溶剂的浓度为8mg/ml。

在本发明特定的实施方案中，水相可以是右旋糖水溶液，有利地为5％的右旋糖水溶液。最后，通过在真空下蒸发除去有机溶剂。

纳米沉淀通常可在室温下进行。然而，应用温度不得影响所讨论的神经肽的活性。制备根据本发明的纳米颗粒的方法是特别有利的，因为它不需要表面活性剂的强制性存在。换句话说，纳米沉淀在不存在表面活性剂的情况下进行。这一特性特别可取，因为大量表面活性剂与体内应用是不相容的。因此，本发明的另一个优点是制备根据本发明的所述组合物不需要潜在有毒的有机溶剂或表面活性剂。然而，应当理解在本发明的上下文中，可以想到使用通常有利地没有任何毒性的表面活性剂。而且，这类表面活性剂可以在纳米颗粒形成过程中获得甚至更小的尺寸。作为可以在本发明中使用的这类表面活性剂的说明性、非限制性实例，可以特别提及聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚乙二醇的磷脂衍生物和亲脂性衍生物。作为聚乙二醇的亲脂性衍生物，可以提及例如聚乙二醇胆固醇。作为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的实例，可以特别提及聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物，也称为

本发明的另一方面涉及药物组合物，所述组合物包含如上定义的生物缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体，生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质。在特定的实施方案中，本发明涉及药用组合物，所述组合物包含如上定义的药学有效量的生物缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，所述生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的药用组合物特别有利于治疗疼痛疾病。

在一个实施方案中，对象是人。在另一个实施方案中，对象是非人的动物，例如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊或灵长类动物。

根据涉及向需要治疗的对象施用治疗有效量的生物缀合物的实施方案，所述生物缀合物任选地为本文提供的纳米颗粒形式，“治疗有效的”或“治疗有效量”或“药学有效的”表示抑制或逆转疾病状态(例如治疗疼痛疾病)所需的生物缀合物或组合物的量。治疗有效量的确定具体取决于药物的毒性和疗效等因素。这些因素将根据其他因素例如效能、相对生物利用度、对象体重、不良副作用的严重程度和优选的施用方式而有所不同。可以使用本领域众所周知的方案测定毒性。可以利用相同的指南确定疗效。疗效可通过疼痛减轻来测量，例如在卡拉胶诱导的大鼠足肿胀模型中(Hargreaves测试)。因此，药学有效量是临床医生认为毒理学上可耐受但有效的量。

根据施用方式，可以适当调节剂量以达到所需的局部或全身药物(例如本发明的生物缀合物，任选地为纳米颗粒形式)水平。如果在这些剂量下对象的应答不足，则在对象耐受允许的范围内可以采用甚至更高的剂量(或通过不同的、更局部化的递送途径的有效更高剂量)。也可采用每天多剂量以达到适当的神经肽系统水平。适当的系统水平可以通过例如测量对象的峰值或持续药物血浆水平来测量。“剂量”和“用量”在本文中可交换使用。

在一些实施方案中，根据疼痛程度，施用至对象的生物缀合物的量为1mg至100mg/kg，所述生物缀合物为纳米颗粒形式或包含生物缀合物作为活性物质的药物组合物形式。当然，当需要时可以重复这种单位剂量。

在一些实施方案中，提供的药物组合物用于体内应用。根据体内施用的预期模式，所用的药物组合物可以是固体、半固体或液体的剂型，例如片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、凝胶剂、软膏剂、液体、混悬剂等。优选地，药物组合物以适于精准剂量的单次施用的单位剂型来施用。根据所需制剂，药物组合物还可以包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的基于水的载体。选择稀释剂以避免影响特异性结合分子或感兴趣的融合蛋白的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和Hank溶液。相同的稀释剂可用于重组感兴趣的冻干重组蛋白。另外，药物组合物还可以包括其他药物、药剂、载体、佐剂、无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。这种稀释剂或载体的有效量是在组分的溶解度、生物活性等方面有效获得药学上可接受的制剂的量。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物是无菌的。

在体内治疗的过程中可以通过任何途径施用，包括经口、肠胃外、经皮、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼部、阴道和直肠。也可采用囊内、静脉内和腹膜内施用途径。本领域技术人员认识到施用途径根据待治疗的疾病而变化。例如，药物组合物或生物缀合物(任选地以本文的纳米颗粒形式)可以通过经口、肠胃外或局部施用来向对象施用。在一个实施方案中，药物组合物或生物缀合物(任选地以本文的纳米颗粒的形式)通过静脉输注来施用。

当需要系统地递送它们时，药物组合物可以配制成通过注射肠胃外施用，例如通过推注注射或连续输注。注射用制剂可以以单位剂型(例如以安瓶或以多剂量容器的形式)呈现，并具有添加的防腐剂。药物组合物可以是在油性或水性载体中的混悬剂、溶液或乳液的形式，并且可以含有配方剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性药物组合物的水溶液。另外，活性药物组合物的悬浮液可以制备成油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可能含有增加混悬剂黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，混悬剂还可以含有合适的稳定剂或增加药物组合物溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。或者，活性组合物在使用前可以以粉末形式与合适的载体例如无菌无热原的水组成。

对于经口施用，药物组合物可以采用例如通过常规方法制备的片剂或胶囊剂形式与药学上可接受的赋形剂例如黏合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)一起制备。片剂可以通过本领域众所周知的方法包衣。用于经口施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或混悬剂的形式，或者它们可以作为干燥产品存在以在使用前用水或其它合适的载体组成。这些液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂例如助悬剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)制备。该制剂视情况还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。还需要增加神经肽的整体稳定性和增加在体内的循环时间。这种分子的实例包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。可使用的其它分子是聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧杂环辛烷。如上所述，优选用于药物的是聚乙二醇分子。对于经口施用，释放部位可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域技术人员具有可用的制剂，其不会在胃中溶解，但将在十二指肠或肠中的其它地方释放物质。优选地，释放将避免胃环境的有害作用，或通过将生物活性物质释放到胃环境之外，例如肠中。

对于口腔给药，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于吸入给药，根据本公开使用的组合物可以从压力包中以气雾剂喷雾形式或使用适当的推进剂的喷雾器的形式方便地输送，推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供递送计量的量的阀门来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒，例如明胶胶囊和药筒，其含有组合物的粉末混合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉。

本文还考虑了肺递送。药物组合物可以递送至哺乳动物的肺同时吸入并穿过肺上皮衬里到达血流预期在本公开的实践中使用的是设计用于肺部递送治疗产品的广泛的机械装置，其包括但不限于喷雾器、计量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。

还考虑了本文公开的药物组合物的鼻递送。鼻递送允许本公开的药物组合物在将治疗产品施用至鼻后直接通过至血流，而不需要产品在肺中沉积。用于鼻递送的制剂包括具有右旋糖酐或环糊精以及生物黏附赋形剂(例如壳聚糖)的那些。

药物组合物还可以配制成直肠或阴道组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。

药物组合物还可以包括合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。

合适的液体或固体药物制剂形式是例如微囊化的、包封的、涂覆到微观金颗粒上的、包含在脂质体中的、雾化的、气溶胶的、以用于植入皮肤的小球形式的、或干燥到要划进皮肤的尖锐物体上的用于吸入的水溶液或盐水溶液。药物组合物还包括颗粒即、散剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、霜剂、皮肤或透皮贴剂、滴剂或具有活性组合物长期释放的制剂，在它们的制备中，赋形剂和添加剂和/或助剂例如崩解剂、黏合剂、被膜剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂通常如上所述使用。要物组合物适用于各种药物递送系统。

我们可以设想配置根据本发明的至少一种生物缀合物和/或纳米颗粒，其速率为0.1重量％至10重量％，所述速率以神经肽活性物质的重量表示，或甚至更多，相对于所考虑的药物组合物的总重量。

在本发明特别有利的实施方案中，根据本发明的药物组合物仅包含如上定义的生物缀合物，任选地以纳米颗粒的形式作为独特的活性物质。

在本发明另一个有利的实施方案中，包含如上定义的生物缀合物的药物组合物，所述生物缀合物任选地为纳米颗粒形式，还可以包含一种或多于一种活性物质，例如可以与生物缀合物协同相互作用的抗炎化合物。

本发明的另一个对象涉及用于有需要的患者的疼痛疾病预防治疗的方法，其包括向所述患者施用如上定义的生物缀合物，任选地以纳米颗粒形式作为活性物质、或向所述患者施用包含如上定义的治疗有效量的生物缀合物和如上定义的至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物，所述生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质。更优选地，疼痛疾病包括由组织损伤引起的疼痛，例如炎症、感染、局部缺血；与肌肉骨骼疾病相关的疼痛(例如关节痛、牙齿痛)、头痛(例如偏头痛)、与手术相关的疼痛、与炎症相关的疼痛(例如肠易激综合征或关节炎)、胸痛、复杂局部疼痛综合征(CRPS)、反射性交感神经营养不良(RSD)、灼痛、神经痛、中枢性疼痛和感觉障碍综合征、颈动脉痛、神经源性疼痛、难治性颈肋痛综合征、肌筋膜痛综合征、颅下颌疼痛功能障碍综合征、慢性特发性疼痛综合征、关节炎、类风湿性多关节炎病、贝氏病、纤维肌痛、考斯顿疼痛功能障碍、急性胸痛综合征、妇科疼痛综合征、髌股疼痛综合征、膝前区疼痛综合征、儿童复发性腹痛、绞痛、下腰痛综合征、神经性疼痛、截肢幻痛、幻牙痛、疼痛无感症和癌症疼痛，例如脑癌、骨癌、肺癌、前列腺癌或抗癌治疗诱发的疼痛。

在本发明的上下文中，术语“防止”或“预防”或“预防性治疗”或“预防治疗”包括导致疾病预防的治疗以及降低和/或延缓疾病事故或其发生风险的治疗。

在特别有利的实施方案中，本发明涉及包含如上定义治疗有效量的生物缀合物的药物组合物在制备用于预防疼痛疾病的药物产品中的用途，所述生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质。

在特别有利的实施方案中，本发明涉及包含如上定义的治疗有效量的生物缀合物在制备用于预防疼痛疾病的药物产品中的用途，所述生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质，所述疼痛疾病选自由组织损伤引起的疼痛，例如炎症、感染、局部缺血；与肌肉骨骼疾病相关的疼痛(例如关节痛、牙齿痛)、头痛(例如偏头痛)、与手术相关的疼痛、与炎症相关的疼痛(例如肠易激综合征或关节炎)、胸痛、复杂局部疼痛综合征(CRPS)、反射性交感神经营养不良(RSD)、灼痛、神经痛、中枢性疼痛和感觉障碍综合征、颈动脉痛、神经源性疼痛、难治性颈肋痛综合征、肌筋膜痛综合征、颅下颌疼痛功能障碍综合征、慢性特发性疼痛综合征、关节炎、类风湿性多关节炎病、贝氏病、纤维肌痛、考斯顿疼痛功能障碍、急性胸痛综合征、妇科疼痛综合征、髌股疼痛综合征、膝前区疼痛综合征、儿童复发性腹痛、绞痛、下腰痛综合征、神经性疼痛、截肢幻痛、幻牙痛、疼痛无感症和癌症疼痛，例如脑癌、骨癌、肺癌、前列腺癌或抗癌治疗诱发的疼痛。

本发明的另一个对象涉及用于治疗有需要的患者的疼痛疾病的方法，其包括向所述患者施用如上定义的生物缀合物，任选地以纳米颗粒形式作为活性物质、或向所述患者施用包含如上定义的治疗有效量的生物缀合物和如上定义的至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物，所述生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质。更优选地，疼痛疾病包括由组织损伤引起的疼痛，例如炎症、感染、局部缺血；与肌肉骨骼疾病相关的疼痛(例如关节痛、牙痛)、头痛(例如偏头痛)、与手术相关的疼痛、与炎症相关的疼痛(例如肠易激综合征或关节炎)、胸痛、复杂局部疼痛综合征(CRPS)、反射性交感神经营养不良(RSD)、灼痛、神经痛、中枢性疼痛和感觉障碍综合征、颈动脉痛、神经源性疼痛、难治性颈肋痛综合征、肌筋膜痛综合征、颅下颌疼痛功能障碍综合征、慢性特发性疼痛综合征、关节炎、类风湿性多关节炎病、贝氏病、纤维肌痛、考斯顿疼痛功能障碍、急性胸痛综合征、妇科疼痛综合征、髌股疼痛综合征、膝前区疼痛综合征、儿童复发性腹痛、绞痛、下腰痛综合征、神经性疼痛、截肢幻痛、幻牙痛、疼痛无感症和癌症疼痛，例如脑癌、骨癌、肺癌、前列腺癌或抗癌治疗诱发的疼痛。

在特别有利的实施方案中，本发明涉及包含如上定义治疗有效量的生物缀合物的药物组合物在制备用于治疗疼痛疾病的药物产品中的用途，所述生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质。

在特别有利的实施方案中，本发明涉及包含如上定义的治疗有效量的生物缀合物的药物组合物在制备用于治疗疼痛疾病的药物产品中的用途，所述生物缀合物任选地以纳米颗粒形式作为活性物质，所述疼痛疾病选自由组织损伤引起的疼痛，例如炎症、感染、局部缺血；与肌肉骨骼疾病相关的疼痛(例如关节痛、牙痛)、头痛(例如偏头痛)、与手术相关的疼痛、与炎症相关的疼痛(例如肠易激综合征或关节炎)、胸痛、复杂局部疼痛综合征(CRPS)、反射性交感神经营养不良(RSD)、灼痛、神经痛、中枢性疼痛和感觉障碍综合征、颈动脉痛、神经源性疼痛、难治性颈肋痛综合征、肌筋膜痛综合征、颅下颌疼痛功能障碍综合征、慢性特发性疼痛综合征、关节炎、类风湿性多关节炎病、贝氏病、纤维肌痛、考斯顿疼痛功能障碍、急性胸痛综合征、妇科疼痛综合征、髌股疼痛综合征、膝前区疼痛综合征、儿童复发性腹痛、绞痛、下腰痛综合征、神经性疼痛、截肢幻痛、幻牙痛、疼痛无感症和癌症疼痛，例如脑癌、骨癌、肺癌、前列腺癌或抗癌治疗诱发的疼痛。

本发明的另一方面涉及包含生物缀合物的贴剂，所述生物缀合物任选地为如上定义的纳米颗粒形式。如本文所用的，术语“贴剂”或“透皮贴剂”是指含有本发明的生物缀合物的垫，所述生物缀合物任选地为纳米颗粒形式，被置于患者的外表面，用于将活性物质吸收到血流、皮肤或下面的组织中。

贴剂通常放置在皮肤上，并且本发明的生物缀合物，任选地以纳米颗粒的形式，随着时间从贴剂中逐渐释放。贴剂可以是黏性贴剂。

贴剂可以设计为递送生物缀合物，任选地以纳米颗粒形式以任意合适的速率递送至对象。如美国专利第6348211号(Juan Mantelle等人)所示，其中通过改变成分的选择、成分的量、如何制备制剂和其它制剂工艺参数，可以获得期望的递送速率。

在一些实施方案中，在施用贴剂之后，透皮贴剂将至少1mg活性剂经皮递送至对象，其递送时间为至少30分钟内，有利地为至少一小时，有利地为至少2小时，有利地为至少3小时，有利地为至少4小时，有利地为至少5小时，有利地为至少6小时，有利地为至少7小时，有利地为至少8小时，有利地为至少9小时，有利地为至少10小时，有利地为至少11小时，有利地为至少12小时，有利地为至少13小时，有利地为至少14小时，有利地为至少15小时，有利地为至少16小时，有利地为至少17小时，有利地为至少18小时，有利地为至少19小时，有利地为至少20小时，有利地为至少21小时，有利地为至少22小时，有利地为至少23小时，有利地为至少24小时；在一些情况下，为5mg至175mg；并且在一些情况下，为5mg至120mg。

贴剂包括含药物的层，其包含生物缀合物，任选地为纳米颗粒形式。除了生物缀合物，任选地为纳米颗粒形式，含药物的层包含用于携带活性药物的载体材料。将活性剂与载体材料混合(例如共混、分散在其中、封装在其中等)。通常，载体材料包含适于透皮药物递送的成分，例如黏合剂、溶剂、添加剂、佐剂、增塑剂、增黏剂、皮肤渗透增强剂、交联剂或其它赋形剂物质。

生物缀合物，任选地为纳米颗粒形式，可以以任何方式混合在载体材料中，其包括均质掺合物、非均质掺合物或其组合。例如，药物可以均匀分散在含药物的层中。在另一个实例中，药物可以在含药物的层的交联聚合物基质内形成微球。

在本发明特别有利的实施方案中，包含生物缀合物的贴剂可以是配有微针的贴剂，生物缀合物任选地为如上定义的纳米颗粒形式。

本发明的另一方面涉及包含生物缀合物的贴剂用于治疗疼痛疾病，生物缀合物任选地为如上定义的纳米颗粒形式。

附图

图1显示了NP特征：显示不同生物缀合物形成NP的代表性Cryo-TEM图像：(A)LENK-SQ-Diox NP、(B)LENK-SQ-Dig NP和(C)LENK-SQ-Am NP，其在Milli-Q水中的浓度为4mg/ml。比例尺＝100nm。NP的物理化学特征(即大小、多分散性指数(PDI)、ζ电势和％药物负载)示于表中。

图2显示了在血清的存在下，LENK-SQ生物缀合物向LENK的体外生物转化。(A)具有二氧羰基接头的LENK-SQ(B)具有二甘醇接头的LENK-SQ(C)具有酰胺键的LENK-SQ。实线和虚线分别表示生物缀合物和释放的肽。

图3显示了痛觉过敏的实验设计。在由足底卡拉胶注射(2％生理盐水，100μL)诱导的病理生理学背景下测试了NP的镇痛作用。使用脑通透性阿片类拮抗剂纳洛酮(Nal)和脑不通透性阿片受体拮抗剂纳洛酮甲硫氨酸(Nal-M)进行中枢或外周阿片受体参与的研究。NP混悬剂或对照溶液在30s内以10mL/kg的剂量体积静脉注射。在NP施用后10分钟进行Hargreaves测试，然后每30分钟进行一次，直至250分钟。20mg/kg LENK-SQ NP的剂量相当于11.48mg/kg的LENK和8.28mg/kg的SQ NP，且相当于20.66毫摩尔/千克的LENK-SQ和LENK。

图4显示了在λ卡拉胶诱导的炎性疼痛注射大鼠中，用吗啡(A、B)、LENK-SQ-DioxNP(C、D)、LENK-SQ-Dig NP(E、F)和LENK-SQ-Am NP(G、H)进行急性治疗的抗痛觉过敏作用。在λ卡拉胶注入右后足后3h，进行吗啡、LENK-SQ NP、Nal、Nal-M、LENK、空白SQ NP或右旋糖溶液(载体)的施用(箭头，横坐标上的0)。在Hargreaves测试中，吗啡(A)、LENK-SQ-Diox NP(C)、LENK-SQ-Dig NP(E)和LENK-SQ-Am NP(G)导致缩足反应潜伏期的增加(单位为秒，每组5-9只动物独立测定的平均±SEM)。*、#、$P<0.05，**、##、$$P<0.01，***、###、$$$P<0.001(*：与右旋糖溶液或LENK溶液比较，#：与吗啡比较；$：与LENK-SQ NP比较。重复测量的双因素方差分析，Bonferroni后检验)。在吗啡或LENK-SQ NP注射前15分钟施用Nal或Nal-M。基于横坐标：对照

图5显示了静脉注射荧光LENK-SQ-Am NP或对照荧光染料溶液后的小鼠及其器官的腔内扫描(腹面观)。(A)荧光LENK-SQ-Am NP在右后足发炎的小鼠中的生物分布。(B)荧光LENK-SQ-Am NP在右后足不发炎的小鼠中的生物分布(盐水只注射到右后足)。(C)游离染料在右足发炎的小鼠中的生物分布。(D)A组在2h时的缩放。(E)B组在2h时的缩放。(F)具有相同目的区域(ROI)的足的定量分析。R＝右后足，L＝左后足。

图6显示了荧光LENK-SQ-Am NP或对照荧光染料溶液在足不发炎的小鼠中的生物分布。在λ卡拉胶或盐水注射到右足后4h，将荧光LENK-SQ NP或游离染料静脉注入小鼠。在不同时间点，在通过经心灌注40ml盐水(8毫升/分钟)进行安乐死之前，用氯胺酮(100mg/kg，i.p.)和甲苯噻嗪(10mg/kg，i.p.)对小鼠进行深度麻醉，直到流出右心房的液体完全透明。然后，切除肝、脾、肾、心脏、肺、脑和发炎的右后足并立刻用成像器成像。使用LivingImage软件对目的区域(ROI)内发出的荧光进行定量，阈值为20％。(A)从注射了荧光NP或游离染料的SWISS小鼠中获得的脑、心脏、肾、肺、肝和足的体外荧光成像。(B)注射NP或游离染料4h或24h后这些器官的平均辐射效率。

实施例：

1.

按照先前所述的(35、36)通过琼斯试剂氧化1,1',2-三-正-角鲨烯醛来合成1,1',2-三-正-角鲨烯酸。向DCM(2mL)中的1,1',2-三-正-角鲨烯酸(400mg，1毫摩尔)和n-Bu

2.

向3mL DMF中Alloc-LENK(285mg，0.445毫摩尔)和NaHCO

3.

在氩气下，向MeOH(11mL)中Alloc-LENK-SQ(110mg，0.1毫摩尔)和10％Pd-C(20重量％的Alloc-LENK-SQ-Diox)的搅拌溶液中滴加纯三乙基硅烷(TES)(1215mg，10毫摩尔)。当反应完成时，通过硅藻土过滤混合物以除去Pd-C和残留的TES，并通过蒸发除去溶剂。残留物首先通过硅胶DCM/EtOH(90/10)上的快速柱色谱纯化。在进行第二次纯化之前将得到的产物溶解在200μL乙醇中，以得到纯产物(23mg；收率为23％)，所述第二次纯化通过半制备型反相HPLC(RP-HPLC)系统(Waters，Ma 01757，美国)在uptisphere C18色谱柱(100×21.2mm，孔径＝5μm)(Interchim，加利福尼亚，美国)上分析。然后使用由乙酸铵缓冲液(20mM)组成的流动相进行梯度洗脱来进行HPLC，并且用ACN的10％至100％的线性梯度以21毫升/分钟的流动速率进行10分钟的ACN洗脱，然后将系统保持在100％的ACN中，等度流动10分钟。将温度设为30℃并在280nm和257nm处监测UV检测。保留时间为15分钟，在偶联和脱保护步骤后，纯产物的总收率为9.5％。

生物缀合物LENK-SQ-Diox的IR、NMR和MS信息：IR(纯，cm-1)：ν3289，2958，2916，2849，1763，1646，1537，1515，1447，1381，1259，1116，1020，982，870，802，729，700，549，493.1H NMR(400MHz，MeOD)δ：7.31-7.23(m，4H，2H Ar-邻Phe，2H Ar-间Phe)，7.18(m，1H，HAr-对Phe)，7.04(d，2H，H Ar-邻Tyr，J＝8.4Hz)，6.71(d，2H，H Ar-间Tyr，J＝8.4Hz)，5.77(d，1H，OCH2O，J＝5.6Hz)，5.71(d，1H，OCH2O，J＝5.6Hz)，5.19-5.04(m，5H，HC＝C(CH3))，4.65(dd，1H，CH Phe，J＝4.9Hz，J＝9.6Hz)，4.44(m，1H，CH Leu)，4.00-3.60(m，4H，2CH2Gly)，3.54(dd，1H，CH Tyr，J＝6.5Hz，J＝7.6Hz)，3.16(dd，1H，C HaHb Phe，J＝4.9Hz，J＝14.0Hz)，3.10-2.87(m，2H，CHaHb Phe，CHaHb Tyr)，2.80(dd，1H，C HaHb Tyr，J＝7.6Hz，J＝13.9Hz)，2.44(m，2H，CH2-CH2CO SQ)，2.26(m，2H，CH2-CH2CO SQ)，2.14-1.90(m，16H，8CH2 SQ)，1.75-1.48(m，21H，CH2 Leu，CH(CH3)2Leu，6CH3 SQ)，0.94(d，3H，CH3 Leu，J＝6.2Hz)，0.90(d，3H，CH3 Leu，J＝6.2Hz).13C NMR(75MHz，MeOD)δ：178.0(CONH)，173.7(CONH)，173.0(CONH)，172.4(CONH)，172.0(CONH)，171.3(CONH)，157.6(C Ar-对Tyr)，138.3(C Ar Phe)，136.0(HC＝C(CH3))，135.8(2HC＝C(CH3))，134.1(HC＝C(CH3))，132.0(HC＝C(CH3))，131.5(2CH Ar-邻Tyr)，130.4(2CH Ar-邻Phe)，129.5(2CH Ar-间Phe，C ArTyr)，127.8(CH Ar-对Phe)，126.5(HC＝C(CH3))，125.7(HC＝C(CH3))，125.5(2HC＝C(CH3))，125.4(HC＝C(CH3))，(HC＝C(HC＝C(CH3))，116.5(2CH Ar-间Tyr)，80.9(O-CH2-O)，62.6(CH Tyr)，55.8(CH Phe)，52.2(CH Leu)，43.8(CH2 Gly)，43.6(CH2 Gly)，41.0(CH2-CH(CH3)2 Leu)，40.8(CH2 SQ)，40.7(2CH2 SQ，CH2Tyr)，38.7(CH2Phe)，35.3(CH2-CH2-CO)，33.8(CH2-CH2-CO)，30.7(CH2 SQ)，30.4(CH2 SQ)，29.2(CH2 SQ)，27.8(CH2 SQ)，27.5(CH2 SQ)，25.9(CH(CH3)2Leu)，23.4(CH3 Leu)，21.9(CH3 Leu)，17.8(CH3 SQ)，16.7(CH3 SQ)，16.2(CH3 SQ)，16.1(CH3 SQ)，16.0(CH3 SQ)，14.5(CH3 SQ).HRMS(+ESI)：m/z968.6064([M+H]+计算值C56H82N5O9：968.6107).

根据先前所述的方法(35-37)，通过1,1',2-三-正-角鲨烯醛从角鲨烯合成1,1',2-三-正-角鲨烯醇。向3mL干燥吡啶中的1,1',2-三-正-角鲨烯醇(200mg,0.52毫摩尔)溶液中加入二甘醇酸酐(150mg，1.29毫摩尔)。反应在室温下搅拌过夜。除去溶剂并用DCM从稀盐酸和盐水中提取残留物。通过TLC监测角鲨烯-二甘醇酸的转化率约为100％。将所得产物在真空下干燥，并用于下一步骤而无需进一步纯化。在0℃氩气下向1mL无水THF中的角鲨烯-二甘醇酸(50mg，0.1毫摩尔)和三乙胺(TEA)(12mg，0.12毫摩尔)的溶液中加入氯甲酸乙酯(10.8mg，0.1毫摩尔)。在室温下1h内搅拌反应，并加入1mL无水DMF中的LENK(55mg，0.1毫摩尔)溶液。在40℃下，将混合物在氩气搅拌保持2天。在真空下除去溶剂并使用硅胶层析(用梯度洗脱剂DCM/EtOH:100/0至90/10来纯化)纯化粗产物。然后通过使用EtOH/AcOEt(40/60)作为溶剂在硅胶上简单过滤来除去铵盐。获得纯生物缀合物，其收率为69％。

生物缀合物LENK-SQ-Dig的IR、NMR和MS信息：IR(纯，cm-1):ν3297，3068，2958，2924，2851，1653，1516，1443，1260，1142，1099，1020，799，699，583.1H NMR(400MHz，MeOD)δ：7.30-7.22(m，4H，2H Ar-邻Phe，2H Ar-间Phe)，7.19(m，1H，H Ar-对Phe)，7.06(d，2H，HAr-邻Tyr，J＝8.5Hz)，6.71(d，2H，H Ar-间Tyr，J＝8.5Hz)，5.20-5.05(m，5H，HC＝C(CH3))，4.65(dd，1H，CH Phe，J＝4.7Hz，J＝9.4Hz)，4.57(dd，1H，CHTyr，J＝6.1Hz，J＝8.3Hz)，4，40(m，1H，CH Leu)，4.17-3.85(m，6H，2C H2二羟乙酰基，C H2-O SQ)，3.90-3.72(m，4H，2C H2Gly)，3.20(dd，1H，C HaHb Phe，J＝4.7Hz，J＝14.0Hz)，3.11(dd，1H，C HaHb Tyr，J＝6.1Hz，J＝13.9Hz)，3.00-2.89(m，2H，CHaHb Phe，CHaHb Tyr)，2.14-1.93(m，19H，9CH2 SQ，CHaHb-CH2-O SQ)，1.74(m，1H，CHaHb-CH2-O SQ)，1.71-1.54(m，21H，CH2Leu，CH(CH3)2，6CH3 SQ)，0.94(d，3H，CH3 Leu，J＝6.2Hz)，0.91(d，3H，CH3 Leu，J＝6.2Hz).13C NMR(75MHz，MeOD)δ：176.8(CONH)，174.2(CONH)，173.4(CONH)，172.2(O-CO-CH2)，172.0(CONH)，171.3(CONH)，157.5(C Ar-对Tyr)，138.5(C Ar Phe)，135.9(3HC＝C(CH3))，134.8(HC＝C(CH3))，132.0(HC＝C(CH3))，131.4(2CH Ar-邻Tyr)，130.4(2CH Ar-邻Phe)，129.4(2CH Ar-间Phe)，128.6(C Ar Tyr)，127.7(CH Ar-对Phe)，126.3(HC＝C(CH3))，125.6(2HC＝C(CH3))，125.5(HC＝C(CH3))，125.4(HC＝C(CH3))，116.3(2CH Ar-间Tyr)，71.5(O-CH2-O)，69.4(CO-CH2-O)，65.9(CH2-CH2-CH2-O)，56.2(CH Tyr)，56.0(CH Phe)，52.3(CH Leu)，44.0(CH2 Gly)，43.4(CH2 Gly)，41.7(CH2-CH(CH3)2Leu)，38.6(CH2Phe)，37.9(CH2 Tyr)，36.8(CH2-CH2-CH2-O)，29.2(CH2 SQ)，27.8(2CH2 SQ)，27.6(3CH2 SQ)，25.9(CH(CH3)2Leu，CH3 SQ)，23.4(CH3 Leu)，22.0(CH3 Leu)，17.8(CH3 SQ)，16.2(2CH3 SQ)，16.0(2CH3SQ).HRMS(-ESI)：m/z 1038.61572([M-H]-计算值C59H84N5O11：1038.61618).

在氩气下将1，1′，2-三-正-角鲨烯酸(100mg，0.25毫摩尔)和TEA(34.79mg，0.3毫摩尔)溶解在1.5mL无水THF中，并在0℃下将氯甲酸乙酯(27mg，0.25毫摩尔)加入混合物中。允许在室温下对反应进行加热并在搅拌下保持1h。然后将1.5mL无水DMF中的LENK(138mg，0.25毫摩尔)溶液加入反应并将混合物在搅拌下保持2天。在真空下除去溶剂并使用硅胶层析(用梯度洗脱剂DCM/EtOH：100/0至90/10来纯化，然后用EtOH/AcOEt：40/60简单过滤以除去铵盐)纯化粗产物。获得纯生物缀合物，其收率为73％。

生物缀合物LENK-SQ-Am的IR、NMR和MS信息：IR(纯，cm-1)：ν3303，2957，2925，2856，1711，1697，1543，1516，1440，1282，1241，1213，828，671.1H NMR(400MHz，MeOD)δ：7.31-7.22(m，4H，2H Ar-邻Phe，2H Ar-间Phe)，7.18(m，1H，H Ar-对Phe)，7.05(d，2H，H Ar-邻Tyr，J＝8.5Hz)，6.71(d，2H，H Ar-间Tyr，J＝8.5Hz)，5.19-5.05(m，5H，HC＝C(CH3))，4.68(dd，1H，CH Phe，J＝4.9Hz，J＝9.2Hz)，4.50-4.39(m，2H，CH Tyr，CH Leu)，3.87-3.67(m，4H，2CH2 Gly)，3.20(dd，1H，C HaHb Phe，J＝4.9Hz，J＝14.0Hz)，3.07-2.93(m，2H，CHaHb Phe，CHaHb Tyr)，2.85(dd，1H，C HaHb Tyr，J＝8.2Hz，J＝13.8Hz)，2.31(m，2H，CH2-CH2-CO)2.18(m，2H，CH2-CH2-CO)，2.13-1.88(m，16H，8CH2 SQ)，1.73-1.53(m，21H，CH2Leu，CH(CH3)2Leu，6CH3 SQ)，0.94(d，3H，CH3 Leu，J＝6.2Hz)，0.91(d，3H，CH3 Leu，J＝6.2Hz).13C NMR(75MHz，MeOD)δ：176.2(CO2H)，175.8(CONH)，174.7(CONH)，173.3(CONH)，172.0(CONH)，171.2(CONH)，157.4(C Ar-对Tyr)，138.4(C Ar Phe)，136.0(2HC＝C(CH3))，135.8(HC＝C(CH3))，134.7(HC＝C(CH3))，132.0(HC＝C(CH3))，131.3(2CH Ar-邻Tyr)，130.4(2CH Ar-邻Phe)，129.4(2CH Ar-间Phe)，128.9(C Ar Tyr)，127.7(CH Ar-对Phe)，126.2(HC＝C(CH3))，125.6(HC＝C(CH3))，125.5(HC＝C(CH3))，125.5(2HC＝C(CH3))，116.3(2CH Ar-间Tyr)，56.9(CH Tyr)，55.9(CH Phe)，52.3(CH Leu)，43.9(CH2 Gly)，43.3(CH2 Gly)，41.7(CH2-CH(CH3)2Leu)，38.7(CH2Phe)，37.9(CH2 Tyr)，36.5(CH2-CH2-CO)，35.8(CH2-CH2-CO)，29.2(3CH2 SQ)，27.8(4CH2 SQ)，27.5(2CH2 SQ)，25.9(CH(CH3)2Leu，CH3 SQ)，23.4(CH3 Leu)，21.9(CH3 Leu)，17.7(CH3 SQ)，16.2(2CH3 SQ)，16.1(CH3 SQ)，16.0(CH3 SQ).HRMS(-ESI)：m/z 936.5826([M-H]-计算值C55H78N5O8：936.5845).

A.

使用纳米沉淀方法制备LENK-SQ NP。简单来说，将LENK-SQ生物缀合物(即LENK-SQ-Diox、LENK-SQ-Dig或LENK-SQ-Am)溶解在EtOH(8mg/mL)中，并在搅拌(500rpm)下将其逐滴加入到5％的右旋糖水溶液(体积比EtOH∶右旋糖溶液＝1∶4)中。溶液变得自发浑浊，其具有廷德尔效应，这表明形成了纳米颗粒。然后使用

B.

1.

主要通过DLS(Nano ZS，Malvern；散射角为173°，在25℃下)评估平均粒径、多分散性指数(PDI)和ζ电势。在水(DLS)或在0.1mM KCl(ζ电势)中适当稀释纳米颗粒后，进行三次测量。

2.

通过Cryo-TEM研究LENK-SQ NP的形态。使用在实验室设计和设置的可以控制湿度和温度的室来使NP玻璃化。使4μL LENK-SQ NP溶液(在Milli-Q水中为4mg/mL)沉积到安装在200目电子显微镜网格上的多孔碳膜上。自制碳膜的孔径约为2mm。用吸水滤纸除去大部分水滴，并通过将孔内剩余的残留薄膜投入用液态N

3.

结果示于图1。

从LENK-SQ乙醇溶液中进行纳米沉淀后，所有生物缀合物显示了在水溶液中作为NP自组装的能力。

当通过DLS测量时，NP的尺寸为60nm至120nm，这取决于角鲨烯和吗啡之间的连接(见图1)。NP的ζ电势的差异与NP表面暴露的氨基酸的性质有关。实际上，对于LENK-SQ-Diox生物缀合物，C-末端LENK肽上的角鲨烯的缀合使其N-末端位点游离(伯氨基)，这导致了净正电荷。相反，当在N-末端LENK肽(LENK-SQ-Dig和LENK-SQ-Am)上进行与SQ的缀合时，ζ电势变为负。载药量(见图1)为53％至60％，比在常规纳米颗粒或脂质体中(总计最高为5％)(23)要高得多。

所有生物缀合物表现出球形和单分散结构，其中尺寸为50nm至100nm。DLS和Cryo-TEM尺寸测量之间的微小差异可以归因于已知的与水力半径相关的差异。

A.

在加入300μL LENK-SQ-Dig NP或LENK-SQ-Am NP(2mg/mL)之前，快速解冻雄性SWISS小鼠的冷冻血清(900μL)并且在37℃下预孵育30分钟。对于LENK-SQ-Diox NP，将稀释的血清(在5％的右旋糖溶液中为30％)用于释放研究。在不同的时间间隔下，取等分试样(80μL)并将其加入到320μL ACN中，以使血清中的酶和蛋白质变性并沉淀，以便在离心(3000rcf保持15分钟)后将其除去。为了定量残留的LENK-SQ生物缀合物和释放的LENK，在40℃氮气流下将所得上清液(150μL)蒸发至干燥，然后将其溶于150μL Milli-Q水中。使用RP-HPLC在Uptisphere Strategy C18HQ色谱柱(4.6x100mm，5μm，Interchim)、1525二元LC泵(Waters，2707自动取样器(Waters)和2998PDA检测器(Waters)来定量游离肽。使用由milli-Q水(A相)中5mM乙酸铵和ACN(B相)中5mM乙酸铵组成的流动相进行梯度洗脱来进行HPLC。用B的10％至100％的线性梯度以1mL/分钟的流动速率进行13分钟的洗脱，然后将系统保持在100％的B中，等度流动10分钟。将温度设为35℃并在257nm处监测UV检测。

B.

结果示于图2。

在血清中孵育LENK-SQ-Diox导致生物缀合物减少，这与肽的释放密切相关(见图2A)。直至7h，生物缀合物的浓度逐渐降低，而LENK-SQ-Diox NP逐渐释放游离LENK肽。然后通过血清的肽酶使肽缓慢降解，但在孵育后仍持续10小时以上(见图2A)。在血清中孵育LENK-SQ-Dig导致生物缀合物减少，直至在2h时完全消失，但未检测到游离肽的存在。然而，RP-HPLC分析强调了仍与其接头连接的肽的缓慢释放。这种释放在45分钟时达到最大，然后肽-接头片段逐步降解，其在10小时内仍可检测到(见图2B)。相反，LENK-SQ-Am在血清中保持稳定，在48h内没有显著减少，并且在实验过程中没有释放肽(见图2C)。

A.

1.

成年雄性Sprague-Dawley大鼠(送达时为200-220g，实验时为280-300g)和成年雄性Swiss小鼠(送达时为18-20g，实验时为22-25g)分别购自Janvier实验室(法国)，分别用于痛觉测试和生物分布。将它们安置在一个标准的受控环境中(22±1℃，60％相对湿度，12:12h光暗循环，上午8:00开灯)，随意提供食物和水，在用于实验之前至少1周不进行任何处理。

2.

在注射前将λ卡拉胶溶于生理盐水(NaCl，0.9％)中。大鼠或小鼠在右后足足底区(25，39)接受λ卡拉胶溶液的单次足底注射，以诱导炎症。对于大鼠，注射的卡拉胶剂量为100μL(2％溶液w/v)，对于小鼠注射的卡拉胶剂量为20μL(3％溶液w/v)。λ卡拉胶注射3h后炎症达到最大。然后对同侧发炎的后足进行热疼痛性测试。

3.

a.

使用Hargreaves测试评估对热疼痛性刺激的超敏性。将大鼠单独置于3mm厚的透明玻璃板上开放的Plexiglas圆柱容器(直径为20cm，高为35cm)中，并在测试前使其适应至少20分钟。将移动的辐射热源(Model 7370，Ugo Basile足底测试，意大利)置于右后足足底表面正下方的玻璃板下，并且自动测量从开启辐射热到足缩回时所经过的时间(以秒为单位)。设定了20s的截止时间以防止组织受损。将每次实验重复三次，每隔5分钟测量基础阈值，并且在λ卡拉胶注射后3h的NP治疗后，间隔2分钟，重复2次。计算足缩回反应潜伏期(PWL)的平均值并表达为平均值±SEM(均值的标准误差)。

b.

在λ卡拉胶注射前一天获得对热刺激的基础反应。在先前研究的基础上，卡拉胶注射后3h进行急性药理治疗，这对应于峰值炎性反应。

在施用药物或载体后，通过测量缩足反应潜伏期(PWL)，在定期的时间间隔使用Hargreaves测试，首次在第10分钟，然后在4h内每30分钟进行一次，从而评估这些治疗对热痛觉过敏的疗效。

c.

将吗啡和LENK溶于5％的右旋糖中，而Nal和Nal-M溶于生理盐水(NaCl，0.9％)中。在施用前制备所有这些药物和NP混悬剂。根据图3在足底注射λ卡拉胶后3h进行所有急性治疗。皮下(s.c.)注射Nal和Nal-M，而在尾静脉处的静脉(i.v.)途径用于LENK-SQ NP、LENK及其对照。在激动剂(吗啡或测试的NP)之前15分钟施用拮抗剂(Nal或Nal-M)。基于文献数据(40)施用单次剂量的吗啡(1mg/kg)、Nal(0.5mg/kg)和Nal-M(0.5mg/kg)。基于可注射的LENK-SQ NP的最大体积，使用单次i.v.剂量的LENK-SQ NP(20mg/kg，相当于11.48mg/kg的LENK)或对照非缀合的SQ NP(8.28mg/kg)。

结果示于图4。

B.

λ卡拉胶足底注射到右后足诱导了局部炎症反应，其特征为限于注射的右后足的显著水肿、高热和痛觉过敏。所有大鼠都发生了热超敏反应，与天然大鼠的基础PWL相比，PWL平均下降了52.48％(P<0.001；见图4)。

C.

利用1mg/kg吗啡的急性治疗减轻了热痛觉过敏(见图4)，显示为所得的PWL的显著降低。实际上，吗啡注射后10分钟，PWL达到12.87±1.38s，而在用对照右旋糖溶液治疗其保持在3.05±0.20s。然而，吗啡抗痛觉过敏药理活性快速消失，并且在施用吗啡后100分钟便不再观察到显著效果(图4A)。

D.

具有3种不同接头的LENK-SQ NP的抗痛觉过敏效果在施用它们后4h内进行评估(图4C-H)。与注射游离LENK肽或空白SQ NP的经λ卡拉胶治疗的大鼠相比，注射LENK-SQ NP的所有大鼠都表现出热痛觉过敏的显著减少，表现为相应AUC值的显著增加(图4D、图F、图H)。特别是，在注射了LENK-SQ Diox NP或LENK-SQ Am NP的大鼠中，10分钟至130分钟的所有时间点的抗痛觉过敏活性都很显著(图4C、图G)。如图4E所示，LENK-SQ-dig NP还表现出显著的抗痛觉过敏效果，其中在注射后10分钟至130分钟保持PWL的最大增加，并在220分钟逐渐下降至基线。

有趣的是，在经λ卡拉胶治疗的大鼠中施用LENK-SQ NP后达到的最大PWL值对应于λ卡拉胶治疗前在对照的天然大鼠中测量的基础PWL值(图4C、图E、图G)，这表明了这些纳米颗粒的纯抗痛觉过敏效果。相反，在经λ卡拉胶治疗的大鼠中注射吗啡导致PWL值是在对照自然大鼠中发现的值的两倍高(图4A)，如预期的不仅有抗痛觉过敏效果，还有阿片激动剂充分确立的镇痛效应。

另外，空白SQ NP(没有LENK)不显示任何抗痛觉过敏活性(图4)，这表明对施用LENK-SQ NP的镇痛反应是由LENK肽的释放造成的。

E.

为了确定中枢或外周阿片受体在LENK-SQ NP抗痛觉过敏作用过程中的参与情况，在注射吗啡或NP前15分钟，皮下注射纳洛酮(Nal，脑通透性阿片受体拮抗剂)或纳洛酮甲硫氨酸(Nal-M，脑不通透性阿片受体拮抗剂)(26)(图3)。

F.

与吗啡组相比，预施用非选择性阿片受体拮抗剂Nal(0.5mg/kg s.c.)消除了吗啡抗痛觉过敏作用的幅度和持续时间(第10分钟时，PWL 3.20±0.59s相对12.87±1.38s)，并且相应的AUC值降低了81％(图4B)。外周阿片受体拮抗剂，即Nal-M的效果明显较差，因为它仅将吗啡的效果降低了13％(图4A和图4B)。

G.

预施用Nal或其季衍生物Nal-M消除了三种LENK-SQ NP的抗痛觉过敏效果(图4C-H)。实际上，与单独注射LENK-SQ-Diox、LENK-SQ-Dig和LENK-SQ-Am NP的大鼠相比，Nal预处理导致AUC值分别降低66％、105％或73％。Nal-M的AUC值相应的降低分别达到81％、99％和96％，表明了选择性阻滞外周阿片受体仅足以消除LENK-SQ NP的抗痛觉过敏效果。

A.

在带有λ卡拉胶诱导的炎症的剃毛小鼠中i.v.注射荧光LENK-SQ-Am NP(250μL，2mg/mL，含4％DiD)或对照荧光DiD溶液(250μL，80μg/mL，在5％的右旋糖溶液中)后，进行了体内成像生物分布研究。与此同时，对照的未发炎的剃毛小鼠(右后足注射20μL生理盐水，代替λ卡拉胶)也接受了荧光LENK-SQ NP的注射。分别在640nm处激发和在695nm至775nm滤光片中发射后的0.5h、2h、4h、6h和24h使用IVIS Lumina LT III系列系统(Caliper，Lifescience)记录NP的生物分布。在成像过程中，在氧气流(1升/分钟)中的2％异氟醚气体的麻醉下，将小鼠保持在成像状态，并在腹侧位置成像。取得荧光信号的图像和测量值，并使用Living

在单独的实验中，在通过经心灌注40ml盐水(8毫升/分钟)进行安乐死之前，用氯胺酮(100mg/kg，i.p.)和甲苯噻嗪(10mg/kg，i.p.)对注射荧光LENK-SQ NP的小鼠进行深度麻醉，直到流出右心房的液体完全透明。然后，切除肝、脾、肾、心脏、肺、脑和发炎的右后足并立刻用成像器成像。使用Living Image软件对ROI(阈值为20％)内发出的荧光进行定量。

B.

在小鼠λ卡拉胶诱导的足肿胀模型(右后足)中静脉注射DiD-荧光标记的LENK-SQ-Am NP后，评估LENK-SQ-Am NP的体内生物分布。使用IVIS Lumina从腹侧无损监测组织中的荧光长达24小时(图5)。将向足中注入盐水的小鼠作为不发炎的对照。实时体内成像显示，与健康足相比，在iv注射荧光LENK-SQ-Am NP后，发炎足内的平均辐射效率增加了2倍至3倍(图5A、图D、图F)。在对照实验中，当向施用了λ卡拉胶的小鼠静脉注射单独的DiD溶液，在发炎足中没有观察到显著的荧光积累(图5C、图F)。在另一个对照试验中，向小鼠的后足局部注射盐水并用荧光LENK-SQ NP进行静脉注射处理。在这种条件下也没有在后足水平处观察到显著的荧光积累(图5B、图E)，这显示了在λ卡拉胶发炎足中的荧光积累不是因为局部后足注射本身。

最后，在单独的实验中，在静脉注射荧光NP或DiD溶液后4h，使动物安乐死并经心灌注40mL生理盐水以除去来自血液的荧光。在取得组织后，在发炎的足中再次观察到强的体外荧光信号，但也在肝、脾和肺中观察到，而在动物的脑中没有可检测到的荧光积累(图6)。