一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法

技术领域

本发明涉及一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，具体为一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，属于细胞研究技术领域。

背景技术

血液系统恶性肿瘤的发病率逐年升高，其死亡率在国内外肿瘤排名中处于前十位，传统疗法(如放疗、化疗、手术、造血干细胞移植等)能使部分患者生存获益，但复发、难治、耐药等现象仍是目前面临的巨大挑战。近年来，随着分子生物学、免疫学等先进技术的发展，细胞免疫治疗已成为包括恶性血液病在内的多种肿瘤治疗的重要手段，被 Science杂志列为 2013 年十大科学突破之首。脐血又称胎盘血或脐带血。脐血来源丰富、采集简单，具有配型要求低、免疫排斥发病率低、移植费用低和移植成功率高等优点，已被广泛地应用于白血病及非恶性血液病、先天性免疫缺陷等多种疾病治疗，因此脐血已成为继骨髓和外周血后的第三大造血干细胞的来源。随着脐血来源造血干细胞的应用，其产生的储存问题已经成为热点。因此，评价不同冻存液冻存脐血来源单个核细胞的效果，对建立安全稳定的脐血库至关重要，是当前刻不容缓的问题。

CIK细胞具有强大的杀瘤活性，具有TIL、LAK细胞所无法比拟的优势，但诱导CIK细胞需要发费很长的时间，在临床应用上需要多次诱导和采血，给患者造成了极大的痛苦和不必要的麻烦。也有人提出将对数期生长的CIK细胞像其他传代细胞一样低温保存，需要时再复苏，但是现有的技术使得复苏的细胞活性偏低，达不到我们高效增殖的目的。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决问题而提供一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：

步骤一、免疫细胞CIK的分离包括以下过程：

（1）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；

（2）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；

（3）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。

步骤二、细胞CIK的无血清体外扩增包括以下步骤：

（1）、免疫细胞的起始培养；

离心收集全部细胞，用30ml CIK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlCIK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlCIK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加CIK细胞培养液15ml离心管并转入培养瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培养箱中培养。

（2）免疫细胞的无血清培养；

细胞培养至第3天离心、换液、换瓶：收集细胞离心，1500转，5分钟。离心后的细胞沉淀加含5%自体血浆的CIK细胞培养液30ml重悬，第4-6天，根据实际生长情况，进行添液，转移培养袋：第7天计数，细胞数量大于1*108，则加入4ml扩增试剂，如细胞数量在3~8*107则长至第8天再添加扩增试剂。加含5%自体血浆的CIK细胞培养液使总细胞浓度在1.0*106Cell/m。培养液体积大于200ml或细胞数量大于1*108，则可以转移至培养袋培养；第8~11天每天观察，加含1%自体血浆的CIK细胞培养液使得细胞浓度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天观察，添液使得细胞浓度在2*106Cell/ml左右。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，建议13或14天收集细胞。

步骤三、分析细胞CIK的生长曲线。

步骤四、分析细胞CIK表面抗原表达。

步骤五、分析细胞CIK周期。

步骤六、免疫细胞CIK的冻存及复苏，实验组设置有四组免疫细胞CIK的冻存实验和一组对照组，且五组实验分别冻存10天和30天。

步骤七、免疫细胞各项指标检测。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面，设定离心参数升6降4，1600rpm，离心20min，吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层吸至洁净50ml离心管中，各管中加NA，稀释混匀，定容至50ml/管，设定离心参数升9降7，2000rpm，离心8min，吸弃上清，加10ml NA/管，重悬细胞。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，采用台盼蓝染色法检测细胞活性，并绘制出相应的细胞生长曲线。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，采用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD56、CD8抗原。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，采用流式细胞仪检测细胞周期。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，四组实验组和一组对照组分别是：

（1）、细胞冻存液 1：A 液：20%的20%人血白蛋白，10%的15%右旋糖酐/ 5%葡萄糖注射液；B液：31.25%勃脉力 A（复方电解质注射液），31.25%的5%葡萄糖/ 0.45%氯化钠注射液，7.5%DMSO，配置完毕后分装至 15ml离心管，放置-20℃待用；

（2）、细胞冻存液 2：采用脐带组织冻存的B液，购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；

（3）、友康冻存液：购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；

（4）、亘诺冻存液：购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；

（5）、对照组：新鲜细胞。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤七中，可以通过核细胞计数、活细胞检测、集落培养、免疫细胞检测等对CIK免疫细胞进行各项指标检测。

本发明的有益效果是：该免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法设计合理，应用无血清培养基悬浮培养体系，分离获得的免疫细胞CIK具有较强的增殖能力，利用细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，细胞活性在四种细胞冻存液中的细胞活性最高，在90%以上，流式细胞仪检测结果表明，冻存前的细胞与冻存复苏后的细胞的免疫表型无明显差异，均具有免疫细胞的免疫表型，流式细胞术检测细胞凋亡实验表明，细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，晚期凋亡的细胞数最少，且未发生凋亡的细胞数最多。

附图说明

图1为本发明流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：

步骤一、免疫细胞CIK的分离包括以下过程：

（4）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；

（5）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；

（6）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。

步骤二、细胞CIK的无血清体外扩增包括以下步骤：

（2）、免疫细胞的起始培养；

离心收集全部细胞，用30ml CIK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlCIK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlCIK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加CIK细胞培养液15ml离心管并转入培养瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培养箱中培养。

（2）免疫细胞的无血清培养；

细胞培养至第3天离心、换液、换瓶：收集细胞离心，1500转，5分钟。离心后的细胞沉淀加含5%自体血浆的CIK细胞培养液30ml重悬，第4-6天，根据实际生长情况，进行添液，转移培养袋：第7天计数，细胞数量大于1*108，则加入4ml扩增试剂，如细胞数量在3~8*107则长至第8天再添加扩增试剂。加含5%自体血浆的CIK细胞培养液使总细胞浓度在1.0*106Cell/m。培养液体积大于200ml或细胞数量大于1*108，则可以转移至培养袋培养；第8~11天每天观察，加含1%自体血浆的CIK细胞培养液使得细胞浓度在1*106Cell/ml左右；第12~14天每天观察，添液使得细胞浓度在2*106Cell/ml左右。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下，建议13或14天收集细胞。

步骤三、分析细胞CIK的生长曲线。

步骤四、分析细胞CIK表面抗原表达。

步骤五、分析细胞CIK周期。

步骤六、免疫细胞CIK的冻存及复苏，实验组设置有四组免疫细胞CIK的冻存实验和一组对照组，且五组实验分别冻存10天和30天。

步骤七、免疫细胞各项指标检测。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面，设定离心参数升6降4，1600rpm，离心20min，吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层吸至洁净50ml离心管中，各管中加NA，稀释混匀，定容至50ml/管，设定离心参数升9降7，2000rpm，离心8min，吸弃上清，加10ml NA/管，重悬细胞。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，采用台盼蓝染色法检测细胞活性，并绘制出相应的细胞生长曲线。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，采用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD56、CD8抗原。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，采用流式细胞仪检测细胞周期。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，四组实验组和一组对照组分别是：

（1）、细胞冻存液 1：A 液：20%的20%人血白蛋白，10%的15%右旋糖酐/ 5%葡萄糖注射液；B液：31.25%勃脉力 A（复方电解质注射液），31.25%的5%葡萄糖/ 0.45%氯化钠注射液，7.5%DMSO，配置完毕后分装至 15ml离心管，放置-20℃待用；

（2）、细胞冻存液 2：采用脐带组织冻存的B液，购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；

（3）、友康冻存液：购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；

（4）、亘诺冻存液：购置后分装至15ml离心管，放置-20℃待用；

（5）、对照组：新鲜细胞。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤七中，可以通过核细胞计数、活细胞检测、集落培养、免疫细胞检测等对CIK免疫细胞进行各项指标检测。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。