一种检测血清中英夫利西的胶体金试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测血清中英夫利西的胶体金试剂盒。

背景技术

TNF-α作为一种具有多种生物学活性的细胞因子，通过与受体结合，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复，引起肿瘤细胞凋亡等。但TNF-α的过度表达会引起类风湿关节炎、强直脊髓炎、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)等自身免疫病。抗TNF-α单克隆抗体由于针对疾病特异性强、半衰期长及副作用小等优点，成为该类疾病的首选药物。目前，国内外上市的抗TNF-α单抗药物主要包括英夫利西单克隆抗体(Infliximab，IFX)、阿达木单克隆抗体(Adalimumab，ADA)、戈利木单克隆抗体(Golimumab)、赛妥珠单克隆抗体(Certolizumab pegol，CZP)、乌司奴单克隆抗体(Ustekinumab)等。

英夫利西抗体药物能够发挥治疗效应主要取决于药物进入患者体内后达到并维持足够的治疗窗浓度，目前研究表明IBD患者维持病情缓解需要英夫利西药物浓度维持在3μg/mL以上，当IBD患者英夫利西药物测定浓度低于3μg/mL，采用加大剂量输注或缩短给药间隔的用药方案调整能够显著提升患者的粘膜愈合率。因此，准确、快速评估英夫利西单抗药物的体内浓度对于患者获得更佳疗效及临床医生治疗决策具有极其重要的意义。

目前，抗体药物的检测方法主要有以下几种：酶联免疫(ELISA)法、电化学发光免疫(ECL)法、放射免疫分析(RIA)法和表面等离子共振(SPR)法。该四种方法均需要昂贵的仪器设备，对检测人员的专业技术要求较高。同时，且样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足高通量、快速、在线检测的需要，不适合基层医务人员现场操作。

虽然现有技术中已经有许多胶体金免疫检测试纸条或试剂盒的专利，但之前没有采用胶体金试纸条或试剂盒快速检测样品中单抗药物的浓度，并以此快速判断药物在体内暴露量的报道。

发明内容

本发明为解决现有技术中缺乏简单、快速判断单抗药物的体内暴露量的检测试剂，提供了一种检测血清中英夫利西的胶体金试剂盒。

虽然现有技术中已经有许多胶体金免疫检测试纸条或试剂盒的专利，但之前没有采用胶体金试纸条或试剂盒检测人血清中英夫利西的报道。生物药的使用主要依赖于酶联免疫(ELISA)法、电化学发光免疫(ECL)法、放射免疫分析(RIA)等。

本发明的试剂盒可以快速、简易、低成本地检测血清中的英夫利西，不需要依赖复杂的化学和生物分析设备，非常适合基层医务人员快速检测患者在接受英夫利西药物治疗后的体内药物暴露量，并据此调整注射剂量及给药周期。

本发明提供一种检测血清中英夫利西的胶体金试剂盒，所述的胶体金试剂盒包括含有胶体金垫的抗英夫利西独特型抗体的胶体金检测试纸条和样本稀释液；所述英夫利西单抗的胶体金检测试纸条包括衬底、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫；所述的胶体金垫上含浓度为2.5～20μg/cm

较佳地，所述的胶体金垫上含浓度为5～10μg/cm

其中，所述的抗英夫利西独特型抗体-胶体金复合物的制备较佳地包括以下步骤：

(1)将胶体金溶液的pH调节至6.8～7.4；

(2)每1mL步骤(1)所得的胶体金溶液加入10～20μg抗英夫利西独特型抗体HCA212，保持搅拌10～15min；

(3)每1mL步骤(2)所得的胶体金溶液加入100～200μL 1％BSA溶液，继续搅拌1～2h，封闭裸露金颗粒；

(4)离心后用0.1～0.3M磷酸缓冲液重悬，再离心，重复洗涤1～3次；

(5)步骤(4)中的沉淀用100～200μL缓冲液重悬，缓冲液中含有1％～3％的表面活性剂或者稳定剂；

(6)将胶体金复合物以50～100μL/cm

步骤(3)中，所述的BSA的终浓度较佳地为0.2％；

步骤(4)中，所述离心的温度较佳地为4℃，所述离心的离心速度较佳地为3000～5000r/min，更佳地为4000r/min，所述离心的时间较佳地为30min。

步骤(4)中，所述的磷酸缓冲液浓度较佳地为0.2M。

步骤(5)中，所述的表面活性剂较佳地为吐温-80、吐温-60或泊洛沙姆；所述的稳定剂较佳地为聚乙烯醇或聚乙二醇。

步骤(6)中，所述的干燥为真空干燥。

较佳地，所述的样本稀释液为磷酸盐缓冲液。所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度可为本领域常规；较佳地，所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度较佳地为0.2M。

其中，所述的包被膜优选包括检测区域和质控区域，所述检测区域含由抗英夫利西独特型抗体HCA213溶液制备的隐性检测线，所述质控区域包括由抗IgG多抗溶液制备的隐性质控线；

所述的抗英夫利西独特型抗体HCA213溶液的浓度优选0.5～1.0mg/mL，和/或，所述的抗IgG多抗溶液的浓度优选0.5～1.0mg/mL；

较佳地，所述的抗IgG多抗为羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔IgG抗体。

在本发明一较佳实施例中，所述包被膜的制备方法包括如下步骤：

(1)将所述抗英夫利西独特型抗体HCA213溶液使用喷膜仪喷于包被膜的检测区域上；

(2)将所述抗IgG多抗溶液喷于包被膜的质控区域上；

(3)将上述步骤获得的包被膜干燥，即得。

在一较佳的具体实施例中，所述衬底为PVC板，所述包被膜为硝酸纤维素膜，所述胶体金垫由聚酯制得，和/或，所述吸水垫由纤维素制得。

优选地，样品垫、胶体金垫、包被膜、吸水垫依次搭接于衬底上。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

其中，所述的抗英夫利西独特型抗体HCA213和HCA212购自BioRad，本发明中HCA213和HCA212的使用顺序可以倒置。另外，也可以使用本领域中的其他类似配对产品

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明的试剂盒操作简便、快速。处理时间可低至10～20min；结果判定简单明了、准确；试剂盒稳定性强、易于保存。

(2)本发明的试剂盒可以简易、低成本地检测血清中的英夫利西，不需要依赖复杂的化学和生物分析设备，非常适合基层医务人员快速检测患者在接受英夫利西药物治疗后的体内药物暴露量，并据此调整注射剂量及给药周期。

附图说明

图1为本发明阿达木单抗抗药抗体的胶体金检测试纸条的结构示意图；1.PVC底板、2.样品垫、3.胶体金垫、4.检测线、5.质控线、6.吸水垫、7.硝酸纤维素膜。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

材料：PVC底板购于上海金标生物科技有限公司；样品垫购于上海金标生物科技有限公司；胶体金垫购于上海金标生物科技有限公司；吸水垫购于上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜购于美国Millipore公司。

以下实施例中使用的抗英夫利西独特型抗体(HCA213)和抗英夫利西独特型抗体(HCA212)均为市售产品，购自BioRad；也可以使用本领域中的其他类似配对产品。

实施例1英夫利西的胶体金检测试纸的制备

(1)胶体金垫的制备：

抗英夫利西独特型抗体-胶体金复合物的制备：将胶体金溶液调节pH至6.8，按照每1mL胶体金溶液加入10μg抗体的比例，加入PBS稀释的抗英夫利西独特型抗体(HCA213)，保持搅拌10～15min，加入100μL的1％BSA，封闭裸露金颗粒，继续搅拌1～2h，4℃，4000r/min离心30min，用0.2M磷酸缓冲液重悬，再离心，重复洗涤2次，每原始体积1mL的胶体金溶液采用100～200μL的缓冲液将沉淀复溶，缓冲液中含有1％的吐温-80。缓冲液中除了使用吐温-80外，吐温-60或者其他的一些较为温和的表面活性剂，例如泊洛沙姆等，或者稳定剂：如聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)，也可以用于本发明。使用喷膜仪，将抗英夫利西独特性抗体(HCA212)-胶体金复合物喷于金标垫上，喷涂量为50μL/cm

(2)包被膜的制备：用磷酸盐缓冲液将抗英夫利西独特性抗体(HCA213)配制成浓度1.0mg/mL的溶液，划在硝酸纤维素膜的检测区域上；用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG配制成浓度1.0mg/mL的溶液，划在硝酸纤维素膜的质控区域上；硝酸纤维素膜干燥备用。

(3)试纸条组装：将样品垫、包被有抗英夫利西独特性抗体(HCA212)-胶体金复合物的胶体金垫、包被有抗英夫利西独特性抗体(HCA213)和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接于PVC垫衬上，并切割、包装。

(4)样本稀释液的配制：0.2M磷酸盐缓冲液。

实施例2阿达木单抗抗药抗体的胶体金检测试纸的制备

(1)胶体金垫的制备：

抗英夫利西独特性抗体(HCA212)-胶体金复合物的制备：将胶体金溶液调节PH至7.4，按照每1mL胶体金溶液加入20μg抗体的比例，加入PBS稀释的抗英夫利西独特性抗体(HCA212)，保持搅拌10～15min，加入200μL的1％BSA，封闭裸露金颗粒，继续搅拌1～2h，4℃，4000r/min离心30min，用0.2M磷酸缓冲液重悬，再离心，重复洗涤2次，每原始体积1mL的胶体金溶液采用100～200uL的缓冲液将沉淀复溶，缓冲液中含有1％的聚乙二醇(PEG)。使用喷膜仪，将抗英夫利西独特性抗体(HCA212)-胶体金复合物喷于金标垫上，喷涂量为100μL/cm

(2)包被膜的制备：用磷酸盐缓冲液将抗英夫利西独特性抗体(HCA213)配制成浓度0.5mg/mL的溶液，划在硝酸纤维素膜的检测区域上；用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG配制成浓度0.5mg/mL的溶液，划在硝酸纤维素膜的质控区域上；硝酸纤维素膜干燥备用。

(3)试纸条组装：将样品垫、包被有抗英夫利西独特性抗体(HCA212)-胶体金复合物的胶体金垫、包被有抗英夫利西独特性抗体(HCA213)和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接于PVC垫衬上，并切割、包装。

(4)样本稀释液的配制：磷酸盐缓冲液。

效果实施例1

本实施例提供一种实施例1～2所述英夫利西的胶体金检测试纸的应用。

患者采集外周静脉血1mL，室温凝结30min后，1600g，4℃离心10min，分离血清。吸取10μL血清，与190μL样本稀释液混合均匀，随后立即吸取100μl滴加在样品垫上，在5～10min内观察检测线和质控线。若检测线和质控线都显色，表明该患者血清样本中英夫利西单抗浓度在有效窗口内，反之则不在有效窗口内。无论结果怎样，质控线均应该出现线条，若质控线无线条，表明试纸失效。

本效果实施例中显示实施例1和2的试剂盒均可以测得与使用ELISA技术检测的检测一致的效果。采用ELISA法测血清中英夫利西的具体步骤如下：

(1)每孔加入100μl的1.000μg/ml的抗英夫利西独特性抗体(HCA212)至96孔板，放置于冷藏冰箱(2～8℃)温育过夜(约14～18h)。

(2)甩去板内液体，用含0.05％吐温20的PBS溶液洗板三次，在纸上拍干。每孔加入300μl的1％(w/v)BSA-PBS溶液封闭，25±1℃温育2h～5h。

(3)甩去板内液体，洗板三次，在纸上拍干。在相应的孔内分别加入100μl的标曲、质控样品和个体样品，25±1℃温育1h±5min。

(4)甩去板内液体，洗板三次，在纸上拍干。每孔加入100μl的标记HRP的抗英夫利西独特性抗体(HCA213)溶液(1％BSA-PBS溶液10倍稀释)，封板膜封板，25±1℃温育1h±5mins。

(5)甩去板内液体，洗板四次，在纸上拍干。每孔加入100μl TMB单组份显色液，25±1℃避光温育15mins±3mins。

(6)每孔加入100μL终止液终止反应。使用酶标仪震荡混匀5s，波长450-560nm下读板。通过四参数拟合得到个体样品浓度，依据浓度判断个体样品中英夫利西单抗浓度是否在有效窗口内。

采用实施例1～2所述英夫利西的胶体金检测试纸与ELISA法，分别测定5名英夫利西用药患者的外周血分离血清和血浆，检测结果如下表1所述。表1的数据说明采用实施例1、实施例2获得的检测结果与ELISA方法100％一致，未出现假阳性或假阴性。

表1实施例1～2与ELISA检测结果比较

效果实施例2灵敏度试验

检测实施例1～2制备的胶体金检测试纸条的灵敏度：将阳性英夫利西溶解在阴性空白血清中，配制成为100μg/mL的溶液，采用2倍梯度稀释，得到一系列不同浓度的含有英夫利西的血清样本。采用该系列样本检测胶体金检测试纸的检测灵敏度。检测结果表明，按照实施例1和实施例2的实施方案制备的胶体金检测试纸条，灵敏度为3.125μg/mL(表2)。

表2灵敏度比较