冻干保护剂、粪菌冷冻干燥产物及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种冻干保护剂、粪菌冷冻干燥产物及其制备方法。

背景技术

冷冻干燥技术是将湿物料或溶液在较低温下冻结成固态，然后在低真空度下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。由于冷冻干燥在低温、低压下进行，而且水分直接升华，因此在物料干燥上具有许多优势，比如能干燥热敏性物料，且经干燥的物料十分稳定，便于长时间贮存。由于物料的干燥在冻结状态下完成，与其他干燥方法相比，物料的物理结构和分子结构变化极小，其组织结构和外观形态被较好地保存。在冷冻干燥过程中，物料不存在表面硬化问题，且其内部形成多孔的海绵状，因而具有优异的复水性，可在短时间内恢复干燥前的状态。

基于上述优势，冷冻干燥已被广泛应用于食品药品行业，包括微生物的保存与生产。人体微生物被称为“人类的第二基因组”。2016年5月13日，美国白宫启动“国家微生物组计划(National Microbiome Initiative,NMI)”，预计投入5.21亿美元，将微生物组研究提升到国家战略地位。肠道是人体内最大的微生态环境，参与人体的营养吸收、能量代谢、组织器官发育、免疫防御及内分泌调控等多种重要的生理过程。近十几年来肠道微生态学取得了飞跃式的发展，人类对其认识不断加深，肠道微生态被认为是人体的“第二大脑”和“第二基因组”，与人类健康息息相关。

粪菌移植(Fecal microbiota transplantation，FMT)，其定义是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗

由于干燥对象是活性微生物，相比起其他非生命体活性物质(如蛋白，酶等)，微生物在干燥过程更为脆弱，对干燥条件更加敏感。因此微生物的冷冻干燥工艺难度更大，最常见的乳酸菌和益生菌的冷冻干燥，其配方除了常见的填充剂、赋性剂，冷冻干燥微生物时通常需要加入保护剂。

常见的微生物冷冻干燥保护剂主要依托于海藻糖和麦芽糖糊精。海藻糖和麦芽糖糊精对细菌的冻干保护性已被大量报道，尤其是海藻糖，在诸多研究中显现出对细菌细胞冻干过程中的优越保护性。海藻糖和麦芽糖糊精已在食品行业被应用在乳酸菌和益生菌的冻干粉生产。然而最新研究表明，海藻糖与麦芽糖糊精有潜在风险。Collins J.等人于2018年在《Nature》上发表研究论文，发现海藻糖能被人体肠道中的部分艰难梭菌菌株代谢，进而提高了这些艰难梭菌的毒力。麦芽糖糊精是淀粉部分水解后产生的多糖，近年来也有较多研究报道了食用麦芽糖糊精对肠道健康的负面作用。例如，Laudisi F.等人在《Cellularand Molecular Gastroenterology and Hepatology》上报道了食用富含麦芽糖糊精的食物会促进粘膜损耗加剧肠道炎症的发生。也有研究发现麦芽糖糊精会促进肠道内沙门氏菌的存活率，并且提高其在肠道里的定殖能力(PLoS ONE 9(7):e101789.)。另一份研究发现麦芽糖糊精会强化大肠杆菌的肠道粘度力，而这类大肠杆菌与克罗恩病相关(PLoSOne.2012；7(12):e52132.)。麦芽糖糊精会损坏细胞的抗菌响应从而抑制肠道的抑菌机制。

中国申请专利201610191460公开了常温存放乳酸菌冻干粉的保护剂，包含脱脂乳粉2-4wt％、谷氨酸钠2-4wt％、海藻糖5-8wt％、麦芽糖醇2-5wt％和聚葡萄糖12-18wt％。

中国专利申请201911307346公开了一种冻干保护剂，对发酵菌株的菌体进行保护，其组成成分包括脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和水。

有别于传统的乳酸菌和益生菌，来自粪便的菌群并非单一明确的菌株或菌种，而是一组复杂的含量繁多的菌群。对比起目前已成熟商业化的乳酸菌和益生菌，粪便菌群中的微生物厌氧程度更高，其中许多菌种对环境条件敏感，难以在实验室环境中长期存活。因此，冷冻干燥是保存生产粪便菌群的重要手段，探索合适的冷冻干燥保护剂用以保护粪便中菌群的稳定性是实现人类肠道菌群产业化的重要技术壁垒。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种冻干粉保护剂组合物，以最大限度保存粪菌微生物的活性，并且无需长期超低温冷冻保存，放宽了产品保存的条件。

本发明上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种冻干保护剂，其组分包括聚葡萄糖、甘露醇、甘氨酸、维生素C和吐温80。

优选地，按质量百分数计，所述冻干粉保护剂包括以下组分：1-60％聚葡萄糖、0.1-10％甘露醇、0.1-10％甘氨酸、0.01-1％维生素C和0.01-5％吐温80。

优选地，按质量百分数计，所述冻干粉保护剂包括以下组分：10-30％聚葡萄糖、0.1-5％甘露醇、0.1-5％甘氨酸、0.1-0.5％维生素C和0.01-5％吐温80。

优选地，按质量百分数计，所述冻干粉保护剂包括以下组分：10％聚葡萄糖、1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C和0.01％吐温80，余量为水；或或30％聚葡萄糖、0.1％甘露醇、0.1％甘氨酸、0.01％维生素C和0.05％吐温80，余量为水。

优选地，按质量百分数计，所述冻干粉保护剂包括以下组分：聚葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、维生素C和吐温80。

优选地，按质量百分数计，所述冻干粉保护剂包括以下组分：1-60％聚葡萄糖、1-60％海藻糖、0.1-10％甘露醇、0.1-10％甘氨酸、0.01-1％维生素C和0.01-5％吐温80。

优选地，按质量百分数计，所述冻干粉保护剂包括以下组分：10-30％聚葡萄糖、10-30％海藻糖、0.1-5％甘露醇、0.1-5％甘氨酸、0.1-0.5％维生素C和0.01-5％吐温80。

优选地，按质量百分数计，所述冻干粉保护剂包括以下组分：10％聚葡萄糖、15％海藻糖、1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C和0.01％吐温80，余量为水。

本发明还提供一种上述冻干保护剂的制备方法，所述制备方法包括：将所述冻干保护剂的各组分按照配比溶解于水中，搅拌10-30分钟，升温至120-122℃保温杀菌15-30分钟，然后降温至室温，即得冻干保护剂。

有益效果：

(1)本发明提供的冻干保护剂，其成分为聚葡萄糖、甘露醇、甘氨酸、维生素C和吐温80，其中高分子多糖的特性促进了样本冷冻阶段期间水从细胞流出，从而限制细胞内冰晶的形成。并且通过增加细胞外介质的粘度，在干燥过程形成胞外支架，同时降低胞外晶体生长，最终保护了细胞的存活。

(2)冻干保护剂中的甘氨酸在溶液中易结合水分子，使溶液的粘性增加，弱化了水的结晶过程，从而达到了保护细胞的目的；甘露醇在配方中作为优良的骨架使用，此外甘露醇和甘氨酸在组合物中还可提高冻干产品的崩解温度，使产品容易冻干，协同保护微生物的冷冻效果；甘氨酸和维生素C合用还能协同消除自由基团，提高粪菌冻干产物贮存的稳定性，提高贮存温度，延长贮存时间。各原料相互作用，以最大限度保存样本混合菌群的活性。

(3)用上述冻干保护剂制得的冻干粪菌产品，其粪菌总菌存活率高，效果优于海藻糖；并能特异性提高对粪菌中的有益菌尤其是双歧杆菌的保护。

(4)冻干保护剂中加入聚葡萄糖，除了能有效保护细胞外，还兼有益生元的作用，能被人体肠道内的益生菌(尤其是双歧杆菌和乳酸杆菌)作为可发酵纤维利用，能在肠道中促进益生菌的增殖，同时提高短链脂肪酸(SCFA)等有益代谢物的产生；此外聚葡萄糖还产生甜度风味，可部分掩盖粪菌的不悦气味；

(5)使用所述冻干保护剂不仅可以最大限度的保护混合菌，还可以通过提高上述有益菌数量与活力的提升以及关联代谢产物来治疗肠道及肠道外疾病；

(6)所述冻干保护剂可降低海藻糖和麦芽糖糊精等带来的潜在风险，亦有潜力提高粪菌移植产品的最终疗效。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

实施例与对比例中的冻干保护剂均采用以下方法制备得到：将冻干保护剂各组分按照配比溶解于水中，搅拌20分钟，升温至120℃保温杀菌20分钟，然后降温至室温，即得冻干保护剂。

实施例1

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：10％聚葡萄糖、1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C和0.01％吐温80，余量为水。

实施例2

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：50％聚葡萄糖、5％甘露醇、5％甘氨酸、0.05％维生素C和1％吐温80，余量为水。

实施例3

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：30％聚葡萄糖、0.1％甘露醇、0.1％甘氨酸、0.01％维生素C和0.05％吐温80，余量为水。

实施例4

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：10％聚葡萄糖、0.5％甘露醇、0.5％甘氨酸、0.3％维生素C、0.01％吐温80，余量为水。

实施例5

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：冻干保护剂组分包括3％聚葡萄糖、15％海藻糖、1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C、0.01％吐温80，余量为水。

实施例6

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：冻干保护剂组分包括5％聚葡萄糖、15％海藻糖、1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C、0.01％吐温80，余量为水。

实施例7

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：30％聚葡萄糖、5％甘露醇、5％甘氨酸、0.01％维生素C、5％吐温80和30％海藻糖，余量为水。

对比例1

冻干保护剂组分包括：5％海藻糖、0.9％氯化钠和0.01％吐温80，余量为水。

对比例2

冻干保护剂组分包括10％海藻糖、1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C和0.01％吐温80，余量为水。

对比例3

冻干保护剂组分包括10％低聚果糖、1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C和0.01％吐温8，余量为水。

对比例4

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：10％聚葡萄糖、1％甘露醇、0.3％维生素C和0.01％吐温80，余量为水。

对比例5

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：10％聚葡萄糖、1％甘露醇、1％甘氨酸和0.01％吐温80，余量为水。

对比例6

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：10％聚葡萄糖、1％甘氨酸、0.3％维生素C、0.01％吐温80和15％海藻糖，余量为水。

对比例7

一种冻干保护剂组合物，包括如下组分：1％甘露醇、1％甘氨酸、0.3％维生素C、0.01％吐温80和15％海藻糖，余量为水。

效果例1

研究不同冻干保护剂组成的配方对冻干后菌群存活率的影响

1、粪菌液采用以下制备方法(详细的制备方法参见中国专利申请2020101493463)得到：将健康人粪便按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌，均质化处理，再进行逐级过滤；将滤液离心后用50mL无菌去氧生理盐水重悬，所得混悬液即粪菌液。

粪菌冷冻干燥产物的制备方法如下：

(1)粪菌液分别与实施例1-7、对比例1-7的冻干保护剂溶液按体积比1：10，用vortex进行涡旋混匀，得菌液-保护剂混合液；

(2)将(1)中的菌液-保护剂进行取样，作为冻干前菌液-保护剂混合液，用于对比冷冻干燥后的样本。剩余混合液放入冰箱内-80℃冷冻30分钟；

(3)将(2)中冷冻后的混合菌液-保护剂放入冻干机内，冻干48h，分装，置于4℃冷藏，即得粪菌冷冻干燥产物。

2.粪菌液冻干前样品的检测

对冻干前留样样本使用流式细胞仪进行分析，确定不同冻干保护剂稀释浓缩粪菌液的作用。使用ThermoFisher染色试剂盒(LIVE/DEAD BacLight

3.粪菌液冻干后样本进行检测

3.1冻干保护剂对粪菌冻干后总活菌数和存活率的影响

将制备好一周内的实施例1-7和对比例1-7的粪菌冷冻干燥产物对其使用流式细胞仪搭配试剂盒进行总活菌数检测和计数。同样的，将实施例1-7和对比例1-7的粪菌冷冻干燥产物置于厌氧条件下并使用哥伦比亚肉汤琼脂培养基进行微生物厌氧培养，在72小时后进行计数并统计。

实验结果

(1)不同冷冻保护剂对冻干前微生物群存活率的作用

在不同冷冻保护剂的评估中，不同保护剂对样本中总活菌数的影响有限，且不同保护剂对总活菌数的影响结果接近，无显著差异。见表1。

(2)不同保护剂对微生物群冻干存活率的作用

在不同冷冻保护剂的冻干效果评估中，不同保护剂对样本中总活菌数的保护效果存在明显区别。相比对比例，实施例制得的样品能够起到明显更好的保护效果，其中，对比例1相比与实施例1，不含有聚葡萄糖、甘露醇、甘氨酸和维生素C，含有吐温80，氯化钠和海藻糖，冻干保护效果远不如实施例1；对比例2相比于实施例1，不含有聚葡萄糖，增加海藻糖，冻干效果为64％，相比实施例1冻干存活率下降了22％；对比例3相比于实施例1，不含聚葡萄糖，效果不如对比例2和实施例1；对比例4相比于实施例1减少了甘氨酸，对比例5相比于实施例1减少了维生素C，对比例6相比于实施例1减少了甘露醇，其冻干保护效果均由不同程度的下降，其中缺少维生素C下降最明显，此外实施例4与对比例4、6总量相当，但效果明显好于对比例4和6，很好的验证了甘露醇和甘氨酸具有协同发挥冷冻保护作用的理论。具体见表1。

表1：不同配方保护下的粪菌在冷冻干燥前后的活菌数及冻干存活率

3.2冻干保护剂对粪菌冻干后厌氧全菌、肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、梭菌的保护检测

检测方法为使用针对不同纲科属的培养基对实施例6、实施例6和对比例7的粪菌冷冻干燥产物样本进行厌氧涂板培养72小时，计数后进行统计分析。针对不同单菌所用的培养基如下表所示，所有单菌培养皆为37摄氏度下厌氧培养72小时。

3.实验结果

针对6种不同类型的细菌(肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、梭菌)以及厌氧全菌而言，冻干保护剂配方实施例5、实施例6能够在厌氧全菌、肠杆菌、双歧杆菌、乳酸菌、肠球菌、拟杆菌等类型的细菌上都有很好的保护效果。结果见表2。

表2：不同配方保护下的不同菌样品在冻干后的活菌数及存活率

*涂板操作误差下产生的大于100％存活率在此处均以100％表示

效果例2

研究不同冻干保护剂配方分别对屎肠球菌、脆弱拟杆菌、唾液乳杆菌、融合魏斯氏菌、双歧杆菌5株单菌的影响

1、5株单菌冷冻干燥产物的制备方法如下：

(1)将屎肠球菌、唾液乳杆菌、融合魏斯氏菌、双歧杆菌4株单菌分别与实施例5、实施例6和对比例7的冻干保护剂溶液按体积比1：10，用vortex进行涡旋混匀，得菌液-保护剂混合液；

(2)将(1)中的菌液-保护剂进行取样，作为冻干前菌液-保护剂混合液，用于对比冷冻干燥后的样本。剩余混合液放入冰箱内-80℃冷冻30分钟；

(3)将(2)中冷冻后的混合菌液-保护剂放入冻干机内，冻干48h，分装，置于4℃冷藏，即得各单菌冷冻干燥产物。

2、冻干保护剂对屎肠球菌、脆弱拟杆菌、唾液乳杆菌、融合魏斯氏菌、双歧杆菌5种单菌的保护作用

检测方法为使用特定的专性培养基检测。针对不同单菌所用的培养基如下表所示，对实施例5、实施例6和对比例7的粪菌冷冻干燥产物样本在37℃下厌氧培养72小时。

3.实验结果

对于屎肠球菌、脆弱拟杆菌、唾液乳杆菌、融合魏斯氏菌、双歧杆菌等5株单菌，包含聚葡萄糖的冻干保护剂能够起到更好的保护效果。其中，实施例5、6在屎肠球菌、脆弱拟杆菌、唾液乳杆菌、融合魏斯氏菌以及双歧杆菌的保护效果上均好于对比例7。详见表3。

表3不同配方保护下的不同菌种在冻干后的活菌数log

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。