犬纤维蛋白原的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及犬血液制品领域，特别涉及一种犬纤维蛋白原的制备方法。

背景技术

纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)是血浆中的蛋白成分，含量高达2～4g/L, 在犬凝血系统中发挥着关键作用，凝血的最后阶段是Fg在凝血酶的作用下转变为纤维蛋白，纤维蛋白和其他血细胞成分聚集成不溶性团状物达到止血的目的。Fg除直接参与凝血过程外，还在血小板聚集，血液粘度方面起着重要作用，是心、脑血管病发病的重要原因。Fg缺乏常见的相关疾病包括:先天性纤维蛋白原减少或缺乏症，由于肝损伤严重、肝硬化、弥散性血管内凝血、外伤、产后大出血、大手术、内出血等导致的获得性纤维蛋白原缺少症。由于先天因素引起的减少或缺乏症，补充Fg是目前唯一可靠的治疗方法，而对于后天不同因素引起的减少或缺乏症，根据病因的不同，也需要输注不同剂量的Fg制剂。

目前，提取纤原的原料主要包括低温乙醇工艺产生的组分工(FI)沉淀和血浆冷沉淀两种。国内外大多数血液制品厂家基本以FI沉淀作为提取纤原的原料。F1沉淀主要含纤维蛋白原、FⅧ、纤维结合蛋白Fn等成分。冷沉淀是新鲜冰冻血浆(Fresh frozen plasma，FFP)在低温解冻后产生的白色絮状沉淀，其中含丰富的FⅧ，von Willehrand因子、纤维蛋白原、纤维结合蛋白及XIII因子。同时冷沉淀也是制备FⅧ的主要起始原料，目前，已有报道从冷沉淀同时提取FⅧ和纤维蛋白原的工艺。

在人医领域，纤维蛋白原及其复合制剂已经被广泛使用，但目前还没有一款纤维蛋白原制剂应用于宠物领域，我公司生产的犬纤维蛋白原，是以低温乙醇F1沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心等制造工艺，并采用国际上先进的离子交换层析技术进行提纯，使得产品的纯度得到了很大的提高，为宠物疾病如：1.先天性纤维蛋白原减少或缺乏症。2.获得性纤维蛋白原减少症:严重肝脏损伤；肝硬化；弥散性血管内凝血；产后大出血和因大手术﹑外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍等提供了有效的诊疗手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产过程中溶解速度快，生产周期短，使用时复溶快，生物学活性好，且收率高的纤维蛋白原的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种纤维蛋白原的制备方法，依次包括以下几个步骤：

一种犬纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤为：

(1)将检验合格的犬血浆融化，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到-4～0℃，将其pH值调节到6.4～7.4，加入预冷乙醇至终浓度8％～10％ (g/100ml)，保持在-4～0℃，13000-18000rpm离心保留沉淀；

(2)上述沉淀加入8～10倍量的溶解液溶解，用连续离心机(保持在 -4～0℃，13000-18000rpm)离心取上清；

(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；

(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的犬纤维蛋白原洗涤出来一并收集；

(5)在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸/氯化钠，终浓度甘氨酸为 0.9～1.5mol/L；氯化钠为1.5～2.5mol/L。待甘氨酸/氯化钠充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以2000～5000rmp的速度进行连续离心分离；

(6)用溶解液溶解步骤(5)所得的沉淀，搅拌2～6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6.4～7.4；

(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；

(8)向步骤(7)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。

(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。

本发明所述的犬纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)中在 0～4℃的条件下进行离心。

本发明所述的犬纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)中用 0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液将溶解液的PH值调节为6.4～7.4。

本发明所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述冷乙醇的浓度为50％～95％v/v。

本发明所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂为甘露醇和右旋糖苷-40葡萄糖注射液按照特定的用量配比组成，其中，甘露醇的浓度为4％～15％w/v，右旋糖苷-40葡萄糖注射液的浓度3％～ 8％w/v。本发明所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的溶解液缓冲液含有1.5～2.0g/L柠檬酸钠、6.0～8.0g/L氯化钠和8.0～10.0g/L甘氨酸。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

本发明的优点：

1、本发明的犬纤维蛋白原的生产方法，采用了从组份I提取、分离犬纤维蛋白原的方法，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；提取出的产品纯度高达90％以上，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。

2、本发明的犬纤维蛋白原，生产过程中采用甘露醇和右旋糖苷-40葡萄糖注射液作为稳定剂，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，保证了犬纤维蛋白原的稳定性。

3、在本发明的工艺过程中，纤维蛋白原的工艺复溶时间由一般工艺的 2小时(37℃左右水浴)，缩短为10分钟左右(37℃左右水浴)。工艺复溶时间的缩短，降低了工艺制备过程中细菌繁殖的可能性，从而降低了产品中的热原，并且为临床上宠物生命的抢救赢得了宝贵的时间；

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1犬纤维蛋白原制剂的制备

1、制备方法

(1)将检验合格的犬血浆100L溶解，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到0℃，将其pH值调节到6.4，加入预冷乙醇至终浓度10％(g/100ml)，离心保留沉淀；

(2)上述沉淀加入8倍量的溶解液溶解，用连续离心机离心取上清；

(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6小时；

(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的犬纤维蛋白原洗涤出来一并收集；

(5)在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸/氯化钠，终浓度甘氨酸为 0.9mol/L；氯化钠为1.5mol/L。待甘氨酸/氯化钠充分溶解完全后，将溶液冷却至0℃，用离心机对其以2000rmp的速度进行连续离心分离；

(6)用溶解液溶解步骤(5)所得的沉淀，搅拌2小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6.4；

(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；

(8)向步骤(7)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。

(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。

按照《中国药典》规定的方法测定所制备的犬纤维蛋白原的蛋白质浓度、纯度和凝固活力等。

实施例2犬纤维蛋白原制剂的制备

1、制备方法

(1)将检验合格的犬血浆100L溶解，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到-2℃，将其pH值调节到7.0，加入预冷乙醇至终浓度9％(g/100ml)，离心保留沉淀；

(2)上述沉淀加入9倍量的溶解液溶解，用连续离心机离心取上清；

(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以80rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温7小时；

(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的犬纤维蛋白原洗涤出来一并收集；

(5)在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸/氯化钠，终浓度甘氨酸为 1.2mol/L；氯化钠为2.0mol/L。待甘氨酸/氯化钠充分溶解完全后，将溶液冷却至5℃，用离心机对其以3000rmp的速度进行连续离心分离；

(6)用溶解液溶解步骤(5)所得的沉淀，搅拌4小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到7.0；

(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；

(8)向步骤(7)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。

(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。

按照《中国药典》规定的方法测定所制备的犬纤维蛋白原的蛋白质浓度、纯度和凝固活力等。

实施例3犬纤维蛋白原制剂的制备

1、制备方法

(1)将检验合格的犬血浆溶解，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到-4℃，将其pH值调节到7.4，加入预冷乙醇至终浓度8％(g/100ml)，离心保留沉淀；

(2)上述沉淀加入10倍量的溶解液溶解，用连续离心机离心取上清；

(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温8小时；

(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的犬纤维蛋白原洗涤出来一并收集；

(5)在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸/氯化钠，终浓度甘氨酸为 1.5mol/L；氯化钠为2.5mol/L。待甘氨酸/氯化钠充分溶解完全后，将溶液冷却至10℃，用离心机对其以5000rmp的速度进行连续离心分离；

(6)用溶解液溶解步骤(5)所得的沉淀，搅拌6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到7.4；

(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；

(8)向步骤(7)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。

(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。

按照《中国药典》规定的方法测定所制备的犬纤维蛋白原的蛋白质浓度、纯度和凝固活力等。

本发明制备工艺与《中国药典》纤维蛋白原产品质量标准比较结果见表 1。

表1

其中，所采用的具体检测方法和标准为：

【性状】应为灰白色或淡黄色疏松体。复溶后应为澄明溶液，可带轻微乳光。

【pH值】用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质含量稀释成10g/L，应为6.5～7.5。

【真空度】用高频火花真空测定器检测，瓶内应出现蓝紫色辉光。

【复溶时间】将供试品平衡至30～37℃，加人30～37℃灭菌注射用水5ml，轻轻摇动，应于30分钟内完全溶解。

【纯度】用生理氯化钠溶液将供试品稀释至每lml含纤维蛋白原2～ 3mg，测定蛋白质含量(P，g/L)(凯氏定氮法)。

另取上述供试品溶液10ml，加入等量含3lU/ml的凝血酶溶液(含 0.05mmol/L氯化钙)，于37℃放置20分钟，以每分钟2500转离心或过滤分离沉淀，用生理氯化钠溶液洗3次后，测定可凝固蛋白质含量(F， g/L)(凯氏定氮法)，按下式计算供试品的纯度，应不低于70.0％。

纤维蛋白原纯度(％)＝(F/P)×100％

【纤维蛋白原总量】根据测得的可凝固蛋白质含量及标示装量，计算每瓶纤维蛋白原总量，应不低于0.1g。

【凝固活力】于反应管内加人巳预热至37℃的凝血酶溶液(3IU/ml) 0.5ml,再加入用生理氯化钠溶液稀释成3mg/ml的供试品溶液0.5ml，摇匀。置37℃记录凝固时间。两次测定结果平均值应不超过60秒。

【外源病毒检验】按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。

【无菌检验】按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

【安全检验】用16～22周龄健康比格犬2只(体重5kg左右)，每只按照40mg/kg用量于前肢静脉注射已恢复至室温的犬纤维蛋白原，注射后连续观察14日，并每日测量犬直肠温度一次。在观察期内，每只试验犬体温升高值应不超过0.8℃，如超过0.8℃且持续时间应不超过两个温次，试验犬均应健活，可判为符合规定。

【鉴别检验】

试剂

兔抗犬血浆血清，兔抗马血浆血清，兔抗牛血浆血清，兔抗猪血浆血清，琼脂，氨基黑，甲醇，冰醋酸，脱色液等。

操作步骤

准备

1％琼脂糖凝胶板：称取1.0g琼脂糖，加入99ml生理盐水溶液中，置沸水中水浴加热至琼脂糖充分溶胀，倾倒于平放的平皿中，厚度约4～5mm，凝固后用打孔器打孔，孔直径3mm，孔距3mm。

0.5％氨基黑染色液：称取氨基黑10B 0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸 10ml及水40ml的混合液中。

脱色液：量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。

加样

将1支犬纤维蛋白原用5ml注射用水溶解，取一块打好孔的琼脂糖凝胶板，中央孔加入兔抗犬血浆血清，周围孔分别加入阳性对照(犬血浆)、阴性对照(生理盐水)、不同稀释度(1:4和1:8)的犬纤维蛋白原，5μl/ 孔。

兔抗马血浆血清、兔抗猪血浆血清和兔抗牛血浆血清加样方法同上。

孵育

将加样后的琼脂糖凝胶板置于水平湿盒中，在37℃水平放置24小时。

染色

用生理盐水溶液充分浸泡琼脂糖凝胶，以除去未结合的蛋白。将浸泡好的琼脂糖凝胶放入0.5％氨基黑染色液中染色5～30秒。

脱色

把染色好的琼脂糖凝胶板放入脱色液中，直到凝胶板脱色至背景无色，沉淀线呈清晰的蓝色为止。

结果判定

兔抗犬血浆血清，兔抗马血浆血清，兔抗牛血浆血清和兔抗猪血浆血清分别与各自阳性对照血浆之间应出现相应的沉淀线，与阴性对照之间不出现沉淀线，则试验成立。

供试品与兔抗犬血浆血清之间应出现相应沉淀线，与兔抗马血浆血清、兔抗猪血浆血清和兔抗牛血浆血清之间均不产生沉淀线。

【热原检查】

实验动物

选用同一来源、同一品系家兔，体重1.7～3.0kg，体温均在38.0～39.6℃的范围内，且最高与最低体温相差不超过0.4℃的健康适用家兔3只。

检查方法

测定其正常体温后15分钟内，将犬纤维蛋白原按40mg/kg的剂量温热至约38℃后自耳静脉缓慢注入，然后每隔30分钟测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或高于0.6℃，或3只家兔体温升高的总和达1.3℃或高于1.3℃，应另取5只家兔复试，检查方法同上。

结果判定

在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只，并且初试、复试的8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于 3.5℃，均判定热原检查合格。

在初试的3只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃以上的家兔超过1只；或在初试、复试的8只家兔的体温升高总和超过3.5℃，均判定热原检查不合格。

从表中1可以看出，用本发明方法制备的犬纤维蛋白原的质量和收率优于《中国药典》所规定的纤维蛋白原质量标准，并且纤维蛋白原纯度达到90％以上，复溶时间缩短到10分钟左右。

实施例4对照试验

利用人医领域常见纤维蛋白原的制备方法制备犬纤维蛋白原，具体方法参见CN101703763中的记载，具体为：

1、血浆收集：将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的冰冻原料血浆100L，在室温下自然融化，用75％的酒精进行消毒血浆袋表面，再用20℃的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用25℃的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在0℃，注入离心机以22000rmp的速度进行连续离心分离，获得沉淀。

2、冷沉淀溶解、离心：

将保管于-30℃以下冷库内的冷沉淀拿出，尽可能破碎成小块，加入 16L注射用水，搅拌300分钟使冷沉淀完全溶解。调节溶解液的温度到20℃，使用0.1M醋酸溶液将其pH值调节到6.4，然后以22000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤，得滤液17L。

3、病毒灭活：

在收集的离心上清液中添加氯化钙溶液170ml，使得溶液中氯化钙浓度达到1mmol/L，将收集罐中产品的温度调节为30℃，然后添加吐温 -80178.5g和TNBP53.7ml，使溶液中二者的最终浓度分别达到1％和0.3％。在专用的病毒灭活罐内，以40rmp低速搅拌，在24℃条件下加热7小时，灭活产品中可能残存的或者生产中带入的脂包膜病毒。病毒灭活后的作业场所、空调及设备要与灭活前的完全分开。

4、层析精制：

用DEAE-650M凝胶层析柱吸附病毒灭活后的溶液，此时对通过层析柱的滤液进行收集。吸附结束后，用3倍凝胶体积量的枸橼酸盐缓冲液洗涤，收集到专用的收集罐。

5、沉淀离心分离：

在收集的滤液中添加甘氨酸，充分溶解完全后冷却至0℃，用离心机以22000rmp的速度进行连续离心分离，此时得到的即为纤维蛋白原沉淀。此步骤同时也去除了用于病毒灭活的吐温-80和TNBP。

6、配制：

用枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解二次沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到39mmol/L，蔗糖浓度为40g/L，搅拌2小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0％，并用0.5M盐酸溶液2.0ml将产品的pH值调节到 6.4。

7、除菌过滤：

用灭菌好的过滤器对配制的液体进行除菌过滤，过滤器的孔径为0.45 μm。过滤结束后检查除菌过滤器的完整性，不合格时要迅速再过滤一次，确保产品达到无菌要求。

8、分装、冻干：

在洁净度为100级的区域内按照标示的装量进行分装，冻干前先对冻干机急速冻结至-40℃以下，注意冻干工程中制品的温度不能超过35℃，冻干时间为4小时。冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡。

9、热处理：

冻干结束后的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理，灭活可能残存的或生产中带入的非脂包膜病毒，确保了制品的安全。

获得的产品性能为：获得的产品为黄色粉末状固体，将供试品平衡至 30～37℃，加人30～37℃灭菌注射用水5ml，轻轻摇动，有沉淀物始终悬浮，并没有实现完全的复溶。经检测其中的纤维蛋白原含量为11.5mg/ml，纯度仅为65％。经分析主要是因为：人血和犬血的主要成分和构成、血流变指标，以及人纤维蛋白原和犬纤维蛋白原的具体形状有差别，例如： PanJ.J.，ChenQ.S.，HuangW.，ChinaOncology，2011，21(9)，708 —712(潘建基，陈奇松，黄伟.中国癌症杂志，2011，21(9)，708—712)， WoodB.R.，CaspersP.，PuppelsG.J.，Anal.&Bioanal.Chem.， 2007，387(5)，1691—703；PremasiriW.R.，LeeJ.C.，ZieglerL.D.，J.Phys.Chem.B，2012，116(31)，9376—86。因此不能简单的利用人血中纤维蛋白原的技术方案应用在犬血纤维蛋白原的处理过程中，必须对其中的步骤和具体参数利用创造性的劳动才能实现。

但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。