肽蛋白激酶C抑制剂及其用途

技术领域

本发明涉及蛋白激酶Cζ类型的新抑制剂及其作为组织渗透剂的用途，特别是在癌症治疗的背景下。

背景技术

紧密连接(TJ)是相邻上皮细胞或内皮细胞之间的复杂结构，调节离子或分子通过细胞旁空间。TJ还通过明确区分顶端和基底外侧来确定细胞分化。TJ由不同的蛋白片段组成，即跨膜蛋白(闭合蛋白、闭锁蛋白、连接黏附分子(JAM)等)，和胞质支架蛋白(ZO-1(闭锁小带-1)、扣带蛋白、afadin、MAGI1(膜相关鸟苷酸激酶)等)。TJ的细胞骨架蛋白是肌动蛋白和微管(Van Itallie等人,2014,Semin.Cell Dev.Biol.36:157-165)。

蛋白激酶C(PKC)是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，其包含调节结构域和催化结构域。PKC与几种细胞功能有关。PKC亚型分类为常规亚型(α、β1、β2、γ)、新亚型(、ε、η、μ、θ)和非典型亚型(ζ、ι/λ)。与常规亚型和新亚型不同，非典型PKC亚型不具有C1结构域(佛波酯/二脂酰甘油结合结构域)，其负责其他PKC亚型的膜定位。已经开发蛋白激酶C同型ζ的肽类抑制剂并描述为对一系列肿瘤、过度增殖性疾病(诸如银屑病)和病毒感染(诸如HIV)有效(WO93/20101)。

几种PKC亚型与TJ的调节有关。非典型蛋白PKCζ是TJ蛋白组装所必需的，并且非典型PKC已被证明与细胞极性有关(Steinberg,2008,Physiol.Rev.,88:1341-1378；Hirai等人,2003,J.Biochem.,133:1-7)。PKCζ和PKCι共有72％的同源氨基酸序列同一性。这包括高度保守的假底物区(Selbie等人,1993,J.Biol.Chem.,268:24296-24302)。假底物(PS)区或PS prototope是调控结构域中存在的序列，负责通过阻断其激酶结构域中存在的底物结合位点来使蛋白激酶保持失活的胞质形式，并且对应于PKCζ氨基酸序列113-126(House等人,1987,Science,238:1726-1728)。

关于TJ的分子结构知识方面的最新进展导致紧密连接调节剂发展。上皮连接开放剂是紧密连接调节剂，可减轻药物吸收不良，这是临床开发中口服候选药物失败的主要原因(Kennedy,1997,Drug Discovery Today,2:436-444；Lipinski,2000,J.Pharmacol.Toxicol.Methods,44:235-249)。用作吸收增强剂的TJ调节剂受狭窄治疗窗和非特异性作用模式影响。TJ的毒性和不可逆性开放是这些药物失败的主要原因(Deli,2009,Biochim.Biophys.Acta,1788:892-910；Yamamoto等人,1996,J.Pharm.Pharmacol.,48:1285-1289；Swenson等人,1994,Pharm.Res.,11:1132-1142)。例如，开发了一种小重组腺病毒血清型3衍生蛋白，称为连接开放剂1(JO-1)，其与上皮连接蛋白桥粒芯蛋白2(DSG2)结合，并且已证明可以提高药物对肿瘤的渗透性，特别是对用于治疗实体瘤的单克隆抗体(mAb)。不幸的是，它也被证明能引起免疫原性(Beyer等人,2011,Cancer Res.,71:7080-7090)。

癌(包括所有亚型)是上皮细胞的恶性转化，占癌症病例的约80％。上皮肿瘤通过细胞间连接紧密连接，限制穿过肿瘤的渗透，特别是大小超过500Da的药物的渗透(Lipinski等人,2001,Adv.DrugDeliv.Rev.,46:3-26；Lavin等人，2007,J.Exp.Biol.,210:2754-2764)。发现许多抗肿瘤药物靶向的受体被隐藏/陷入在抗肿瘤药物无法接近的肿瘤细胞紧密连接之间。这被认为是产生耐药性并因此导致肿瘤复发的重要原因之一(Beyer等人,2011,Cancer Res.,71:7080-7090)。因此，在大多数情况下，抗肿瘤药物因其靶标可及性问题而无效，而不是因为缺乏药物活性。

此外，粘膜组织由于其约400m

因此，需要开发安全、可逆、有效并且理想地具有已知的作用模式的新TJ调节剂。

发明内容

本发明涉及发现新型肽，它们一旦进入细胞，就可作为蛋白激酶Cζ型(PKCζ)的抑制剂，其意外地诱导组织完整性的瞬时下降，这可能表明组织的紧密连接开口。本发明的肽的这种性质可有利地用于诱导瞬时组织渗透，特别是用于增强大治疗分子(诸如用于粘膜疫苗接种的抗体或大分子)的渗透。组织渗透性质还可用于高分子量药物(例如，肽和蛋白药物诸如胰岛素)的跨粘膜递送，避免此类药物的肠胃外施用。此外，在其中治疗剂特别有毒并且需要进入靶细胞的基底外侧的治疗的情况下，例如在抗肿瘤药的情况下，瞬时诱导组织渗透将是有益的。根据另一个方面，本发明的肽可用于眼部递送药物(特别是生物制剂或大分子)，例如作为用于治疗眼部疾病或病症的眼用制剂。

当例如作为佐剂共递送时，本发明的肽可通过增加药物渗透进入组织来提高抗癌药的疗效，并显著改善对粘膜疫苗的免疫应答。

本发明的一个目的是提供新的PKCζ抑制剂，其具有低毒性，可诱导有效且瞬时组织渗透的能力，可用于药物用途。特别地，本发明的目的是提供用于治疗剂的组织渗透增强剂，特别是粘膜渗透增强剂，更特别是鼻渗透增强剂。

本发明的第一方面提供了式(I)/SEQ ID NO.:1的化合物，及其药学上可接受的盐和药学上的活性变体。

本发明的另一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据本发明的化合物。

本发明的另一个方面在于根据本发明的化合物用于预防和/或治疗癌症，特别是上皮癌(carcinoma)的抗癌治疗。

本发明的另一方面在于根据本发明的化合物用于粘膜疫苗接种。

本发明的另一方面在于根据本发明的化合物用于预防和/或治疗阿片类药物使用障碍，特别是阿片类药物用药过量或阿片类药物依赖。

本发明的另一方面在于根据本发明的化合物在制备药物组合物，特别是疫苗组合物中的用途。

本发明的另一方面在于用于增强治疗患有疾病或病症的受试者的疗效的方法，所述方法包括施用根据本发明的化合物或其药物制剂，联合针对所述受试者的所述疾病或病症的治疗有效剂，其中与在不存在本发明化合物的情况下施用时的所述治疗有效剂的组织渗透相比，所述治疗有效剂的组织渗透增强。

本发明的另一方面是用于预防和/或治疗患有上皮癌(carcinoma cancer)的受试者的方法，所述方法包括在有此需要的受试者中施用根据本发明的化合物或其药物制剂联合抗癌治疗。

本发明的另一方面是诱导免疫力的方法，所述方法包括施用粘膜疫苗联合根据本发明的化合物。

本发明的另一方面是用于预防和/或治疗患有阿片类药物使用障碍，特别是阿片类药物用药过量或阿片类药物依赖的受试者的方法，所述方法包括在有此需要的受试者中施用根据本发明的化合物或其药物制剂联合抗阿片类药物。

本发明的另一方面是用于预防和/或治疗患有眼部病症的受试者的方法，所述方法包括在有此需要的受试者中施用根据本发明的肽或其药物制剂联合眼用药剂。

本发明的另一方面是跨粘膜药物递送系统，所述跨粘膜药物递送系统包含有效量的至少一种治疗活性剂和至少一种根据本发明的粘膜渗透增强剂。

本发明的另一方面是眼部递送系统或制剂，所述眼部递送系统或制剂包含有效量的至少一种治疗活性剂和至少一种根据本发明的粘膜渗透增强剂。

参考附图，从权利要求书和/或从以下对本发明实施方式的详细描述，本发明的其他目的和有利方面将变得显而易见。

附图说明

图1显示了在存在本发明的肽(P4)(在检测1和检测2中测量两次)、比较肽(CP4)和对照溶液(在t＝0、20、40、60和80min)的情况下，鼻上皮单层的上皮完整性，如通过实施例10中所述的TEER测量。

图2显示了FITC缀合的胰岛素的渗透，如实施例2中所述，在300分钟的时间内，与穿过鼻上皮单层的对照(载体)和比较肽CP4相比，通过本发明的肽P3和P4诱导的释放进行测量(肽的最终浓度为50μM)。值为平均值±S.D.(n＝3)。

具体实施方式

术语“细胞渗透部分”是指具有跨脂质双层(例如，细胞膜)转运的能力的肽或非肽部分。当细胞渗透部分与另一分子(货物)缀合时，它有助于或增强所述货物分子跨脂质双层(例如，细胞膜)进入细胞或组织以及穿过血脑屏障的有效转运，换句话说，细胞渗透部分充当跨膜载体。

细胞渗透部分可以是脂肪酸部分，并且它可以例如通过酰化，例如通过N-肉豆蔻酰化或棕榈酰化与肽主链共价连接。可以用作根据本发明的细胞渗透部分的脂肪酸的实例包括辛酸(八烷酸(octanoic acid)；C8:0)、癸酸(十烷酸(decanoic acid)；C10:0)、月桂酸(十二烷酸(dodecanoic acid)；C12:0)、肉豆蔻酸(十四烷酸(tetradecanoic acid)；C14:0)、棕榈酸(十六烷酸(hexadecanoic acid)，C16:0)、硬脂酸(十八烷酸(octadecanoicacid)，C18:0)、花生酸(二十烷酸(icosanoic acid)，C20:0)、山萮酸(二十二烷酸(docosanoic acid)，C22:0)、木蜡酸(二十四烷酸(tetracosanoic acid)，C24:0)、蜡酸(二十六烷酸(hexacosanoic acid))。

可选地，在本发明的上下文中，细胞渗透部分可以是与另一细胞渗透部分缀合的脂质细胞渗透部分，诸如在脂质细胞渗透纳米颗粒或阳离子脂质体中，例如在Lipofect

可选地，细胞渗透部分可以是衍生自天然蛋白质的肽序列或通过两个天然序列的融合形成的嵌合肽或经过合理设计的合成肽。肽细胞渗透部分的实例包括但不限于，TAT(HIV转录的反式激活蛋白)、果蝇同源蛋白触角足突变(ANTp、穿膜肽)、W/R、NLS(核定位信号)、AlkCWK

根据特定的方面，细胞渗透部分如Svensen等人,2012,Trends inPharmacological Sciences,33(4):186-192中所述。

根据一个方面，可以使用已知的连接方案通过噻唑烷、硫醚、二硫键或腙键将细胞渗透部分与本发明的肽骨架的其余部分缀合(Bonnet等人，2001，同上)。

可选地，在本发明的上下文中，细胞渗透部分可以包含导向肽(HP)序列，用于特异性地靶向某些细胞(例如，在癌症导向肽的情况下的癌细胞)中的紧密连接。例如，根据本发明的细胞渗透部分可以包含缀合至细胞渗透部分或细胞渗透导向肽(CPHP)的导向肽(HP)序列，例如如Svensen等人,2012,Trends in Pharmacological Sciences,33(4):186-192中所述。

根据另一方面，根据本发明的肽可以例如，在其C端进一步缀合至导向肽。

“导向肽”或HP是指不具有固有内化特性并且仅将其货物递送至特定细胞表面受体的肽，其他HP本身具有细胞渗透特性。

术语“肉豆蔻酰化”是指肉豆蔻酰基通过酰胺键与本发明的肽的氨基酸，特别是N端残基的α-氨基缀合。

术语“治疗分子”或“治疗活性剂”是指用于治疗或预防疾病的分子。在本发明的上下文中，治疗性分子的实例包括但不限于，预防性疫苗中使用的分子(用于获得针对特定疾病或病原体的免疫力的过程中)、治疗性疫苗中使用的分子(例如，用于癌症治疗的疫苗或诱导抗过敏原的耐受性的疫苗)、治疗性抗体(例如，用于癌症治疗的抗体)、低分子量药物(例如，用于癌症治疗的细胞毒性药物或酶抑制剂)和麻醉剂。

术语“蛋白激酶Cζ类型”或“PKCζ”是指蛋白激酶C亚型的类型。

术语“紧密连接”缩写为“TJ”是指相邻上皮细胞或内皮细胞之间的复杂结构，其调节离子或分子通过细胞旁空间。TJ由不同的蛋白片段组成，即跨膜蛋白诸如闭合蛋白、闭锁蛋白、连接黏附分子(JAM)等，和胞质支架蛋白诸如ZO-1、扣带蛋白、afadin、膜相关鸟苷酸激酶(MAGI1)等。本发明的肽对紧密连接的作用可以通过以下方法监测：i)跨上皮电阻(TEER)的测量；ii)细胞旁路标志物(例如，荧光素-葡聚糖)的表观渗透性(Papp)的测定；iii)TJ蛋白的荧光免疫染色，然后成像；iv)TJ蛋白的mRNA和蛋白表达的测定。

本文定义的术语“上皮癌”(carcinoma)是涉及上皮细胞的恶性转化的疾病(包括所有上皮癌的亚型)。术语“上皮癌”(carcinomas)是指疾病，例如但不限于，乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、食管癌、肝细胞癌、卵巢癌、结直肠癌和头颈癌。该术语还涵盖胃癌和其他实体瘤。

如本文所定义，术语“粘膜疫苗”是指在一个或多个粘膜部位施用的疫苗，其导致在施用的粘膜部位、其他粘膜部位和/或全身地诱导免疫应答。粘膜组织包括鼻、口腔、肠、肺、眼、直肠和阴道组织。“鼻疫苗”定义为在鼻的粘膜部位施用的疫苗。

此处定义的术语“眼部或眼疾病”是指影响眼睛的疾病，诸如葡萄膜炎、巩膜炎、角膜炎、雪盲症、Thygeson浅层点状角膜病变、角膜新生血管、角膜内皮营养不良症、干燥性角膜结膜炎、虹膜炎、Sjogren综合征、Wegener肉芽肿病、

术语“阿片类药物使用障碍”表示与阿片类药物的使用有关的临床上显著的损害或痛楚，诸如强烈希望使用阿片类药物、阿片类药物的耐药性增加以及突然停用阿片类药物时出现戒断综合征。特别地，成瘾和依赖性是阿片类药物使用障碍的最严重组成部分。

本文所定义，术语“神经系统疾病或病症”是影响中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统的疾病，并且表示，例如但不限于，神经退行性疾病诸如多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、周围神经病变、帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿舞蹈病，神经精神疾病诸如抑郁症、焦虑症和精神病或与药物滥用相关的疾病诸如阿片类药物、酒精或尼古丁滥用或成瘾的疾病。

根据本发明的治疗的术语“疗效”可以基于对根据本发明的用途或方法应答的疾病病程的变化进行测量。例如，根据本发明的治疗的疗效可以通过其对疾病体征或症状的影响进行测量。当受试者出现部分或全部缓解、或减轻非预期的疾病症状时，将获得应答。根据特定的实施方式，可以通过评估与单独使用的相同分子的效应相比，与本发明的化合物联合使用的治疗分子的效应的增加来测量疗效。例如，可以通过随访对肿瘤大小的效应或通过改善如此治疗的患者组的生存期来监测根据本发明的抗癌治疗的疗效。

可以基于与不使用本发明的肽而施用的治疗相比的治疗副作用的减少来测量根据本发明的治疗的术语“疗效”。

根据本发明的疫苗的术语“疗效”可以基于免疫系统应答的变化进行测量。例如，可以通过其对特定疾病/病原体的获得性免疫的影响来测量根据本发明的疫苗接种的疗效。例如，当受试者获得消除或预防病原体生长的特化的系统性细胞和处理时，可以获得对疫苗接种的应答。

本发明还可用于通过增加过敏原(例如，重组过敏原)的粘膜(例如，口或鼻)渗透来增加过敏性疫苗的疗效(诱导耐受性)。

如本文所用，“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”等通常是指获得预期药理和生理效应。在预防或部分预防疾病、其症状或病状方面，该效应可以是预防性的，和/或对于部分或完全治愈由该疾病引起的疾病、病状、症状或不良反应，该效应可以是治疗性的。

如本文所用，术语“渗透”是指使膜对于存在于膜的一侧上的药剂可渗透的过程。在本发明的上下文中，通过本发明的化合物实现的渗透增强分子跨上皮细胞层的渗透。本发明化合物增加对某些药剂的组织渗透性的能力可以在已知的测定中进行检测，诸如如下所述。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物。例如，本发明预期的哺乳动物包括人、灵长类动物、家养动物，诸如牛、羊、猪、马、实验室啮齿动物等。

术语“D-氨基酸”是指氨基酸的D-立体异构体或氨基酸的“右手”异构体。

在本发明的上下文中，非极性氨基酸可以选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Phe和Pro或其保守取代。

在本发明的上下文中，带正电荷的氨基酸选自Arg、Lys或His或其保守取代。

例如，“保守氨基酸取代”可以包括用非天然残基置换天然氨基酸残基，使得对该位置上氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或完全没有影响。预期的氨基酸取代可在需要这种取代时由本领域技术人员确定。术语“变体”还包括与参考肽序列基本同源的肽或多肽，但是其氨基酸序列与参考序列的氨基酸序列不同，因为一个或多个氨基酸已经被氨基酸类似物化学修饰或取代。例如，可以引入非天然残基来增强基于肽的治疗剂的药理特性(Geurink等人,2013,J.Med.Chem.,56,1262；Rand等人,2012,Med.Chem.Commun,3,1282)。

根据另一特定的实施方式，本发明的肽可以任选地进行C端酰胺化。

术语“药物制剂”是指其形式为允许有效成分的生物活性明确有效的制剂，并且其不包含将对施用所述制剂的受试者有毒的其他组分。

本发明的化合物

根据一个方面，提供了具有下式(I)的总共5至10个氨基酸的肽：

Z-Z1-Xaa

(I)

其中Z是细胞渗透部分；

Z1是式(II)的1至3个氨基酸的任选肽部分：

Xaa1 Xaa2 Xaa3

(II)

其中Xaa

Xaa

R是精氨酸；

Xaa

Xaa

Z2是式(III)的1至2个氨基酸的任选肽部分：

Xaa

(III)

其中Xaa

根据特定的实施方式，提供了式(I)的肽，其中所述细胞渗透部分Z共价附接于该肽的N端。

根据另一特定的实施方式，提供了式(I)的总共5至10个氨基酸的肽，其可以由SEQID NO:1的氨基酸共有序列表示。

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Z1不存在。

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Z2不存在。

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Z1和Z2不存在。

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Xaa

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Xaa

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Xaa

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Xaa

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Xaa

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Xaa

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中Xaa

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个氨基酸是D-氨基酸。

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中五个氨基酸是D-氨基酸。

根据另一其他特定的方面，提供了式(I)的肽，其中所有氨基酸均是D-氨基酸。

根据另一其他的实施方式，提供了下式(Ia)的本发明的肽：

其中Z如本文所述，并且R

根据另一其他的实施方式，提供了下式(IIa)的本发明的肽：

其中Z如本文所述，并且R

根据其他特定的方面，所述细胞渗透部分Z是脂肪酸部分。

根据另一其他特定的方面，脂肪酸部分是肉豆蔻酰基。

在另一其他特定的实施方式中，提供了本发明的肽，所述肽是SEQ ID NO:2的肽(肽P4)。

在另一其他特定的实施方式中，提供了本发明的肽，所述肽是SEQ ID NO:4的肽(肽P3)。

根据一个实施方式，本发明的化合物可以通过合成方法，特别是通过固相肽合成来制备。根据实施方式，可以在移植之前首先根据标准方法单独地制备非商业细胞渗透部分。

根据特定的实施方式，本发明的化合物是蛋白激酶Cζ型(PKCζ)的抑制剂。

根据特定的实施方式，本发明的化合物是瞬时紧密连接开放剂。

组合物

本发明的药物组合物可以包含一种或多种根据本发明的化合物及其药学上可接受的载体、稀释剂或辅料。

根据特定的方面，组合物进一步包含可用于治疗医学病症或可用于疫苗的化合物。

根据特定的方面，本发明的组合物是抗癌组合物。

根据特定的方面，本发明的组合物是抗阿片类药物组合物。

根据特定的方面，本发明的组合物是眼用组合物。

根据特定的方面，本发明的组合物是口服组合物。

根据另一特定的方面，本发明的组合物是疫苗组合物，特别是粘膜疫苗组合物，诸如疫苗组合物。

本发明的组合物可进一步包含至少一种可用于治疗癌症，特别是上皮癌的药剂。

根据另一特定的方面，本发明的组合物可进一步包含至少一种可用于治疗神经系统疾病或病症，特别是神经退行性疾病或神经精神疾病的药剂。

根据另一特定的方面，本发明的组合物可以进一步包含至少一种可用于治疗阿片类药物使用障碍，特别是阿片类药物用药过量或阿片类药物依赖的药剂。

根据另一特定的方面，本发明的组合物可以进一步包含至少一种可用于治疗眼部病症诸如葡萄膜炎的眼用药。

根据另一特定的方面，可用于治疗癌症，特别是上皮癌的药剂选自烷化剂、血管生成抑制剂、抗体(诸如选自例如贝伐珠单抗、达利珠单抗等的抗肿瘤单克隆抗体)、抗代谢物、抗有丝分裂药、抗增殖药、aurora激酶抑制剂、细胞凋亡启动子(例如，Bcl-xL、Bcl-w和Bfl-1)抑制剂、死亡受体通路激活剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞衔接剂)抗体、生物应答调节剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、去甲基化剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫药、插入抗生素的凋亡蛋白抑制剂(IAP)、激酶抑制剂、雷帕霉素抑制剂的哺乳动物靶标、微小RNA的促分裂原激活的细胞外信号-调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎药(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂化疗药物、polo样激酶(Plk)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/三角叶属植物生物碱、小抑制性核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、树突状细胞疗法中使用的药剂或任何其他适合/批准用于癌症治疗的活性物质，例如，WO 2011/156761中列出的那些。特别地，可用于治疗癌症，特别是癌的药剂选自曲妥珠单抗、雷莫芦单抗、多西他赛、盐酸多柔比星、氟尿嘧啶(5-FU)、厄洛替尼片、阿法替尼、吉非替尼、贝伐珠单抗、克唑替尼、塞瑞替尼、西妥昔单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗(pembroluzimab)、甲氨蝶呤和博莱霉素。

根据特定的方面，提供了根据本发明的药物组合物，其中可用于治疗上皮癌的药剂选自蛋白(例如，抗体)、激酶、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、小分子或适合/批准用于癌症治疗的任何其他活性物质。

根据其他特定的实施方式，提供了根据本发明的药物组合物，其包含至少一种本发明的肽和至少吉非替尼。

根据另一其他特定的实施方式，提供了根据本发明的药物组合物，其包含至少一种本发明的肽和至少醋酸布舍瑞林。

根据另一特定的方面，可用于治疗阿片类药物使用障碍的药剂是抗阿片类药物，诸如阿片受体拮抗剂或阿片受体调节剂。

根据另一其他特定的方面，抗阿片类药物选自纳洛酮和丁丙诺啡或其组合。

根据另一特定的方面，可用于治疗神经系统疾病或病症的药剂选自纳曲酮、舒马普坦、佐米曲普坦、尼古丁、咪达唑仑、劳拉西泮、芬太尼、氯胺酮、酮咯酸、布托啡诺、氢吗啡酮。

根据特定的方面，本发明的组合物可以进一步包含选自下组的至少一种药剂：用于预防和/或治疗与使用酒精相关的疾病或病症的药物(例如，纳曲酮)、过敏性休克(诸如肾上腺素(pinephrine)、酚妥拉明或恩他卡朋)、偏头痛(诸如舒马普坦或佐米曲普坦)、常年性和季节性过敏性鼻炎(诸如布地奈德、二丙酸倍氯米松和一水合物(微粉化)、糠酸莫米松、醋酸曲安奈德、丙酸氟替卡松、糠酸氟替卡松、氟替卡松与盐酸氮卓斯汀或色甘酸钠)、尼古丁戒断症状(诸如尼古丁)、低血糖症(诸如胰高血糖素)、癫痫(诸如咪达唑仑或劳拉西泮)或可用于预防和/或治疗子宫内膜异位症(诸如用于卵巢刺激的醋酸那法瑞林)、或用于控制疼痛(诸如芬太尼、氯胺酮、酮咯酸、布托啡诺或氢吗啡酮)。

根据另一方面，本发明的组合物可进一步包含至少一种适合鼻内递送的治疗性肽(诸如醋酸去氨加压素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、干扰素β或Maggio等人,2006,ExpertOpinion on Drug Delivery,3(4):529-539或Lochhead等人,2012,Advanced DrugDelivery Reviews,64:614–628)中列出的那些，特别地，激素及其类似物或衍生物(诸如胰岛素、胰高血糖素、血管加压素)、干扰素(诸如干扰素β)、生物活性肽(诸如生长因子、白介素、酶等)、在中枢神经系统中调节神经递质或神经离子通道功能的化合物或分子(诸如抗抑郁药(安非他酮)、神经递质受体激动剂/拮抗剂、抗癫痫药(托吡酯、唑尼沙胺)等)和任何其他活性剂，例如，US 2008/0299079中列出的那些。

本发明的组合物可进一步包含至少一种可用于疫苗接种，特别是粘膜疫苗接种的药剂，诸如霍乱毒素的重组B亚基和灭活的霍乱弧菌O1(Inaba和Ogawa血清型)、霍乱弧菌O1和霍乱弧菌O139的杀死的全细胞、减毒活轮状病毒p1a(8)、g1-g4或rix 4414型、伤寒沙门氏菌Ty21a减毒活株、减毒活流感病毒、减毒活一价或五价轮状病毒、减毒活三价、二价和一价脊髓灰质炎病毒、减毒活伤寒沙门氏菌，具有或不具有霍乱毒素B亚基(CTB)的灭活霍乱弧菌O1经典型和El Tor生物型(Mevyn等人,2014,Human Vaccines&immunotherapeutics,10(8):2175–2187；Sae-Hae等人,2014,Experimental&Molecular Medicine,46:e85)。

根据其他特定的方面，提供了一种组合物，所述组合物包含至少一种治疗活性剂和至少一种根据本发明的肽，根据本发明的肽的量为基于活性剂的重量0.01％至20％w/v。

根据其他特定的方面，提供了一种组合物，所述组合物包含至少一种治疗活性剂和至少一种根据本发明的肽，根据本发明的肽的量为基于活性剂的重量0.01％至80％w/v。

本发明的组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的额外成分，诸如明矾、稳定剂、抗微生物剂、缓冲剂、着色剂、调味剂、佐剂等。

本发明的组合物还可配制用于肠胃外施用，包括但不限于通过注射或持续输注。注射用制剂可以是在油性或水性溶媒中的混悬液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂。组合物也可以粉末形式提供，其使用合适的溶媒复溶，该溶媒包括但不限于无菌的无热原水。

本发明的组合物可配制用于吸入，其形式可以包括但不限于溶液、混悬液或乳剂，可以干粉形式或使用推进剂(诸如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷)以气雾剂形式施用。

根据特定的实施方式，根据本发明的组合物用于瘤内注射。

根据特定的实施方式，根据本发明的组合物用于粘膜表面递送。根据特定的实施方式，根据本发明的组合物可用于跨肠上皮屏障递送生物制剂或大分子，特别是用于生物制剂(诸如肽、激素和抗体)的口服递送。

在另一特定的方面，根据本发明的组合物适于通过单次或多次施用进行递送。

可选地，本发明的组合物也可以配制成可雾化溶液或可吸入的药学上可接受的组合物。在这种制剂中，根据本发明的化合物被制备成例如，可吸入的干粉或可雾化溶液形式。特别地，适合于鼻递送的组合物可以配制成滴剂(例如，滴眼剂)、喷雾剂、凝胶剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、胶束制剂、脂质体制剂、粉末、微粒和纳米颗粒。

根据特定的实施方式，本发明的组合物是兽医用组合物。

进一步的材料以及制剂加工技术等在Remington的“The Science and Practiceof Pharmacy”，第22版，2012年，University of the Sciences in Philadelphia,Lippincott Williams&Wilkins的第5部分中进行了阐述，该文献通过引用并入本文。

本发明提供了本发明的肽、其组合物和使用其的方法，其可用于治疗医学病症，特别是作为治疗活性物质的组织渗透增强剂，特别是与抗癌剂、抗阿片类药物联合使用或以用于疫苗组合物的佐剂形式。

本发明提供了本发明的肽、其组合物以及使用其的方法，其可用于治疗医学病症，特别是癌或在疫苗接种过程中。

施用方式

本发明的组合物可以任何方式施用或递送，包括但不限于口服、胃肠外、舌下、经皮、跨粘膜、局部、通过吸入、经颊或鼻内施用或其组合。肠胃外施用包括但不限于，肿瘤内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下和肌肉内。

在另一特定的实施方式中，根据本发明的化合物通过注射全身施用。

在另一特定的实施方式中，根据本发明的化合物通过吸入施用。

在另一特定的实施方式中，根据本发明的化合物跨粘膜施用。

在另一特定的实施方式中，根据本发明的化合物鼻内施用。

在另一特定的实施方式中，根据本发明的化合物瘤内施用。

在另一特定的实施方式中，根据本发明的化合物局部施用，特别是施用于眼睛。

在另一特定的实施方式中，根据本发明的化合物口服施用。

在一个具体的实施方式中，根据本发明的方法是向受试者的肺部肿瘤施用根据本发明的化合物的方法，包括支气管镜引导的瘤内注射本发明的化合物或其组合物。

向个体施用的剂量(以单次或多次给药形式)取决于多种因素而变化，包括药代动力学特性、受试者的状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况和体型)、症状程度、并行联合治疗、治疗频率和预期效应。

联合用药

根据一个方面，本发明的化合物将与至少一种可用于预防和/或治疗疾病的治疗性分子联合施用。

根据一个方面，本发明的化合物将与至少一种可用于预防和/或治疗癌症，特别是上皮癌的治疗性分子联合施用。

根据一个方面，本发明的化合物将与可用于疫苗接种，特别是粘膜疫苗接种的治疗性分子联合施用。

根据另一方面，本发明的化合物将与至少一种可用于预防和/或治疗神经系统疾病或病症，特别是神经退行性疾病或神经精神疾病的治疗性分子联合施用。

根据另一方面，本发明的化合物将与至少一种可用于预防和/或治疗阿片类药物使用障碍，特别是适合鼻内递送的抗阿片类药物的治疗性分子联合施用。

根据另一方面，本发明的化合物将与至少一种可用于治疗神经系统疾病或病症，特别是神经退行性疾病或神经精神疾病，并适于鼻内递送的药剂组合施用。例如，本发明的化合物用于增强经鼻内递送通过血脑屏障(BBB)的那些药剂的递送。

本发明涵盖本发明化合物的施用，其中该化合物在治疗方案或至少一种助剂(co-agent)之前、同时或序贯施用给受试者。与所述至少一种助剂同时施用的根据本发明的化合物可以在相同或不同的组合物中以及以相同或不同的施用途径施用。

根据一个方面，本发明的化合物可以与至少一种可用于治疗肺癌的治疗性分子同时，任选地在相同的组合物中同时施用。

根据其他特定的方面，本发明的化合物可以通过支气管镜检引导瘤内施用。

在其他特定的实施方式中，根据本发明的化合物经局部施用用于治疗眼部疾病或病症，诸如葡萄膜炎。

根据本发明的化合物可以与至少一种疫苗组合物同时，任选地在相同的组合物中同时施用。

根据另一方面，本发明的化合物可以与至少一种可用于预防和/或治疗阿片类药物使用障碍，特别是一种或多种适合鼻内递送的抗阿片类药物的治疗性分子联合使用，任选地在相同的组合物中同时施用。

患者

在实施方式中，根据本发明的受试者患有上皮癌或具有患上皮癌的风险。

在其他实施方式中，根据本发明的受试者患有癌症或具有患有癌症的风险，该癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、食管癌、肝细胞癌、卵巢癌、结肠直肠癌和头颈癌及其他实体瘤。

在其他实施方式中，根据本发明的受试者患有肺癌或具有患肺癌的风险。

在其他实施方式中，根据本发明的受试者患有胃癌或具有患胃癌的风险。

在其他实施方式中，根据本发明的受试者患有神经系统的疾病或病症，特别是神经退行性疾病或神经精神疾病，或具有患神经系统的疾病或病症，特别是神经退行性疾病或神经精神疾病的风险。

在其他实施方式中，根据本发明的受试者患有阿片类药物使用障碍或具有患阿片类药物使用障碍的风险。

在其他实施方式中，根据本发明的受试者患有眼部病症诸如葡萄膜炎或具有患眼部病症诸如葡萄膜炎的风险。

在另一实施方式中，对根据本发明的受试者进行粘膜疫苗接种，诸如例如抗流感病毒、轮状病毒、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌或脊髓灰质炎病毒感染的疫苗接种。

根据本发明的用途

根据本发明的化合物可用于增强治疗性分子的作用，特别是用于预防和/或治疗任何疾病的那些治疗性分子，特别是用于预防和/或治疗癌症(例如，上皮癌)或阿片类药物使用障碍或疫苗接种中使用的那些治疗性分子。

根据另一方面，鉴于药剂穿过血脑屏障(BBB)、跨皮肤递送，或鉴于改善局部麻醉，改善麻醉剂穿过组织的扩散，可以使用根据本发明的化合物。

根据特定的方面，本发明的肽相对于已知的PKCζ假底物具有多种优势，其中一些被用作用于研究PKCζ在紧密连接调节中的作用的工具，并被描述为能够破坏小鼠回肠中的紧密连接(Jain等人,2011,Biochem J.,437(2),289-299)，但不建议用作渗透剂，甚至不建议与治疗性或疫苗大分子联合使用以增强其疗效。本发明的另一方面在于用于增强治疗患有疾病或病症的受试者的疗效的方法，所述方法包括施用根据本发明的化合物或其药物制剂联合针对所述受试者的所述疾病或病症的治疗有效剂，其中与在不存在本发明化合物的情况下施用时的所述治疗有效剂的组织渗透相比，所述治疗有效剂的组织渗透增强。

本文引用的参考文献通过引用以其全部内容并入本文。本发明不限于本文所述的具体实施方式的范围内，本文中所述的具体实施方式旨在作为本发明各个方面的单一说明，并且功能上等效的方法和组成也在本发明的范围内。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，如前所述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。已对本发明进行描述，以下实施例仅是举例说明而不是限制。

实施例

以下缩写分别是指以下定义：

BSA(牛血清白蛋白)；Caco-2(人肠上皮细胞)；CTRL(对照)；DIEA(N,N-二异丙基乙胺)；DCM(二氯甲烷)；DMF(N,N-二甲基甲酰胺)；EDT(乙二硫醇)；EGFR(表皮生长因子受体)；FD(荧光素缀合的葡聚糖)；Fmoc(9-芴基甲氧羰基)；HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)；HOBT(羟基苯并三唑)；i.n.(鼻内)；myr(肉豆蔻酰基)；NSCLC(非小细胞肺癌)；OCA_EGFR19del(带有携带EGFR ex19:del突变的肿瘤的细胞培养)；Ova(卵白蛋白)；P

实施例1：根据本发明的化合物的合成

通过固相肽合成制备本发明的化合物。作为说明，肽P4(SEQ ID NO:2)的合成步骤提供如下：

步骤1-将反应容器用二氯甲烷(DCM)洗涤，并用氮气吹入底部，然后将其完全排干。

步骤2-树脂溶胀：将2-氯三苯甲基氯树脂称重到反应容器中，然后将树脂用二甲基甲酰胺(DMF；15ml/g)溶胀30min。

步骤3-从肽的C端偶联第一D-氨基酸：将1.6g的Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH称重到试管中，并将Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)-氨基酸溶解在DMF/DCM(Sigma-Aldrich)(1:1)(15ml/g)中。将溶液转移至上述反应容器中，添加10倍DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，并在室温下与氮气混合30min。

步骤4-阻断树脂的活性位点：将5mL的甲醇添加到反应容器中并底部吹扫10min。将反应容器排干并用DMF(3×)、DCM(3×)和DMF(3×)洗涤。

步骤5-脱保护：将反应容器排干，然后加入20％的哌啶(15ml/g)以除去Fmoc保护基。将混合物底部吹扫10min×1和5min×1。然后将反应容器用DMF(3×)、DCM(3×)、DMF(3×)洗涤。

步骤6-偶联监测：取树脂样品，加入2滴的25％的茚三酮-醇溶液和1滴的20％的酚-醇溶液，然后加入1滴的吡啶，然后将样品在105℃下加热5min，颜色变为深蓝色表示阳性反应，且没有颜色变化表示没有反应。

步骤7-缩合：3倍过量的受保护氨基酸、5g的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、HOBT(羟基苯并三唑)(1g)和DIEA(2ml)加入DMF中使其溶解，然后加入DCM(15ml/g)，并使混合物反应1小时。

步骤8-洗涤：将反应容器用DCM(15ml/g)和DMF(15ml/g)交替洗涤3次。

步骤9-监测：与步骤6相同。

步骤10-偶联剩余的D-氨基酸：重复步骤5-9以偶联其他氨基酸。

步骤11-在肽N端连接myr基。

步骤12-洗涤：在最后一个氨基酸(N端的第一个氨基酸)偶联并依次用以下试剂脱保护后，洗涤树脂：2次DMF(10ml/g)、2次甲醇(10ml/g)、2次DMF(10ml/g)、2次DCM(10ml/g)，然后抽干10min。

步骤13-裂解：用以下试剂进行裂解：TFA 94.5％(三氟乙酸)、水2.5％、EDT 2.5％(乙二硫醇)、TIS 1％(三异丙基硅烷)。裂解时间为2小时。

步骤14-吹干并洗涤：将裂解溶液尽可能用氮气吹干，并用无水乙醚洗涤6次，并在空气中干燥。

步骤15-通过HPLC(高效液相色谱法)纯化。通过冷冻干燥将纯化的溶液干燥，得到白色粉末形式产物。

HPLC纯化

将粗肽溶解在纯净水中，并在以下条件下纯化用纯净水溶解粗肽。纯化条件如下：

泵A：100％水中的0.1％三氟乙酸0.1％TFA-100％水溶液

泵B：100％乙腈中的0.1％三氟乙酸0.1％TFA-100％ACN溶液

制备柱：Venusi MRC-ODS C18 30 x 250mm

制备柱：Venusi MRC-ODS C18 30 x 250mm

总流速：1.0ml/min流速：1.0ml/min

装载体积：3ml取样体积：3ml

检测波长：220nm检测波：220nm

本发明的其他肽的合成可以通过使用不同或另外的氨基酸以产生SEQ ID NO:1的肽的类似方式进行制备。可以通过技术人员已知的标准方法来实现细胞渗透部分的接枝，诸如在肽细胞渗透部分的情况下的固相合成或如本说明书中所述。

本发明的化合物也可以通过化学选择性连接合成进行制备(Bonnet等人，2001，同上)。

实施例2：各种长度的肽增加对大分子的膜渗透性的影响

为了评估本发明的肽对治疗性分子的渗透作用的潜在作用，FITC胰岛素(Sigma-Aldrich,Buchs SG,Switzerland)被用作评估跨上皮单层的细胞旁路药物转运(顶端到基底外侧)的模型。

为了确保在实验过程中保持单层的完整性，如下所述，在这些研究之前和之后测量跨上皮电阻(TEER)。

使用Mucilair

在每个实验之前，将培养基从每个室中移出，并将单层用200μl的生理盐水(0.9％)洗涤一次，并用温热的Hank平衡盐溶液(HBSS)(37℃)洗涤一次。在基底外侧室中，放置600μL的预热的HBSS，并将细胞放回到37℃下的培养箱中30分钟以使其平衡。在平衡后，将本发明的肽和细胞旁路标志物(FITC胰岛素)施加于上皮细胞单层的顶侧。与比较肽CP4(SEQ ID NO:3)比较，检测根据本发明的肽P4(SEQ ID NO:2)和P3(SEQ ID NO:4)。

所有肽以50μM的最终浓度使用。将溶媒用作对照(CTRL)。将FD溶液添加到顶端室中以使最终体积为200μl。在150分钟的时间内，每30分钟从每个孔的基底室中取100μL样品，并用等量的新鲜温热缓冲液替换每个体积，以保持漏槽状态。使用荧光酶标仪(BioTekSynergy Mx酶标仪，BioTek Instruments GmbH,Lucerne,Switzerland)在黑色96孔板中测量FD的荧光，分别使用485和520nm的激发和发射波长。累积释放量(ng)对应于实际累积释放的药物量，并且对应于任何时间混悬培养基中的量加上每次采样过程中损失的药物量。

如图2所示，与对照相比，比较肽CP4稍微增加了细胞旁路标志物胰岛素FITC的渗透。出乎意料的是，与对照肽CP4相比，发明P3&P4的D-氨基酸肽在更大程度上增加胰岛素FITC的渗透作用。

跨上皮电阻(TEER)：在将200μl的培养基添加到组织培养物的顶端室后，使用EVOMX伏特计(World Precision Instruments UK,Stevenage)在每个时间点重复三次测量整个培养物的电阻。通过使用以下公式对TEER值(Ω)进行归一化转换：TEER(Ωcm

实施例3：膜渗透基团的作用

为了评估本发明的肽中的膜渗透基团(肉豆蔻酰基)在增强大分子通过上皮细胞层的渗透性中的作用，将本发明的肽P4(SEQ ID NO:2)的渗透能力与对应于没有肉豆蔻酰基的相同肽的比较肽进行比较。如实施例2中所述进行摄取实验和TEER。

实施例4：细胞旁路渗透性时间框架

为了评估本发明的肽的渗透作用的持续时间，如下评估各种长度的肽的表观渗透性。表观渗透性是指在收集样品时的时间点释放的FD的量。在本实例中，它间接表示紧密连接细胞旁路空间的逐渐关闭，因为释放的FD的量逐渐减少，如在30或60分钟的时间点所见。

检测的肽，摄取实验和TEER如实施例2中所述。

FD的表观渗透性：使用公式1计算FD的表观渗透性(P

假设，由于该肽对应于PKC假底物，它们可能是竞争性底物，因此，假底物序列的长度越高，对PKCζ的抑制作用越高，因此大分子的细胞旁路渗透性增加也越高。因此，本发明的肽具有优化的长度，这允许实现大分子的期望的细胞旁路渗透性，同时呈现该作用的更高的可逆性，这对于避免细胞毒性是期望的(PKCζ抑制的时间越长，潜在地导致TJ蛋白的分解增加并影响细胞增殖)(Suzuki等人,2002,J.Cell Sci.,115:3565-3573；Whyte等人,2010,J.CellSci.,123:3316-3328)。

实施例5：PKCζPS肽对细胞活力的影响

本发明的肽与比较肽相比的潜在毒性的评估以细胞活力测定进行如下。

使用基于WST-1的比色测定法通过细胞增殖测定法确定Caco-2细胞(人肠上皮细胞系)的活力。将Caco-2细胞(5*10

实施例6：本发明的肽对紧密连接蛋白闭锁蛋白和ZO-1的重新分布的影响

如下通过共聚焦显微镜评估本发明的肽对人原代鼻和支气管上皮细胞的紧密连接结构的影响。

将Mucilair

实施例7：包含本发明的肽的联合治疗的效应

在非小细胞肺癌模型中研究了本发明的肽与已知作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶结构域(EGFR-TK)的选择性抑制剂的蛋白激酶抑制剂抗肿瘤药吉非替尼(N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺)联合使用的效应如下。

吉非替尼是一种细胞毒性小分子，于2003年首次获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，作为治疗非小细胞肺癌(NSCLC)，最常见的肺癌类型的三线治疗，最近作为一线治疗(2015年7月)。与对治疗产生耐药性之前的化学疗法相比，已证实吉非替尼可显著改善无进展生存期(PFS＝7.7-12.9个月)。在临床上，吉非替尼的常规剂量为250mg/天，而体外吉非替尼具有微摩尔(μM)抑制浓度。

使用在EGFR(表皮生长因子受体)的酪氨酸激酶结构域中突变的HCC827细胞(肺腺癌)(型号为OncoCilAir

使用Zeiss Axiocam显微镜平台通过荧光显微镜解析肿瘤形态测量学。生长曲线基于每2天获取的各种图像，并使用Image-Pro Plus软件(MediaCybernetics,Rockville,MD,USA)测量绿色荧光蛋白阳性(GFP

实施例8：本发明的肽对抗原特异性血清IgG和IgG1应答的佐剂效应

通过施用P4联合可溶性蛋白抗原研究本发明的肽对粘膜疫苗疗效的效应，并且已研究诱导的免疫。

6周龄雌性C57-BL/6小鼠购自查尔斯河实验室(Harlan,France)，并按照动物伦理委员会的相应准则在标准条件下饲养。在第0、14和28天在麻醉下通过鼻内(i.n.)施用对小鼠(n＝5)进行使用以下免疫原的免疫：生理盐水(PBS)作为阴性对照品、混合物形式的卵清蛋白(Ova)(在NaCl 0.9％溶液中)或Ova+P4 Ova/剂量(5μg)(Ova的NaCl 0.9％溶液和P4的NaCl 0.9％溶液的混合物)以12μL(每个鼻孔6μL)施用给每个动物组。P4以浓度为5μg/剂量使用。在第一次免疫前一天和最后一次免疫后一周采集血液样品。

抗原特异性血清抗体(IgG总和IgG1)通过ELISA(酶联免疫吸附测定)进行测量。简言之，将96孔板在4℃下每孔用Ova抗原(100ng)包被过夜。将板用100μl的DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液)加3％BSA(Sigma-Aldrich,Germany)在37℃下封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤4次，然后在37℃下与100μl连续稀释的血清样品一起孵育(对于IgG和IgG1为1:50至1:819200)1.5h。在洗涤4次后，将板与100μl的1:8000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗小鼠IgG总和IgG1(Southern Biotech,France)抗体孵育1小时。将板洗涤4次，并通过添加100μl的TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)底物(Pierce Protein Research Products；Rockford,IL)定量HRP。在减去原始背景后，在光密度-对数稀释曲线的中点确定抗体效价，对无应答的小鼠给予10的任意效价。

实施例9：本发明的肽联合抗阿片类药物的鼻内递送

如下研究鼻内递送单独的或与抗阿片类药物纳洛酮联合的本发明的肽的体内效应。

将雌性Wistar大鼠(体重225-250g)用氯胺酮和甲苯噻嗪的组合麻醉，并将插管插入颈动脉。将插管插入三通阀，通过三通阀对血液进行采样，并用含肝素的生理盐水代替。单独的或与本发明的肽联合的纳洛酮，通过插入大鼠鼻孔8mm的微量移液器尖端鼻内施用。在纳洛酮施用前和施用后5、15、30、60和120分钟收集血液样品。将血液的每个样品(0.5ml)收集到肝素化的1ml注射器中，然后转移到含有10μl的肝素(500U/ml)的冷冻的1.5ml聚丙烯试管中。将试管在2-8℃下以约3,000rpm离心20分钟，然后将血浆上清液转移至储存在-200℃下的微量离心管中。测定血浆中纳洛酮的浓度和曲线下面积。通过使用HPLC(高效液相色谱)或LC-MS/MS(液相色谱-质谱)测定C

实施例10：本发明的肽对上皮完整性的效应

为了评估本发明的肽对上皮完整性的潜在效应，测量在本发明的肽存在下的跨上皮电阻。

如实施例2中测量跨上皮电阻(TEER)，不同之处在于伏特计配备有STX-2筷式电极(WPI,Sarasota,FL,USA)。如在实施例2中，使用Mucilair

上皮电阻是上皮完整性的量度，并且可以指示通过检测的药理学药剂(本发明的肽)对上皮紧密连接的调节，其中TEER值的降低表明紧密连接之间的细胞旁路空间增加，因此可能增加药物和治疗性大分子的运输。

与对照溶液和比较肽P4(CP4)相比，在t＝20min时肽P4降低TEER值，并且该效应在t＝40min和t＝60min时持续存在(图1)。与在先前时间点测得的值相比，在t＝80min时，TEER值增加(图1)。

这些结果支持本发明的肽可以增加上皮紧密连接开口(紧密连接之间的细胞旁路空间的增加)，并进而这可以允许其他分子的递送。观察到的瞬时效应表明那些肽将能够诱导紧密连接的瞬时开口。

SEQ ID NO:1(共有序列)/式(I)

Z-[Xaa1 Xaa2 Xaa3]

(I)

其中Z是细胞渗透部分；Xaa

SEQ ID NO:2(P4)

Myr-D-Ala D-Lys D-Arg D-Trp D-Arg

SEQ ID NO:3(比较肽CP4)

Myr-AKRWR

SEQ ID NO:4(P3)

Myr-D-Ala D-Arg D-Arg D-Trp D-Arg

序列表

<110> 日内瓦大学

<120> 肽蛋白激酶C抑制剂及其用途

<130> P2249PC00

<150> EP18177281.5

<151> 2018-06-12

<160> 4

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 与N端氨基酸的基团共价连接的细胞渗透部分

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是任选的肽序列 Xaa1 Xaa2 Xaa3 其中Xaa1

和Xaa2可以存在或不存在，并且当存在时， Xaa1和

Xaa2独立地为带正电荷的氨基酸；Xaa3是

非极性氨基酸。

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是选自Ala、Ser 和 Val的氨基酸。

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是带正电荷的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是非极性氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是带正电荷的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa 是任选的肽部分[Xaa9 Xaa10] 其中Xaa9是

带正电荷的氨基酸且Xaa10可以存在或不存在

并且当存在时，Xaa10是非极性氨基酸，其中

SEQ ID NO: 1中的至少一个氨基酸是D-氨基酸。

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 与N端氨基酸的氨基共价连接的肉豆蔻酰基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> D-Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> D-Arg

<400> 2

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 比较肽P4

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 与N端氨基酸的氨基共价连接的肉豆蔻酰基

<400> 3

Ala Lys Arg Trp Arg

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> 与N端氨基酸的氨基共价连接的肉豆蔻酰基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> D-Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> D-Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> D-Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> D-Arg

<400> 4

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5