用于鉴定五华三黄鸡品种的SNP引物组合、方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于鉴定五华三黄鸡品种的SNP引物组合、方法及应用。

背景技术

五华三黄鸡是梅州市唯一的优良地方鸡品种，具有良好的肉品质、抗逆性和悠久的饲养历史。由于商品鸡的迅速扩张，五华三黄鸡曾经历种群数量的锐减和遗传特性的侵蚀。相关研究单位和企业经过多年的资源收集、提纯复壮和选育，五华三黄鸡群体规模得以恢复。五华三黄鸡与其他品种最大的区别在于尾羽和主翼羽末端为白色。然而，市场所销售的黄鸡品种数量众多，尤其是在活禽逐渐被禁和冰鲜上市的背景下，如何保护五华三黄鸡不被假冒成为企业所要考虑的重要课题。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有密度高、分布广泛、遗传稳定性高、富有代表性、检测便捷等特点。SNP位点常用来鉴定特定品种，具体是首先筛查个体基因组DNA中特有的品种差异性较大的SNP位点，然后组合多个SNP位点进行品种鉴定，通过位点频率来判断或排除特点品种，鉴定的结果往往更加客观、准确。因此，无论从科研还是应用实践中均急需开发一种能有效准确鉴定五华三黄鸡品种的产品及方法，应用于五华三黄鸡品种鉴定工作。

发明内容

本发明提供了一种用于鉴定五华三黄鸡品种的SNP引物组合。

具体地，用于鉴定五华三黄鸡品种的SNP引物组合，选自如下WHP1位点到WHP6位点中的至少一种：

WHP1位于1染色体上第34462795位，该SNP为A/G多态；

WHP2位于1染色体上第70372345位，该SNP为C/T多态；

WHP3位于1染色体上第71604752位，该SNP为G/T多态；

WHP4位于1染色体上第80537328位，该SNP为C/T多态；

WHP5位于7染色体上第23064190位，该SNP为A/C多态；

WHP6位于24染色体上第5415206位，该SNP为G/A多态。

各所述SNP位点引物组对应的核苷酸序列为：

WHP1的引物组：

WHP1F：CGTGGAATGAGAAAGCTGCACWHP1R：ATGAGGCCAATCAACTGCTCA；

WHP2的引物组：

WHP2F：CTCTCAGCCAGCACCTGTAAWHP2R：TGTTCTTGGGTGGAGGTGTG；

WHP3的引物组：

WHP3F：TGGCTTCTGTAACTTTCCGTGTWHP3R：TTGCACATACTTCATGCAACACT；

WHP4的引物组：

WHP4F：CTGGACAGTGCTTCCCTCAGWHP4R：AGGGGCCTGTCTCAATAGGT；

WHP5的引物组：

WHP5F：TCCCAATTTTGGAGCGTCTCAWHP5R：GGTCACGTTGGCTGTTAGGA；

WHP6的引物组：

WHP6F：GGATGGAGGCACCGACTGWHP6R：CACCGTTCTGCTGCGTGTAG。

本发明的目的之二在于提供包含上述SNP引物组合的试剂盒。

本发明的目的之三涉及SNP引物组合在鉴定五华三黄鸡品种中的应用。

本发明的目的之四提供鉴定五华三黄鸡品种的方法。

具体地，鉴定五华三黄鸡品种的方法，包括以下步骤：

(1)提取鸡组织的基因组总DNA，

(2)选择至少两个SNP位点，以及对应的权利要求2所述的SNP引物组进行PCR扩增；

(3)扩增产物测序后，判断基因型；

(4)根据基因型结果，判断个体是否属于五华三黄鸡品种。

进一步地，所述步骤(1)中鸡组织为该鸡品种的含羽髓的个体羽毛、肌肉组织或血液。

进一步地，所述五华三黄鸡中6个SNP位点WHP1～WHP6的基因型依次为AA、TT、GG、TT、CC、GG。

进一步地，所述步骤(4)中，如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合五华三黄鸡对应的基因型，则判定该个体不属于五华三黄鸡；如果所选的至少两个的SNP位点对应的基因型全部符合五华三黄鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于五华三黄鸡的概率。

附图说明

图1为各SNP位点引物的扩增电泳图。

泳道1-4为五华三黄鸡，5-6为文昌鸡，7-8为怀乡鸡，9-10为惠阳胡须鸡，11-12为杏花鸡，13-14为广西三黄鸡，15-16为河田鸡、17-18为桃源鸡，19-20为江汉鸡，21-22为固始鸡，M为DNA marker DL 2000。

具体实施方式

利用基因组重测序技术对不同鸡品种进行测序，通过比对不同鸡品种间的DNA序列，基于红原鸡参考基因组(Galgal5)，筛查出含五华三黄鸡品种6个特异性SNP位点的DNA序列，并对这段序列设计引物进行PCR扩增和测序验证SNP位点的基因型来联合判断待测个体是否属于五华三黄鸡。

具体地，首先确定怀乡鸡、杏花鸡、惠阳胡须鸡、广西三黄鸡、文昌鸡、桃源鸡、河田鸡、江汉鸡、固始鸡等国内黄鸡代表性品种的每个位点的不同等位基因频率均值，其次通过该均值与五华三黄鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，优先选择五华三黄鸡某个位点等位基因频率为0或1，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点。由此确定了6个特异性SNP位点的DNA序列，如表1所示。

表1五华三黄鸡品种鉴定SNP位点组合

根据确定的6个特异性SNP设计对应的扩增WHP1位点到WHP6位点的引物组，如表2所示。

表2五华三黄鸡品种特异SNP位点引物信息

五华三黄鸡品种的鉴定方法：

(1)利用成都福际生物的“动物组织直接PCR试剂盒”

(http://www.foregene.com/scientific_detail.aspx？t＝19&pid＝5&cid＝68)快速提取待测鸡组织(肌肉、羽毛)基因组总DNA，或“EDTA抗凝血直接PCR试剂盒(http://www.foregene.com/scientific_detail.aspx？t＝19&pid＝7&cid＝56)快速提取血液基因组总DNA。

(2)根据表1所选SNP组合，利用表2中的对应的引物对分别进行PCR扩增。

(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型。五华三黄鸡中6个SNP位点WHP1～WHP6的基因型依次为AA、TT、GG、TT、CC、GG。

(4)根据基因型结果，判断个体是否属于五华三黄鸡品种。

如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合五华三黄鸡对应的基因型，则判定该个体不属于五华三黄鸡；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合五华三黄鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于五华三黄鸡的概率。

贝叶斯定理计算公式如下：

其中，pi表示SNP组合中第i个SNP中其他品种对应基因型的频率。

SNP位点在五华三黄鸡及其他品种中的基因型、基因频率如下表：

表3 6个SNP位点在五华三黄鸡及其他品种的基因型、基因型频率

其中，其他品种的基因型频率是指测定的怀乡鸡、杏花鸡、惠阳胡须鸡、广西三黄鸡、文昌鸡、桃源鸡、河田鸡、江汉鸡、固始鸡等国内黄鸡代表性品种基因型频率的平均值。

根据贝叶斯定理，任意1个SNP位点基因型判定为五华三黄鸡的概率最低84.39％，最高89.01％；任意2个SNP位点联合基因型判定为五华三黄鸡的概率达到96.95％以上；任意3个SNP位点联合基因型判定为五华三黄鸡的概率达到99.52％以上；任意4个SNP位点联合基因型判定为五华三黄鸡的概率达到99.92％以上；任意5个SNP位点联合基因型判定为五华三黄鸡的概率达到99.99％以上；全部6个SNP位点的联合基因型判定为五华三黄鸡的概率为达到99.99％以上。任意一个SNP位点基因型排除五华三黄鸡的概率即达到100％。

因此只要有一个SNP位点基因型不符合五华三黄鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于五华三黄鸡；任选2个SNP位点组合，符合五华三黄鸡基因型的判定概率即可达到96％以上。这种方法操作简便，准确性高，可以有效降低市场上五华三黄鸡被假冒的风险。

实施例1

随机选取保种场的五华三黄鸡、杏花鸡、黄郎鸡和商品鸡岭南黄鸡各20只，拔取背部带羽髓的羽毛，使用成都福际生物的“动物组织直接PCR试剂盒”

(http://www.foregene.com/scientific_detail.aspx？t＝19&pid＝5&cid＝68)快速提取待测基因组总DNA，根据表4中的4个SNP位点的引物进行PCR扩增。

PCR体系为30μL，含15μL福际生物PCR试剂盒中2×PCR试剂，正、反向引物各0.3μL(20ng/μL)，1μL DNA模板，13.4μL超纯水。

PCR扩增条件：首先94℃变性3min，然后35个循环(94℃30s、58℃退火30s、72℃延伸30s)，最后72℃后延伸5min，4℃保存。PCR仪器为美国伯乐T100梯度PCR仪。PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测到目标条带后，送至广州艾基生物技术有限公司对序列进行测序。

根据测序结果，单个位点排除五华三黄鸡的概率为90.91％以上，4个位点联合基因型为AA GG CC GG的20个体判定为五华三黄鸡的概率为99.96％，因此，20个个体全部鉴定为五华三黄鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合AA GG CC GG基因型，因此判定为非五华三黄鸡。