一种AIE功能化协同抗菌的改性多糖材料、制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种AIE功能化的改性多糖材料，具体涉及一种AIE功能化协同抗菌的改性多糖材料、制备方法和应用。

背景技术

多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合、失水而成，是由大量单糖通过糖苷键所形成的高分子化合物，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，多糖具有较大的分子量，具有较高的黏度，具有多羟基结构，具有良好的亲水性，在水中容易形成凝胶。多糖在自然界分布极广，如淀粉、纤维素、琼脂、透明质酸、肝素、甲壳素等，由于多糖具有一定的生物功能，因而多糖及其衍生物在生物材料和医用领域的研究和应用已日益引人注目。多糖及其衍生物含有丰富的羟基，如何在温和条件下利用这些亲水性羟基改性多糖及其衍生物，赋予其特定生物医用和体内示踪功能，而不产生过多的降解以及性质的改变一直是研究者们所追求的。

以聚集诱导发光(AIE，Aggregation Induced Emission)为特征的发光材料最近引起了人们的极大兴趣。通常，发色团聚集对发光过程有两种影响，即聚合引起的猝灭(ACQ)现象和聚集诱导发光(AIE)现象。一般情况下，有机发光材料在稀溶液中表现出现强烈的荧光现象，然而在聚集状态下则呈现出微弱荧光甚至无荧光，这是ACQ现象。有些化合物分子，在溶液中几乎不发光，但在聚集的状态下发光增强，由于此发光增强是由化合物分子聚集所导致的，这类现象定义为“聚集诱导发光”(AIE)。聚集诱导发光(AIE)的研究在近十年得到了极大发展，在AIE体系中，聚集体的荧光往往比它们各自的荧光强度大。目前，基于AIE分子的发光材料在生物成像、离子鉴别、分子离子传感器等科技前沿领域具有很大的应用前景。将具有AIE特性的分子接枝在大分子链上，一般不影响其AIE特性，然而，与许多典型的有机染料一样，大部分AIE分子具有疏水性，难以溶解在水中，因此，将AIE分子与亲水性多糖衍生物结合以形成具有高的发光效率，高亲水性、良好的生物相容性和可生物降解性的AIE荧光可示踪多糖衍生物材料具有重要的意义。例如浙大王征科等报道了一系列水溶性壳聚糖基聚集诱导发光材料，但他们使用了多达5步有机反应合成得到异硫氰酸酯功能化的四苯基乙烯AIE活性分子TPE-ITC(Wang,Zhengke等，J.Am.Chem.Soc.135,8238-8245.Long-term fluorescent cellular tracing by the aggregates of AIEbioconjugates)，并且TPE-ITC只能与较低分子量的壳聚糖反应，否则较高分子量的壳聚糖不溶于DMSO，反应则很难进行(壳聚糖从116万降解到5.6万后使用)。

此外，对于多糖来说，本身羟基活性较弱，特别是在水相体系里有大量水的存在会干扰羟基的反应，因此通过多糖的羟基改性具有很大的挑战性。开发在温和条件下制备AIE功能化的可荧光示踪的改性多糖材料的新的制备方法非常重要。

发明内容

针对现有技术中的不足，结合前人工作的基础，本发明的目的是提供一种AIE功能化协同抗菌的改性多糖材料、制备方法及用途，可广泛应用于生物医药领域。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种AIE功能化协同抗菌的改性多糖材料的制备方法。该方法利用具有AIE效应的化合物与卤代乙酰卤如溴乙酰溴、溴乙酰氯或氯乙酰氯进行反应得到卤代的AIE化合物，再将卤代的AIE化合物接枝到亲水性多糖及其衍生物上，得到AIE功能化的改性多糖。

其中，具有AIE效应的化合物可以采用已有化合物，也可以采用自制化合物。

优选地，所述具有AIE效应的化合物为具有如下式1所示结构通式的水溶性AIE染料：

式1中，R1为含有三取代的含氮基团，Ar

优选地，所述的水溶性AIE染料由如下式2的反应途径得到：

式2中，R

优选地，具有AIE效应的化合物中：

所述R

所述的Ar

优选地，所述的多糖及其衍生物为甲壳素、壳聚糖、透明质酸、纤维素、淀粉及其羧甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基衍生物的任一种或者几种混合物；多糖及其衍生物分子量为5kDa～1000kDa。

优选地，具有AIE效应的化合物与溴乙酰溴、溴乙酰氯或氯乙酰氯在第一溶剂中低温下反应一定时间可得到卤代的AIE化合物。

其中，进一步优选，具有AIE效应的化合物、溴乙酰溴(溴乙酰氯或氯乙酰氯)、第一溶剂的质量体积比为1g:(1-10)g:(50-300)ml；第一溶剂为有机溶剂如甲苯或者二氯甲烷，低温范围为0-20℃，反应时间为2-24h。

优选地，卤代的AIE化合物与亲水性多糖或其衍生物上在第二溶剂中低温下反应一定时间可得到AIE功能化的改性多糖。

其中，进一步优选，卤代的AIE化合物、多糖(或多糖衍生物)、溶剂的质量体积比为1g:(1-10)g:(50-300)ml.第二溶剂为可以溶解多糖的碱性水溶液，这里的低温范围为0-25℃，反应时间为24-72h。

优选地，所述的多糖为温敏改性甲壳素，所述温敏改性甲壳素进一步优选为温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素或者温敏性羟丁基甲壳素中的任意一种或几种组合。

本发明还保护一种AIE功能化协同抗菌的改性多糖材料，采用以上任意一项所述制备方法所制备得到，可以用于荧光示踪，在紫外灯下发射出荧光可示踪，且在日光下激发产生活性氧可抗菌杀菌。

本发明还保护一种AIE功能化协同抗菌的改性甲壳素水凝胶，将卤代的AIE化合物接枝到具有温敏性甲壳素及其衍生物上，得到AIE功能化的温敏改性甲壳素；

将AIE功能化的温敏改性甲壳素在低温溶解在水中配置成水溶液，然后置于转变温度以上自发物理交联转变成AIE功能化协同抗菌的改性甲壳素水凝胶，具有可荧光示踪及协同抗菌；如果涂覆成膜，则得到AIE功能化协同抗菌的改性甲壳素水薄膜。

本发明还保护一种AIE功能化协同抗菌的改性多糖薄膜，采用上述任意一项所述制备方法所制备的AIE功能化的改性多糖，配置成溶液后涂覆成膜，得到AIE功能化协同抗菌的改性多糖薄膜。

本发明还保护一种上述AIE功能化协同抗菌的改性多糖材料的应用，用于在动物或人体内的降解示踪、使用示踪及抗菌敷料，在紫外灯下发射出荧光可示踪，且在日光下激发产生活性氧可抗菌杀菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

对于AIE功能化协同抗菌的改性多糖材料，本发明首先制备了水溶性的含有季铵盐基团的AIE染料，再将该AIE染料和卤代乙酰卤进行反应得到卤代的AIE化合物，随后将含溴或者氯的AIE化合物接枝到多糖的羟基上，得到AIE功能化的改性多糖，制备工艺简单，原料易得，容易大规模化生产。

本发明制得的改性多糖具有较强的荧光特性，具有高的发光效率，本身可以荧光示踪，避免了传统荧光小分子在高浓度下荧光减弱甚至淬灭的现象。特别是使用温敏改性甲壳素时，其在低温0-20℃时可溶解在水中配置成水溶液，然后置于转变温度以上自发物理交联转变成可荧光示踪的改性甲壳素水凝胶或者薄膜，其可以在紫外灯下发射出荧光可示踪，且在日光下激发产生活性氧可抗菌杀菌，产生协同抗菌作用，用于伤口修复。且改性多糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，制备简单成本低，绿色环保，并可以用于动物或人体内的降解示踪和使用示踪，在生物医药领域具有广阔的应用前景。

附图说明

利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。

图1为实施例1中AIE染料的AIE效应示意图，其中图1中A在不同四氢呋喃(THF)百分比(f

图2为实施例4中AIE染料改性的多糖水凝胶的荧光效应图，其中，图2A为AIE改性的羟丙基甲壳素FHPCH和对照原料温敏羟丙基甲壳素HPCH溶液-凝胶转变在自然光和紫外灯下的照片(2.0wt％，3mL水里)；图2B为原料温敏羟丙基甲壳素HPCH流变测试溶液-凝胶温敏转变(2.0wt％)，图2C为AIE改性羟丙基甲壳素FHPCH的流变测试溶液-凝胶温敏转变(2.0wt％)。

图3为实施例4中日光下产生活性氧图，其中图3中A为AIE染料以及孟加拉玫瑰红(RB)产活性氧的能力，其中图3中B为羟丙基甲壳素(HPCH)以及AIE改性的羟丙基甲壳素(FHPCH)水凝胶产活性氧能力。

图4为实施例9中AIE改性的温敏性羟丙基甲壳素(FHPCH)和未改性的温敏羟丙基甲壳素(HPCH)凝胶在体外测试荧光成像能力，其中A图为FHPCH和HPCH(2.0wt％，100μL)的不同发射波长的体外荧光成像图片，B图为其对应的荧光定量数据(Ex＝460nm,数据为平均值±SD,n＝3)。

图5为实施例9中AIE改性的温敏性羟丙基甲壳素(FHPCH)和未改性的温敏羟丙基甲壳素(HPCH)凝胶在体内测试荧光成像能力，其中A图为FHPCH和HPCH(2.0wt％，100μL)的不同发射波长的体内荧光成像图片，B图为其对应的荧光定量数据(Ex＝460nm,数据为平均值±SD,n＝3)。

图6为实施例9中AIE改性的羟丙基甲壳素(FHPCH)水凝胶在有和没有日光照(图中“+light”表示有日光照，日光强度400W/m

图7为实施例9中AIE改性的羟丙基甲壳素(FHPCH)水凝胶不同时间太阳光照射对金葡萄菌感染的大鼠抗菌伤口修复的效果(照片比例尺:1cm；12天后新的再生皮肤组织的HE染色，比例尺:200μm)。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的描述，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1制备水溶性AIE染料(TPPy-NH

将93mg 4-甲基吡啶(CAS：108-89-4)和237mg N-Boc-3-氨基丙基溴(CAS：83948-53-2)溶解在10ml乙腈中，反应过夜回流。随后冷却到室温，离心分离得到粗产品Py-Boc.将273mg 4-(二苯基氨基)苯甲醛与330mg Py-Boc加入到反应容器中，在氮气保护下，加入20ml无水乙醇，并加入4滴哌啶做催化剂，回流反应，过夜，将反应液倒入无水乙醚中沉淀，得到红色固体粉末，将橙色粉末加入到10ml 1:2的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液中，0℃搅拌2h,中和后使用乙醚沉淀，即得水溶性AIE染料(TPPy-NH

将

都可以得到类似的含有氨基或者羟基的水溶性AIE染料。

实施例2制备溴代的AIE染料。

将含有氨基或者羟基的具有AIE效应的染料与溴乙酰溴反应得到溴代的AIE染料。

将实施例1中得到的100mg AIE染料TPPy-NH

使用其它卤代乙酰卤如溴乙酰氯或氯乙酰氯也能得到类似的卤代产物。

实施例3制备AIE染料改性的多糖材料

将实施例2中得到的1g溴代AIE染料(TPPy-Br)，2g甲壳素溶解在12％的KOH水溶液中，随后4℃反应24h。将AIE改性的甲壳素透析得到AIE功能化的改性甲壳素材料，在紫外灯下具有明显的橙红色荧光，且可以在日光下产生活性氧可以杀菌抗菌。使用其它碱性水溶液代替12％的KOH水溶液，或者低温范围为0-20℃，反应时间为24-72h，也可以得到类似的结果。

使用其他的多糖及其衍生物，如壳聚糖、透明质酸、纤维素、淀粉及其羧甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基衍生物的任一种或者它们的混合物和卤代AIE染料反应均可以得到具有荧光性的且能产生日光下产生活性氧的改性多糖材料。使用氯代的AIE染料代替溴代的AIE染料也可以得到AIE染料改性的多糖材料。

实施例4制备AIE染料改性的多糖水凝胶

采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的羟丙基甲壳素。称取2克纯化后的甲壳素搅拌分散于预先冷冻的含有11wt％氢氧化钠和4wt％尿素的100克水溶液中，在-20℃下冷冻6h，取出在室温下机械搅拌将其解冻，再重复冷冻解冻2次即可得到溶解的甲壳素水溶液。向得到的甲壳素溶液(100克，2wt％)中加入11.42g环氧丙烷，体系在2℃下机械搅拌反应2h，使反应物混合均匀，接着升温至5℃反应24h，随后升温至15℃反应6h。最后将体系冷却至2℃，用3M盐酸调节体系pH值到7，用去离子水透析7天除去溶液中的尿素和盐等小分子，冷冻干燥得到白色海绵状羟丙基甲壳素(HPCH)，产率为87％。

随后将1g溴代AIE染料(TPPy-Br)，2g羟丙基甲壳素溶解在100g 12％的NaOH水溶液中，随后5℃反应48h；将溶液透析得到AIE功能化且具有温敏性的改性羟丙基甲壳素，将AIE功能化且具有温敏性的改性羟丙基甲壳素配成2％溶液在低温下具有流动性，在体温下可温敏转变形成凝胶，且在紫外灯下具有明显的橙红色荧光(图2)。且可以在日光下产生活性氧(图3)。

使用其他的具有温敏性的多糖及其衍生物如温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素或者温敏性羟丁基甲壳素等，和溴代AIE染料反应均可以得到具有荧光性的且能产生活性氧的改性多糖水凝胶。使用氯代的AIE染料代替溴代的AIE染料也可以得到AIE染料改性的多糖水凝胶。

实施例5可荧光示踪的改性多糖衍生物及其薄膜

将实施例3中AIE改性的多糖材料以2％-5％浓度溶解在20％的氢氧化钾水溶液中，取10ml溶液在玻璃板上涂成1mm的薄膜，然后将玻璃板放入乙醇中浸泡6-12h，取出用去离子水冲洗后撕下得到的具有荧光的且能产活性氧的AIE改性的多糖材料薄膜。

使用其他的多糖及其衍生物，均可以制得具有荧光的且能产活性氧的AIE改性的多糖材料薄膜。

实施例6制备AIE染料改性的透明质酸凝胶

将实施例2制备溴化的AIE染料1g和2g透明质酸在200ml 1％氢氧化钠水溶液在20℃下反应48h，中和后透析冻干(冻干温度为-50℃左右)得到AIE改性的透明质酸海绵。将该AIE改性的透明质酸溶解在水里或者生理盐水里可以制得浓度为0.5-3％的可荧光示踪的粘稠水溶液或者水凝胶，在紫外灯下具有明显的橙红色荧光，且可以在日光下产生活性氧。使用其他的透明质酸衍生物也可以得到类似的结果。

实施例7制备AIE染料改性的纤维素将实施例2中得到的1g溴代的AIE染料(TPPy-Br)，2g羟丙基甲基纤维素溶解在5％NaOH水溶液中，随后室温下反应24h。将AIE改性的羟丙基甲基纤维素透析得到AIE功能化的改性纤维素材料，在紫外灯下具有明显的橙红色荧光，且可以在日光下产生活性氧可以杀菌抗菌。使用其它碱性水溶液溶液中，或者低温范围为0-20℃，反应时间为24-72h，也可以得到类似的结果。

使用其他的纤维素衍生物也可以得到类似的结果。

实施例8制备AIE染料改性的淀粉

将实施例2制备溴代的AIE染料1g和2g可溶性淀粉在200ml 1％氢氧化钠水溶液25℃中反应48h，中和后透析冻干(冻干温度为-50℃左右)得到AIE改性的淀粉。将该AIE改性的淀粉溶解在水里或者生理盐水里可以制得合适浓度的可荧光示踪的粘稠水溶液或者水凝胶。

使用其他的淀粉衍生物也可以得到类似的结果。

实施例9示踪及伤口修复

结合动物实验对本发明实施例4制备的AIE改性的温敏性羟丙基甲壳素水凝胶的体内外示踪及伤口修复做出评价。

图4、图5中将AIE改性的温敏性羟丙基甲壳素和未改性的温敏羟丙基甲壳素凝胶在体内和体外测试荧光成像能力，显示AIE改性的温敏性羟丙基甲壳素在红色/近红外发射波段在体内以及体外均具有良好的成像效果。

图6表明AIE改性的温敏性羟丙基甲壳素具有良好的协同抗菌效果由于水凝胶中季铵盐的存在和卓越的ROS的生产效率。

图7表明AIE改性的温敏性羟丙基甲壳素水凝胶能够显著提高创面修复能力。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。