一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于电生理记录技术领域，具体涉及一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法及其应用，以及所涉及的中老年小鼠脑切片用人工脑脊液ACSF。

背景技术

离体脑切片是指用小鼠脑组织制备的厚度为100～500微米的活组织切片。离体脑切片不仅一定程度上具有在体脑的特性，而且与在体脑相比，还排除了血脑屏障的阻隔以及由于心脏搏动、呼吸运动等导致的机械稳定性欠佳等问题。重要的是，离体脑切片的外环境容易控制，非常适合于生理学和药理学研究。在基础和临床的神经领域研究中，离体脑切片的电生理记录是一种广泛使用的技术手段。然而，由于在电生理记录时需要保持离体脑切片具有较好的生理活性，一般只能选择耐缺氧能力以及可塑性较强的小于3周龄的幼年动物脑组织作为实验对象，这就对一些需要中老年动物脑组织作为实验对象的电生理研究，比如衰老或者阿兹海默症、帕金森综合征等神经退行性疾病的研究带来了极大的挑战。

大量的研究表明，长时程突触可塑性包括长时程突触增强(Long-termpotentiation,LTP)是学习和记忆的细胞突触机制。然而神经网络层面上突触可塑性的记录不同于一般电生理指标的记录，通常会在几分钟至多十几分钟内就能完成，一轮完整的LTP记录至少需要持续2小时以上的信号采集，在此过程中，需要始终保持记录用的离体脑切片具备良好的生理活性，更是加大了此类电生理记录的难度。因此，长期以来，提高并维持足够长时间的中老年动物离体脑切片的生理活性就成为电生理记录技术的一个瓶颈问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法，以克服现有技术条件下离体脑片电生理记录仅能选择幼年动物脑组织作为实验对象，导致在一定程度上制约了需要使用中老年动物脑切片作为实验对象的一些与衰老或者阿兹海默症、帕金森综合征等神经退行性疾病相关研究的开展。

本发明提供了一种中老年小鼠脑切片用人工脑脊液ACSF(ArtificialCerebralSpinal Fluid)，其包括两种，一是用于制取中老年小鼠脑切片时的人工脑脊液sACSF(sectionACSF)；和/或，另一是用于电生理记录时孵育中老年小鼠脑切片的人工脑脊液cACSF(cultureACSF)。

其中，所述sACSF包含N-甲基-D-葡萄糖胺(60～63mM)、氯化胆碱(29～32mM)、氯化钾(2.3～2.6mM)、碳酸氢钠(26～29mM)、磷酸二氢钠(1.0～1.3mM)、HEPES(18～21mM)、D-葡萄糖(23～26mM)、硫脲(1.8～2.1mM)、抗坏血酸钠(4.8～5.1mM)、丙酮酸钠(2.8～3.1mM)、硫酸镁(9.8～10.1mM)、氯化钙(0.48～0.51mM)、环磷腺苷钠(1.8～2.1mM)和N-乙酰半胱氨酸(10～13mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L；优选地，所述sACSF包含N-甲基-D-葡萄糖胺(62mM)、氯化胆碱(31mM)、氯化钾(2.5mM)、碳酸氢钠(28mM)、磷酸二氢钠(1.2mM)、HEPES(20mM)、D-葡萄糖(25mM)、硫脲(2mM)、抗坏血酸钠(5mM)、丙酮酸钠(3mM)、硫酸镁(10mM)、氯化钙(0.5mM)、环磷腺苷钠(2mM)和N-乙酰半胱氨酸(12mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L。

其中，所述cACSF包含氯化钠(91～94mM)、氯化钾(2.3～2.6mM)、碳酸氢钠(26～29mM)、磷酸二氢钠(1.0～1.3mM)、HEPES(18～21mM)、D-葡萄糖(23～26mM)、硫脲(1.8～2.1mM)、抗坏血酸钠(4.8～5.1mM)、丙酮酸钠(2.8～3.1mM)、硫酸镁(1.8～2.1mM)、氯化钙(2.3～2.6mM)和环磷腺苷钠(1.8～2.1mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L。优选地，所述cACSF包含氯化钠(93mM)、氯化钾(2.5mM)、碳酸氢钠(28mM)、磷酸二氢钠(1.2mM)、HEPES(20mM)、D-葡萄糖(25mM)、硫脲(2mM)、抗坏血酸钠(5mM)、丙酮酸钠(3mM)、硫酸镁(2mM)、氯化钙(2.5mM)和环磷腺苷钠(2mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L。

本发明还提供了一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法，其能够显著提高并维持长时间的中老年小鼠离体脑切片的生理活性，为后续突触传递和突触可塑性等电生理指标的记录提供高质量的中老年小鼠脑切片样本。

本发明还提供了一种电生理记录用中老年小鼠脑切片的制备方法，所述制备方法中使用所述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液ACSF；所述制备方法包括如下步骤：

步骤1)：将脑组织放入冷却至冰水混合物状态的氧饱和的切片用人工脑脊液所述sACSF中进行脑组织冷却和切片；

步骤2)：将步骤1)得到脑组织切片迅速转移至31℃氧饱和的孵育用人工脑脊液所述cACSF中复苏。

在一具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

1)小鼠麻醉断头取脑后迅速将脑组织放入冷却至冰水混合物状态的氧饱和切片用人工脑脊液(sACSF)中进行脑组织冷却和切片，其中sACSF包含N-甲基-D-葡萄糖胺(62mM)、氯化胆碱(31mM)、氯化钾(2.5mM)、碳酸氢钠(28mM)、磷酸二氢钠(1.2mM)、HEPES(20mM)、D-葡萄糖(25mM)、硫脲(2mM)、抗坏血酸钠(5mM)、丙酮酸钠(3mM)、硫酸镁(10mM)、氯化钙(0.5mM)、环磷腺苷钠(2mM)和N-乙酰半胱氨酸(12mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L；

2)切好的脑片迅速转移至31℃氧饱和的孵育用人工脑脊液(cACSF)中复苏1小时，其中cACSF包含氯化钠(93mM)、氯化钾(2.5mM)、碳酸氢钠(28mM)、磷酸二氢钠(1.2mM)、HEPES(20mM)、D-葡萄糖(25mM)、硫脲(2mM)、抗坏血酸钠(5mM)、丙酮酸钠(3mM)、硫酸镁(2mM)、氯化钙(2.5mM)和环磷腺苷钠(2mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L；

3)电生理记录时使用27±2℃氧饱和的cACSF持续灌流上述得到的中老年小鼠脑切片，灌流速度为2～3ml/min。

本发明还提供了以所述方法制备得到的中老年小鼠脑切片。其在膜片钳记录中具有较高的高阻封接能力(不小于1GΩ)；在场电位记录中具有较好的突触传递能力，如最大电刺激诱导的兴奋性突触后电流不小于0.4mV；和/或，在场电位记录中具有较好的突触可塑性，如长时程突触增强不小于120％。

本发明制备得到的中老年小鼠脑切片具有电生理活性高，活性持续时间长等特点，为后续突触传递和突触可塑性等电生理指标的记录提供了保证。

本发明还提供了上述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液sACSF和cACSF的制备方法，所述制备方法包括：

1)分别称量N-甲基-D-葡萄糖胺、氯化胆碱、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、HEPES、D-葡萄糖、硫脲、抗坏血酸钠、丙酮酸钠、环磷腺苷钠、N-乙酰半胱氨酸、硫酸镁和氯化钙，加水溶解，配置sACSF溶液，其中硫酸镁和氯化钙最后添加，并且一个溶解完全后再溶解另外一个；

2)分别称量氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、HEPES、D-葡萄糖、硫脲、抗坏血酸钠、丙酮酸钠、环磷腺苷钠、硫酸镁和氯化钙，加水溶解，配置cACSF溶液，其中硫酸镁和氯化钙最后添加，并且一个溶解完全后再溶解另外一个；

3)向步骤1)和2)得到的溶液中加入盐酸调节pH至7.3～7.4，得到所述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液sACSF和cACSF。

本发明还提供了所述制备方法、以及由上述制备方法制备得到的中老年小鼠脑切片、以及所述中老年小鼠脑切片用人工脑脊液ACSF在电生理记录中的用途，所述用途包括但不限于在电生理指标包括刺激强度-反应曲线(Input-OutputCurve)和突触可塑性记录中的用途。

与现有技术相比，本发明在切片制备过程中通过配合使用两种ACSF溶液，能够显著提升中老年小鼠脑切片的质量并记录出高质量的相关电生理指标，如从能够诱导出的最大fEPSP来看，传统方法制备的脑切片在小鼠成年之后诱导出的fEPSP幅度显著降低，但本发明提供的方法制备的脑切片在小鼠成年之后诱导出的fEPSP幅度始终保持较高的水平(见图2)。另外，在中老年小鼠中，使用传统方法制备的脑切片已经很难再诱导出LTP，而本发明提供的方法制备的脑切片仍然能够诱导出显著的LTP(图3)。这些数据说明本发明提供的方法制备的脑切片能够很好地保持局部环路的突触可塑性，这为衰老或者阿兹海默症、帕金森综合征等神经退行性疾病的电生理研究提供了高质量的样本保障。

附图说明

图1：本发明所制备的脑切片在膜片钳记录中具有较高的高阻封接率。分别通过膜片钳记录使用传统方法和本发明方法制备的2周龄、3月龄、9月龄和18月龄小鼠脑切片海马脑区的细胞，统计两种方法下细胞的高阻封接机率。细胞膜与电极尖端形成高阻封接需不小于1GΩ，每张脑切片记录不少于10个细胞。利用双因素方差分析Two-wayANOVA方法分析差异的显著性。所有数据均采用Mean±SD表示。p<0.05定义为差异显著，p<0.01为差异较显著p<0.001为差异极显著。

图2：本发明所制备的脑切片在场电位记录中具有较好的突触传递能力。A：海马脑区CA3-CA1通路电极位置示意图；B:通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的2周龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路Input-outputcurve；C：通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的3月龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路Input-outputcurve；D：通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的9月龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路Input-outputcurve；E：通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的18月龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路Input-outputcurve；F：比较传统方法和本发明方法制备的2周龄、3月龄、9月龄和18月龄小鼠脑切片海马脑区能够诱导出的最大fEPSP。利用双因素方差分析Two-wayANOVA方法分析差异的显著性。所有数据均采用Mean±SD表示。p<0.05定义为差异显著，p<0.01为差异较显著p<0.001为差异极显著。

图3：本发明所制备的脑切片在场电位记录中具有较好的突触可塑性。A：通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的2周龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路LTP；B:A中最后10min记录的fEPSP幅度的柱状统计图；C：通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的3月龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路LTP；D：C中最后10min记录的fEPSP幅度的柱状统计图；E：通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的9月龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路LTP；F：E中最后10min记录的fEPSP幅度的柱状统计图。G：通过场电位记录传统方法和本发明方法制备的18月龄小鼠海马脑区CA3-CA1通路LTP；H：G中最后10min记录的fEPSP幅度的柱状统计图。利用Students’t-test方法分析差异的显著性。所有数据均采用Mean±SD表示。p<0.05定义为差异显著，p<0.01为差异较显著p<0.001为差异极显著。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本发明所用试剂，均来自Sigma-Aldrich。

实施例1

使用本发明提供的中老年小鼠脑切片的制备方法与传统脑切片制备方法制备的不同年龄段小鼠海马脑区神经元的电生理活性对比。

(1)实验动物

本实验中所用的C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，在华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室SPF级模式动物中心饲养和繁殖。饲养过程中小鼠自由进食、饮水，自动光控于7:00亮灯、19:00熄灯，12/12h昼夜交替。室温22±2℃，相对湿度50％-60％。对实验小鼠的所有操作均严格遵守华东师范大学实验动物使用与管理委员会的相关规定。

(2)配制脑切片制备用ACSF

①传统脑切片制备方法中使用的切片液和孵育液都是模拟小鼠脑脊液制备的人工脑脊液，其组成成分为：氯化钠119mM，氯化钾2.5mM，磷酸氢二钠1.25mM，碳酸氢钠24mM，D-葡萄糖12.5mM，硫酸镁2mM，氯化钙2mM。pH值7.3～7.4，渗透压300～310mOsm/L。

②本发明提供的中老年小鼠脑切片制备中使用的切片液和孵育液分别是sACSF和cACSF。其中sACSF组成成分为：N-甲基-D-葡萄糖胺(62mM)、氯化胆碱(31mM)、氯化钾(2.5mM)、碳酸氢钠(28mM)、磷酸二氢钠(1.2mM)、HEPES(20mM)、D-葡萄糖(25mM)、硫脲(2mM)、抗坏血酸钠(5mM)、丙酮酸钠(3mM)、硫酸镁(10mM)、氯化钙(0.5mM)、环磷腺苷钠(2mM)和N-乙酰半胱氨酸(12mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L；cACSF组成成分为：氯化钠(93mM)、氯化钾(2.5mM)、碳酸氢钠(28mM)、磷酸二氢钠(1.2mM)、HEPES(20mM)、D-葡萄糖(25mM)、硫脲(2mM)、抗坏血酸钠(5mM)、丙酮酸钠(3mM)、硫酸镁(2mM)、氯化钙(2.5mM)和环磷腺苷钠(2mM)，PH值为7.3～7.4，渗透压为300～310mOsm/L；

(3)离体脑片制备

取2周龄、3月龄、9月龄和18月龄的小鼠各5只，通过腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉，通过左心室快速灌注预冷过的sACSF(4℃)直至其肝脏变白。然后将小鼠断头取脑，快速放入预冷过的sACSF(冰水混合物状态)中浸泡2～3分钟。之后将小鼠脑组织块稍加修剪后粘着于振动切片机(VT1000,Leica,Germany)刀台上，切取冠状面脑片(膜片钳记录用脑片厚度为320μm，场电位记录用脑片厚度为400μm)。最后，切好的脑片迅速转移至31℃氧饱和的cACSF中复苏1小时。

(4)离体脑片膜片钳记录

将孵育好的脑片转移至全浸没式记录槽中，持续灌流95％O2/5％CO2饱和的cACSF溶液，温度维持在27±2℃，灌流速度为2～3ml/min。在低倍浸水物镜下根据脑图谱选取小鼠脑切片上的海马脑区，换高倍镜找到其中的锥体神经元。通过微操控制记录电极玻璃管靠近神经元胞体，待电极尖端接触到神经元胞体时通过给与电极玻璃管一个负压，会使得细胞膜与电极尖端形成高阻封接(R>1GΩ)，待封接稳定后，通过再给予强而短促的负压，使细胞膜破裂，从而形成全细胞膜片钳记录模式。此过程中细胞活性状态越好，越容易形成高阻封接，相反越难形成高阻封接进而难以形成全细胞膜片钳记录模式。

(5)实验结果分析

如图1所示，使用传统脑切片制备方法，只有幼年小鼠脑切片具有较高的高阻封接机率，然而小鼠成年之后，3月龄、9月龄和18月龄小鼠脑切片的高阻封接机率显著降低，特别是在中老年鼠脑切片中已很难再找到适合膜片钳钳制的细胞。然而，与传统脑切片制备方法制备的脑切片相比，使用本发明提供的中老年小鼠脑切片的制备方法制备的小鼠脑切片不管是来自3月龄(Two-wayANOVAmultiplecomparisons,p＜0.001)、9月龄(Two-wayANOVAmultiplecomparisons,p＜0.001)还是18月龄(Two-wayANOVAmultiplecomparisons,p＜0.001)小鼠都一直保持较高的高阻封接机率。这些数据说明本发明提供的中老年小鼠脑切片的制备方法制备的小鼠脑切片可以较好地保证中老年小鼠脑切片的电生理活性，这也为后续突触传递和突触可塑性的电生理记录提供了重要样本保证。

实施例2

使用本发明提供的中老年小鼠脑切片的制备方法与传统脑切片制备方法制备的不同年龄段小鼠海马脑区突触传递能力的对比。

(1)前面3个步骤，包括实验动物、配制脑切片制备用ACSF和离体脑片制备同本发明实施例1。

(2)离体脑片场电位记录(刺激强度反应曲线)

将脑切片移至场电位记录槽中，持续灌流27±2℃氧饱和的cACSF。刺激电极(钨电极)置于海马脑区的CA3区域，玻璃记录电极置于CA1区域(如图2A所示)，记录电极内灌注含有2％trypanblue的0.5MCH3COONa电极内液，阻抗约为2-6ΜΩ。记录CA1区域锥体神经元的兴奋性突触后场电位(Fieldexcitatorypostsynapticpotential，fEPSP)。通过隔离器调节刺激强度的大小，找到能引起可观察fEPSP的最小刺激强度，再逐渐增大刺激强度，记录每次刺激引起的fEPSP幅度，直到反应幅度达到最大，不再随着刺激强度的增加而增大。刺激方波的波宽为0.05ms，刺激频率为0.033Hz。每一个刺激强度下，连续记录4个sweep取平均值。以不同刺激强度下fibervolley的幅度为横坐标，相应的fEPSP的幅度为纵坐标绘制关系曲线，即为刺激强度反应曲线(Input-outputcurve)，此曲线反映了脑切片上特定信号通路的突触传递效能情况。

(3)实验结果分析

如图2所示，在2周龄幼年小鼠中，传统方法制备的脑切片和本发明提供的方法制备的脑切片都能够很好的诱导出Input-outputcurve，两者之间没有显著性差异(图2B,Two-way ANOVA,p＞0.05)。但是在成年的3月龄小鼠中，使用传统方法制备的脑切片诱导出的Input-outputcurve已显著弱于本发明提供的方法制备的脑切片诱导出的Input-outputcurve(图2C,Two-wayANOVA,p＜0.001)。同样，在中老年小鼠中，使用传统方法制备的脑切片诱导出的Input-outputcurve也是显著弱于本发明提供的方法制备的脑切片诱导出的Input-outputcurve(图2Dand2E,Two-wayANOVA,p＜0.001)。并且，从能够诱导出的最大fEPSP来看，传统方法制备的脑切片在小鼠成年之后诱导出的fEPSP幅度显著降低，但本发明提供的方法制备的脑切片在小鼠成年之后诱导出的fEPSP幅度始终保持较高的水平(图2F，Two-wayANOVAmultiplecomparisons,p＜0.001)。这些数据说明本发明提供的方法制备的脑切片能够很好地保持局部环路的突触传递能力。

实施例3

使用本发明提供的中老年小鼠脑切片的制备方法与传统脑切片制备方法制备的不同年龄段小鼠海马脑区突触可塑性的对比。

(1)前面3个步骤，包括实验动物、配制脑切片制备用ACSF和离体脑片制备同本发明实施例1。

(2)离体脑片场电位记录(突触可塑性)

将脑切片移至场电位记录槽中，持续灌流27±2℃氧饱和的cACSF。刺激电极(钨电极)置于海马脑区的CA3区域，玻璃记录电极置于CA1区域(如图2A所示)，记录电极内灌注含有2％trypanblue的0.5MCH3COONa电极内液，阻抗约为2-6ΜΩ。长时程增强(Long-termpotentiation,LTP)和长时程抑制(Long-termdepression,LTD)被认为是学习记忆的细胞突触机制。其中LTP的记录是先通过input-output方法，找到此条突触通路上的最大fEPSP，然后以能引起该最大fEPSP幅度的1/3～1/2的刺激强度作为测试刺激强度，刺激波宽为0.05ms，每隔30s给予一个测试刺激。稳定基线记录15min后，给予高频刺激诱导LTP(2串100Hz每串100个pulse串间隔10s)。刺激结束后持续记录45min。计算最后10min即35～45minfEPSP幅度均值与基线fEPSP幅度均值的比值，若该比值≥120％，视为LTP诱导成功。

(3)实验结果分析

如图3所示，在2周龄幼年小鼠中，传统方法制备的脑切片和本发明提供的方法制备的脑切片都能够很好的诱导出LTP，并且两者之间没有显著性差异(图3Aand3B,Students’t-test,p＞0.05)。但是在成年的3月龄小鼠中，使用传统方法制备的脑切片诱导出的LTP显著弱于本发明提供的方法制备的脑切片诱导出的LTP(图3Cand3D,Students’t-test,p＜0.001)。另外，在中老年小鼠中，使用传统方法制备的脑切片已经很难再诱导出的LTP(图3E-3H,35～45minfEPSP幅度均值与基线fEPSP幅度均值的比值＜120％)，而本发明提供的方法制备的脑切片仍然能够诱导出显著的LTP(图3E-3H，35～45minfEPSP幅度均值与基线fEPSP幅度均值的比值＞120％)。这些数据说明本发明提供的方法制备的脑切片能够很好地保持局部环路的突触可塑性。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。