一种用于急性肾损伤的纳米酶诊疗剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种用于急性肾损伤的纳米酶诊疗剂及其制备方法与应用。

背景技术

急性肾损伤是人类重要的健康问题。由于其高发病率和死亡率,据估计全球每年有170万人死亡。目前,辅助治疗和肾移植是最常见的治疗方法。最近的研究表明,急性肾损伤的发病机理与细胞内过量的活性氧和活性氮物种相关。此前,一些小分子药物,例如,氨磷汀和乙酰半胱氨酸,已经被证明可以作为抗氧化剂,消除活性氧,以此来缓解急性肾损伤。然而，小分子药物具有较低的利用率，较大的毒副作用以及有限的疗效。这些都阻碍了他们的临床应用。但是，抗氧化剂的成功发展为急性肾损伤未来的治疗提供了充分的基础。

发明内容

发明人研究发现，相较于传统蛋白酶，纳米酶具有成本低、催化性质可调、可大规模制备等明显优势。同时，纳米酶，尤其是铱、铂、铑、钌等贵金属材料具有广谱的活性氧和活性氮的清除能力。此外，纳米材料具有独特的物理化学性质，这使得它们可作为临床或预临床成像手段的造影剂。更重要的是，超小的纳米颗粒可以通过肾脏进行代谢，这就为急性肾损伤的治疗提供了可能。

基于此，本发明开发了利用纳米酶用于急性肾损伤的治疗。

具体地，本发明提供一种用于急性肾损伤的纳米酶诊疗剂及其制备方法与应用，旨在解决现有的小分子药物利用率低、副作用大，难以用于急性肾损伤治疗的技术问题。

本发明第一方面，提供一种用于急性肾损伤的纳米酶诊疗剂，其中，包括：贵金属纳米颗粒，结合在所述贵金属纳米颗粒表面的表面配体。这些表面配体能够有效的稳定纳米颗粒，控制纳米颗粒具有很小的尺寸。并且它们都具有良好的水溶性和生物安全性，不易于血清内蛋白发生作用，有利于纳米颗粒在血液中的循环。

可选地，所述贵金属纳米颗粒选自铱纳米颗粒、铂纳米颗粒、铑纳米颗粒、钌纳米颗粒中的一种或多种。

可选地，所述表面配体选自聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、柠檬酸、聚乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物等中的一种或多种，但不限于此。

可选地，所述贵金属纳米颗粒和所述表面配体的质量比为1:(1-10)。

可选地，所述纳米酶诊疗剂为直径小于5nm的球形颗粒。

本发明第二方面，提供一种如上所述的纳米酶诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：将贵金属盐和表面配体混合于多元醇(如乙二醇或其他高沸点醇，如丙三醇等)中，搅拌并加热，加入氢氧化物(如氢氧化钠、氢氧化钾等)溶液进行反应，得到混合溶液；将所述混合溶液加入到水中，分离洗涤，即得到所述纳米酶诊疗剂。

可选地，所述多元醇与氢氧化物溶液的体积比为(10-40):1，氢氧化物溶液浓度范围：1-10摩/升。

可选地，所述反应的时间为1-4小时，所述反应的温度为120-150摄氏度。

本发明第三方面，提供一种如上所述的纳米酶诊疗剂在制备诊断和治疗急性肾损伤制剂中的应用。

本发明第四方面，提供一种如上所述的纳米酶诊疗剂作为计算机断层扫描、光声成像技术的造影剂的应用。

有益效果：本发明纳米酶诊疗剂包括表面配体以及由所述表面配体保护的贵金属纳米颗粒。本发明的纳米酶诊疗剂具有超小的尺寸，能够有效的富集于小鼠肾脏，能够清除肾小管内大量的活性氧或活性氮以缓解和治疗甘油或顺铂诱导的急性肾损伤，并且可作为计算机断层扫描、光声成像技术的造影剂。另外，这些纳米酶诊疗剂具有良好的治疗效果，同时具有优异的生物相容性和生物安全性。

附图说明

图1为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂的合成路线图；

图2为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂的TEM图；

图3为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂的XPS图；

图4为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂羟基自由基清除率图；

图5为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂超氧阴离子清除率图；

图6为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂自由基清除率图；

图7为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂氮自由基清除率图；

图8为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂处理肾小管细胞(293T)存活率图；

图9为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂在肾小管细胞(293T)中清除过氧化氢图；

图10为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂在肾小管细胞(293T)中清除一氧化氮图；

图11为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂在肾小管细胞(293T)中清除过氧亚硝酸盐图；

图12为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂(Pt NPs-PVP)在不同时间小鼠肾脏光声成像变化图；

图13为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂(Pt NPs-PVP)在不同时间小鼠肾脏计算机断层以及光声成像变化图；

图14为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂不同治疗组小鼠血清中血尿素氮含量图；

图15为本发明具体的实施例中铂纳米酶诊疗剂不同治疗组小鼠血清中血肌酐含量图；

图16为本发明具体的实施例中注射铂纳米酶诊疗剂和磷酸缓冲液(对照)老鼠的体重随时间的变化图。

具体实施方式

本发明提供一种用于急性肾损伤的纳米酶诊疗剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种用于急性肾损伤的纳米酶诊疗剂，其中，包括：贵金属纳米颗粒，结合在所述贵金属纳米颗粒表面的表面配体。

本发明实施例纳米酶诊疗剂包括表面配体以及由所述表面配体保护的贵金属纳米颗粒，该纳米酶诊疗剂具有超小的尺寸，能够有效到达小鼠肾脏，通过清除肾小管内大量的活性氧或活性氮以缓解和治疗急性肾损伤，并且具有计算机断层扫描、光声成像等特性。

在一种实施方式中，所述贵金属纳米颗粒选自铱纳米颗粒、铂纳米颗粒、铑纳米颗粒、钌纳米颗粒等中的一种或多种，但不限于此。

在一种实施方式中，所述表面配体选自聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、柠檬酸、聚乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(F127等)等中的一种或多种，但不限于此。这些表面配体能够有效的稳定纳米颗粒，控制纳米颗粒具有很小的尺寸。并且它们都具有良好的水溶性和生物安全性，不易与血清内蛋白发生作用，有利于纳米颗粒在血液中的循环。

在一种实施方式中，所述贵金属纳米颗粒和所述表面配体的质量比为1:(1-10)(如1：5)。该比例范围内得到的纳米酶诊疗剂具有良好的分散性和稳定性，并且具有很小的尺寸。

在一种实施方式中，所述纳米酶诊疗剂为直径小于5nm的球形颗粒。超小的纳米颗粒有利于到达小鼠肾脏，且超小的纳米颗粒有利于通过肾脏进行代谢。

本发明实施例提供一种如上所述纳米酶诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：将贵金属盐和表面配体混合于多元醇(如乙二醇或其他高沸点醇，如丙三醇等)中，搅拌并加热，加入氢氧化物(如氢氧化钠、氢氧化钾等)溶液进行反应，得到混合溶液；将所述混合溶液加入到水中，分离洗涤，即得到所述纳米酶诊疗剂。

在一种实施方式中，贵金属盐：表面配体：多元醇：氢氧化物＝1：(1-10)：(10-40):(1-10)。

在一种实施方式中，所述多元醇与氢氧化物溶液的体积比为(10-40):1，氢氧化物溶液浓度范围：1-10摩/升。

在一种实施方式中，所述反应的时间为1-4小时(如1小时)。

在一种实施方式中，所述反应的温度为120-150摄氏度。

在一种实施方式中，所述贵金属盐选自铱盐、铂盐、铑盐、钌盐等中的一种或多种，但不限于此。

在一种实施方式中，所述铱盐选自三氯化铱水合物等中的一种或多种，但不限于此。

在一种实施方式中，所述铂盐选自氯铂酸六水合物等中的一种或多种，但不限于此。

在一种实施方式中，所述铑盐选自三氯化铑等中的一种或多种，但不限于此。

在一种实施方式中，所述钌盐选自三氯化钌水合物等中的一种或多种，但不限于此。

一种本发明实施例所述的纳米酶诊疗剂在制备诊断和治疗急性肾损伤制剂中的应用。

一种本发明实施例所述的纳米酶诊疗剂作为计算机断层扫描、光声成像技术的造影剂的应用。

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步地说明。

实施例1：合成铂纳米酶诊疗剂

铂纳米酶诊疗剂合成：如图1所示，将1g克六水氯铂酸加入到90毫摩尔/升聚乙烯吡咯烷酮溶液的乙二醇溶液中，然后搅拌并加热到120℃。滴加NaOH溶液(1摩/升，500微升)引发铂成核还原反应，继续搅拌30分钟。冷却至室温后，超滤离心并用去离子水洗涤数次。黑色产物经冷冻干燥后再溶于水中，用ICP-MS定量。

图1为合成纳米酶诊疗剂的路线图，其中H

图2是合成的铂纳米酶诊疗剂的TEM图；图3是合成的铂纳米酶诊疗剂的XPS图；图2和图3表明铂纳米酶具有超小、均一的尺寸，并且由PVP保护。

实施例2：铂纳米酶诊疗剂清除各种活性氧/活性氮能力、铂纳米酶诊疗剂清除羟基自由基的作用

不同浓度铂纳米酶诊疗剂(0-50μg/mL)清除羟基自由基的效率是通过羟基自由基抗氧化能力(HORAC)试剂盒(Cell Biolabs,Inc.，USA)测定的。测试是按照制造商提供的方案进行的。

如图4所示，铂纳米酶诊疗剂能够有效的清除羟基自由基，并且具有浓度依赖的特性。

不同浓度铂纳米酶诊疗剂(0-20μg/mL)清除超氧阴离子的效率是通过SOD检测试剂盒(Sigma-Aldrich,USA)测定的。测试是按照制造商提供的方案进行的。

如图5所示，铂纳米酶诊疗剂能够有效的清除超氧阴离子，并且具有浓度依赖的特性。

铂纳米酶诊疗剂清除ABTS(2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)自由基的测试

用ABTS自由基阳离子脱色法测定了铂纳米酶诊疗剂的自由基清除能力。ABTS(7mM)溶于水，加入2.45mM过硫酸钾反应12小时，可产生ABTS自由基阳离子(·ABTS

如图6所示，铂纳米酶诊疗剂能够有效的清除自由基，并且具有浓度依赖的特性。

铂纳米酶诊疗剂清除氮自由基(DPPH)

采用DPPH法评价铂纳米酶诊疗剂对活性氮清除活性。将不同浓度的铂纳米酶诊疗剂(0-100μg/mL)与40μM DPPH混合12h后，记录吸收光谱。

如图7所示，铂纳米酶诊疗剂能够有效的清除活性氮DPPH，并且具有浓度依赖的特性。

实施例3：铂纳米酶诊疗剂细胞毒性和通过清除各种活性氧/活性氮保护肾细胞采用标准的MTT法，评价铂纳米酶诊疗剂对293T肾胚胎细胞存活率的影响。

293T细胞以每孔1×10

如图8所示，合成的铂纳米酶诊疗剂对293T肾胚胎细胞的细胞存活率，在浓度达到最大使用浓度400μg/mL时，细胞依然保持80％左右的存活率。表明本发明的铂纳米酶诊疗剂具有较低的细胞毒性。

以铂纳米酶诊疗剂为例，293T细胞提前4小时处理铂纳米酶诊疗剂(100μg/mL)后，加入含2mM过氧化氢的培养基。再分别使用活性氧(图9)、一氧化氮(图10)、过氧亚硝酸盐(图11)探针染色，洗涤之后使用激光共聚焦显微镜进行成像。如图9-11所示，与过氧化氢刺激后的细胞相比，预处理铂纳米酶诊疗剂细胞中的荧光明显减弱，接近于对照组细胞。这说明铂纳米酶诊疗剂能够有效清除细胞中活性氧/活性氮，进而保护细胞。

实施例4：铂纳米酶诊疗剂肾脏蓄积和计算机断层扫描、光声成像所有的实验操作均按照临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度。雌性无胸腺小白鼠(六周,20-25g)，在小白鼠后腿肌肉注射8mL/kg50％的甘油溶液建立老鼠急性肾衰竭模型(RM-AKI)。2小时后，注射铂纳米酶诊疗剂。

在不同的时间点取出小鼠肾脏，使用计算机断层扫描仪和光声成像仪对小鼠肾脏进行成像。如图12-13所示，小鼠肾脏的光声信号(图12)和计算机断层扫描(图13)都有所增强，其中在2小时时信号最强，说明铂纳米酶诊疗剂能够快速的到达小鼠肾脏。

实施例5：纳米酶诊疗剂治疗急性肾损伤和生物安全性评价

所有的实验操作均按照临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度。雌性无胸腺小白鼠(六周,20-25g)，在小白鼠后腿肌肉注射8mL/kg 50％的甘油溶液建立老鼠急性肾衰竭模型(RM-AKI)。2小时后，注射小分子药物氨磷汀(AMF)或者铂纳米酶诊疗剂。

小鼠随机分为6组：(1)健康鼠注射磷酸缓冲液；(2)健康鼠注射铂纳米酶诊疗剂；(3)急性肾衰竭鼠注射磷酸缓冲液；(4)急性肾衰竭鼠注射铂纳米酶诊疗剂；(5)急性肾衰竭鼠注射高剂量氨磷汀(AMF H)；(6)急性肾衰竭鼠注射与铂纳米酶诊疗剂等量的氨磷汀(AMFL),24小时后安乐死小鼠，取小鼠血液离心获得血清，测量肌酐和血尿素氮含量。注射使用磷酸缓冲液为150μL，Pt NPs-PVP为500μg，低剂量AMF为500μg，高剂量AMF为10mg。

如图14-15所示，健康鼠注射铂纳米酶诊疗剂的肌酐和血尿素氮含量没有明显变化。而注射铂纳米酶诊疗剂的急性肾衰竭小鼠肌酐和血尿素氮含量明显低于只注射磷酸缓冲液的小鼠，并接近健康鼠的水平。另一方面，高剂量的氨磷汀注射后也能获得与注射铂纳米酶诊疗剂相似的效果，而同等剂量的氨磷汀并不能有效的降低两个指标。这说明四种铂纳米酶诊疗剂能够有效的缓解和治疗急性肾衰竭，并具有比小分子药物氨磷汀更好的治疗效果。

此外，使用健康鼠注射磷酸缓冲液和铂纳米酶诊疗剂，记录小鼠一个月内的体重变化情况。如图16所示，与对照组相比，注射铂纳米酶诊疗剂的小鼠体重没有明显差异。

综上所述，本发明的纳米酶诊疗剂通过简单的合成方法，可大量制备出尺寸可控、形貌规则、分散性好的超小纳米颗粒，能够有效的清除各类活性氧/活性氮物种，具有广谱的活性氧/活性氮清除能力。并且对293T肾细胞的毒副作用较低，与细胞共培养24或48小时后细胞存活率均接近80％及以上；同时它们可以通过清除细胞内多余的活性氧/活性氮来保护细胞免受过氧化氢刺激。借助纳米酶自身特殊的性质，可以通过计算机断层扫描、光声成像手段来监测纳米酶在小鼠肾脏的有效累积。此外，纳米酶诊疗剂在甘油或顺铂诱导的急性肾衰竭小鼠显示出良好的治疗效果。更重要的是，纳米酶诊疗剂具有良好的生物相容性和生物安全性。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。