稳定化的透明质酸

本发明涉及包含交联透明质酸的无菌水凝胶组合物和用于作为软组织填充物的该组合物。

背景技术

透明质酸(Hyaluronan，缩写为HA，也称为hyaluronic acid)是天然存在的具有由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺构成的重复二糖单元的多糖。术语透明质酸(hyaluronan或hyaluronic acid)通常与其盐(例如透明质酸钠)同义地使用。

高分子量的透明质酸天然存在于皮肤中，并以其粘弹性特性和非常高的吸水性而著称。其性质在很大程度上促进了皮肤的弹性。鉴于其性质及其生物相容、耐受和无毒的特性，已经在医学和美容领域，特别是在美容手术的许多应用中利用该化合物的优点超过10年。例如，透明质酸被用于通过直接注射到所考虑区域的真皮中来填充皱纹(用作皮肤填充物)。

生物发酵来源的高度纯化的未修饰的透明质酸具有极好的生物相容性，并且与内源性透明质酸相同。然而，透明质酸尽管具有与人体组织高度相容、与水具有高亲和力并且发挥强力保湿功能的优点，但是其不具有足够的生物力学性质。当将透明质酸注射到皮肤组织中时，其通过人体组织中存在的透明质酸酶(酶降解)和自由基(化学降解)在体内迅速降解。

已经提出了许多解决方案来减慢透明质酸在体内的降解并改变其化学、物理和生物学性质，另外提供制剂对储存过程中的降解、对热以及因此对灭菌的提高的抗性。

这些方法通常涉及透明质酸的化学修饰，包括例如通过化学、酶促或光化学方法使透明质酸交联。这些交联透明质酸凝胶可以通过多种制备方法获得。通常，这些方法需要两个主要步骤，第一步由使透明质酸水合以使其转化为水溶液组成，并且第二步旨在在能够诱导其交联的试剂(也称为“交联剂”)的存在下使所述水溶液的透明质酸分子交联。交联剂的实例包括甲醛、二乙烯基砜、双碳二亚胺和环氧化物。其它解决方案包括用诸如多肽的大基团对透明质酸进行修饰，以诱导细胞附着或自组装成水凝胶。

为了生产皮肤填充物，交联剂最通常选自环氧化物如丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)或1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、醛、或聚乙烯基砜如二乙烯基砜(DVS)，因此本质上是合成的。

遗憾的是，透明质酸的化学修饰会导致利用天然具有低免疫原性并且没有毒性的未修饰的透明质酸时未观察到的副作用和异物反应。在大多数市售的透明质酸软组织填充物中，BDDE被用作交联剂。由于BDDE中存在的环氧基的反应性质，软组织填充物中残留的未反应BDDE可能具有遗传毒性作用。因此，必须将皮肤填充物中的BDDE保持在痕量(<百万分之2)，因此在生产过程中需要昂贵的额外纯化和测试程序。尽管BDDE交联填充物的安全性特性得到了长期临床经验的支持(De Boulle,Glogau等人,2013,A review of themetabolism of 1,4-butanediol diglycidyl ether-crosslinked hyaluronic acidsoft tissue fillers,Dermatol Surg(39):1758-1766)，BDDE仍可能引起一些安全性担忧(Choi,Yoo等人,2015,Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acidhydrogels by crosslinking agents,J Biomed Mater Res Part A(103A):3072-3080)。

由于与BDDE相关的遗传毒性风险，可能对患者终生施用的市售皮肤填充物产品(例如

化学修饰的另一个问题是透明质酸在交联反应中为了实现期望的交联度而必须经历的必要的严苛反应条件，例如碱性pH值和高温(高于50℃)。已知由于在暴露于酸性(pH低于4)或碱性pH(pH高于10)期间的水解降解，透明质酸的分子量降低。此外，透明质酸在高于40℃的较高温度下降解(Troncoso等人,2016,A kinetic study of the degradationof Hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide,学生论文,通过http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXT01.pdf在线访问；Stern等人,2007.The many ways to cleave hyaluronan,Biotechnology Advances(25):537-557；Tokita和Okamoto,1996,Degradation of hyaluronic acid–kinetic study andthermodynamics,Eur.Polym.J.(32):1011-1014)。还已知分子量小于200kDa的低分子量透明质酸片段具有促炎作用(Naor,2016,Editorial:Interaction Between HyaluronicAcid and Its Receptors(CD44,RHAMM)Regulates the Activity of Inflammation andCancer,Frontiers in immunology 7:39；Monslow等人,2015,Hyaluronan–a functionaland structural sweet spot in the tissue microenvironment,Frontiers inimmunology 6:231)。

尽管WO 2014/064632描述了具有使用内源性接头分子稳定的透明质酸的软组织填充物，但是交联过程需要非内源性化学物质来激活透明质酸(在申请中被描述为伪天然交联)。尽管多胺是在所有生物中以相对较高的浓度发现的内源性分子，但是发现这些试剂在过量存在时会显示出令人惊讶的毒性程度(参见Hoet&Nemery,Am.J.Physiol.LungCell.Mol.Physiol.；278,L417-L433(2000))。

WO 2013/086024描述了包含使用二胺交联剂(例如六亚甲基二胺)和多胺交联剂(例如3-[3-(3-氨基-丙氧基)-2,2-双(3-氨基-丙氧基甲基)-丙氧基]-丙胺)交联的透明质酸的软组织填充物。说明书中未提及使用内源性接头分子。交联被描述为优选在pH 4至pH7和20℃至37℃范围的温度下的温和条件下进行。然而，在实施例中，制备花费了数天，并且作为起始材料的是低分子量透明质酸(例如，分子量为约例如100kDa或平均分子量为例如310kDa的聚合物)。因此，不能阻止低分子量HA片段的形成。WO 2013/086024的重点是优化填充物产品的流变行为，而不是提高生物相容性。

WO 2014/181147A1和WO 2016/005785A1描述了具有使用三偏磷酸盐交联的稳定HA的皮肤填充物，其产生了由内源性二磷酸基团交联的HA分子。但是，在交联过程中，透明质酸暴露于明显的碱性pH(pH 11)，在50℃的高温下3小时，并且甚至在高至70℃下72小时。在这些严苛条件下，低分子量HA片段的形成是不可避免的(Troncoso等人,2016,A kineticstudy of the degradation of hyaluronic acid at high concentrations of sodiumhydroxide,学生论文；通过http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXT01.pdf在线访问；Stern等人,2007.The many ways to cleave hyaluronan,Biotechnology Advances(25):537-557；Tokita and Okamoto,1996,Degradation ofhyaluronic acid–kinetic study and thermodynamics,Eur.Polym.J.(32):1011-1014)。当这些低分子量HA片段在人皮肤中的生物降解过程中从凝胶储库中释放出来时，其可引起炎症反应。

因此，仍然需要提供与软组织具有高生物相容性但比天然透明质酸更抗降解的包含稳定的透明质酸的组合物，例如可用作软组织填充物。

因此，本发明的目的是提供具有高生物相容性和高抗降解性的组合物。

发明内容

本发明提供了包含交联透明质酸的无菌水凝胶组合物，其中相对于透明质酸的总量，分子量小于200kDa的可提取的透明质酸的量小于15重量％。

该无菌组合物是可以作为软组织填充物植入或注射的水凝胶。低分子量透明质酸的低含量确保了良好的生物相容性，并且交联阻止了透明质酸在体内的快速降解。

在优选的实施方案中，所述交联透明质酸具有根据式I的结构：

HA-L-HA(I)，

其中每个HA代表根据式II的透明质酸或其盐

其中n是大于1的整数，并且决定了式II的重复单元的重复数，

并且L是接头，该接头通过替换根据式II的重复单元中的一个OH部分与每个HA共价键合，并且

其中L衍生自分子LH

交联透明质酸包含根据式III的亚结构

其中L衍生自分子LH

应当理解，交联透明质酸是复杂的聚合物，并且式I至III将被理解为示意性的。交联透明质酸中的任何透明质酸(HA)可以通过接头L的连接而具有多种修饰，即式I不限制任何HA链仅可以包含一个接头。交联透明质酸可包含多于两条HA链。包含多个重复单元的每条HA链可包含待与第二HA连接的一个修饰单元，或在HA链的随机位置的与相同第二链或与其它HA链连接的多个修饰单元。

在优选的实施方案中，交联透明质酸中0.5至10摩尔％的重复单元有助于交联，例如与接头L形成共价键。换言之，所交联单元的程度可以为0.5至10摩尔％。

在优选的实施方案中，交联透明质酸是修饰的透明质酸的反应产物，其中该修饰的透明质酸被提供交联反应性基团(例如巯基)的内源性分子修饰。在该实施方案中，修饰的透明质酸的修饰度优选在约3摩尔％至约10摩尔％的范围内。10摩尔％的修饰度上限允许保持透明质酸的积极特性(例如生物相容性、溶胀行为)。约3摩尔％的修饰度下限被认为对于形成稳定的和高粘度的凝胶是必要的。因此，交联透明质酸中的所交联单元的程度优选为3至10摩尔％。

接头L衍生自人中天然存在的分子LH

在一个实施方案中，分子LH

在一个实施方案中，接头L包含分子的片段或衍生自分子LH

在另外的实施方案中，内源性分子LH

该组合物的特征还在于，透明质酸的分子量(MW)分布表明，相对于透明质酸的总量，分子量小于200kDa的可提取的透明质酸的量小于15重量％。

理解的是，透明质酸的分子量是在非交联状态下测定的。实际上，包含交联透明质酸的水凝胶组合物通常包含一定量的游离(即非交联)透明质酸。在许多水凝胶中，游离透明质酸被主动添加作为组合物的一部分。另一方面，游离透明质酸可以在制备水凝胶的过程中保持未交联，或者可以在获得无菌水凝胶的过程中在透明质酸链降解时游离释放。

可以应用不同的方法来验证包含交联透明质酸的组合物中可提取的透明质酸的分子量分布。在优选的实施方案中，可提取的透明质酸可通过还原提取(reductiveextraction)或通过保守提取(conservative extraction)来确定。

利用还原提取，通过在逆转连接(即，通过还原例如二硫化物交联的透明质酸)之后提取游离透明质酸来分析待研究的组合物(实施例3)。该方法包括接头的裂解，其导致透明质酸网络转化为粘性透明质酸溶液。尽管该方法容易地适合用于其中在氧化时发生交联的水凝胶，但是该方法可能不适合用于一些交联剂，即BDDE-交联的透明质酸。用于转化的反应条件(即还原条件)可导致低分子量HA的进一步积累。因此，利用这种方法，分子量小于200kDa的游离透明质酸的量通常更高。

利用保守提取，可以在不操纵交联透明质酸网络的情况下研究游离透明质酸(实施例6)。该方法可独立于交联剂应用。将水凝胶与溶剂系统一起孵育并摇动。因此，游离透明质酸泄漏到液相中，而交联HA保留在凝胶相中。分离液体上清液相并分析分子量分布。

在一些情况下，可以替代地研究类似于待研究的组合物制备但没有交联的比较组合物中的透明质酸的分子量分布(参见实施例3)。但是，这种方法需要对水凝胶的生产过程有详细的了解。

针对透明质酸指示的分子量(MW)通常代表群体中所有分子的平均值。在文献中，MW通常表示为重均分子量。尽管如此，可以研究透明质酸样品(例如如上所述提取的游离透明质酸)的MW分布，并且确定例如MW<200kDa的透明质酸的实际量或分数。

可以通过以下示例的尺寸排阻色谱(SEC)分析来研究MW分布。本领域技术人员将认识到，其它方法可以获得分子量分布的可比较值。例如，琼脂糖凝胶电泳可用于使用水平凝胶室和作为标准品的HA分子量梯状物在琼脂糖凝胶中分离透明质酸的不同MW级分，其中然后例如使用Image J软件包(http://imagej.net/Welcome)对染色的凝胶进行光密度分析，然后根据Cowman等人(Analytical Biochemistry 417,2011,第50-56页)计算分子量。随后，可以确定MW<200kDa的透明质酸的量。在根据本发明的水凝胶组合物中，相对于组合物中透明质酸的总量，该量为至多15重量％。参考量(即透明质酸的总量)包括组合物中的所有透明质酸，包括任何分子量的交联透明质酸和游离透明质酸。通常，该量由组合物中透明质酸的浓度指示或可以通过常规方法确定。

在实施例中表明，在根据本发明的多种水凝胶组合物中，MW＜200kDa的透明质酸的分数为至多15重量％(实施例3)。相比之下，针对TMP交联的凝胶描述的交联条件(根据WO2016/005785A1)导致相对于总透明质酸的透明质酸分数为30重量％(比较例4)。而且，与现有技术的BDDE交联的透明质酸组合物的比较显示出在低分子量的量方面的改善(实施例6)。因此，由于炎性透明质酸低聚物的低的分数，提供了关于生物相容性的改进制剂。

实施例3中根据本发明的组合物的MW测定是在一定的保存期限(在室温下保存)之后进行的，而比较例4甚至是在灭菌之前研究。通常，低分子量透明质酸的分数趋向于在加工(灭菌)和储存期间升高。对于具有类似水凝胶性质(浓度、pH、渗透压)的任何交联透明质酸组合物预期了类似的趋势。因此，在根据现有技术的水凝胶中，MW＜200kDa的透明质酸的大的分数在交联之后可能甚至进一步升高。通常，对于刚刚加工成无菌水凝胶组合物的组合物，至多15重量％的低分子量透明质酸的小的分数是期望的。

在优选的实施方案中，由于根据本发明的组合物的优异生物相容性和不存在潜在的毒性交联剂，其可以以每年超过20mL的剂量施用。因此，其适合于需要大量填充物的应用，例如隆胸或需要在多个区域施用的患者。因此，该组合物的一种用途是美容用途。然而，适用性不限于皮肤填充。因此，在另一方面，提供了用于作为药物、用于作为软组织填充物的组合物。

这样的用途(治疗或美容)可以涉及根据本发明的组合物作为软组织填充物或用于组织增大的用途。这样的用途优选包括例如通过注射或植入施用于人类，而适用性不限于人物种。

在另一个方面，本发明涉及一种方法，其中该方法包括在特定的软组织部位引入根据本发明的组合物，例如通过从注射器注射。该方法涉及组合物作为软组织填充物或用于组织增大(tissue augmentation)以用于治疗和美容目的的用途。

在一个实施方案中，根据这些方面的用途或方法包括，将水凝胶组合物通过皮内、骨膜上或皮下从注射器中注射到人类中来引入组织部位。

水凝胶组合物可包含局部麻醉剂和/或选自以下多种其它组分的一种或多种组分，例如生长因子、维生素、多元醇、碱金属卤化物、矿物质、抗氧化剂、氨基酸、辅酶、陶瓷颗粒(例如羟基磷灰石钙颗粒)、聚合物颗粒、聚合物(例如聚乙二醇、糖胺聚糖、润滑素(lubricin)、多糖及其衍生物)、蛋白质(例如弹性蛋白、胶原蛋白、角蛋白、丝素蛋白(silkfibroin))、抗脂肪剂(anti-cellulite agent)、抗瘢痕形成剂、抗炎剂、抗刺激剂、血管收缩剂、抗出血剂(例如止血剂和抗纤维蛋白溶解剂)、张力剂、抗痤疮剂、色素沉着剂、抗色素沉着剂、消炎剂、抗风湿剂、抗病毒剂、抗感染剂、防腐剂、化学治疗剂、细胞抑制剂、抗过敏剂、抗静脉曲张剂、镇痛剂、抗生素、抗真菌剂、解痉剂、抗组胺剂、治疗痔疮的药物、治疗皮肤的药物和保湿剂。

考虑到其减轻注射时的疼痛的能力，向水凝胶组合物中添加局部麻醉剂是特别期望的。局部麻醉剂包括利多卡因、阿替卡因、丙胺卡因、氯普鲁卡因、阿替卡因或其组合，及其盐。优选地，麻醉剂是利多卡因，例如酸加成盐的形式，例如盐酸利多卡因。

在优选的实施方案中，所述组合物还包含选自生物相容性多糖的组的未修饰的聚合物。优选地，未修饰的多糖是未修饰的透明质酸(HA)。未修饰的或也称为游离透明质酸可以补充水凝胶组合物。通常将未修饰的HA作为润滑剂添加到软组织填充物中，以通过降低通过针头或套管注射产品所需的挤压力来确保易于注射。优选地，用于生产组合物的游离透明质酸原料的分子量在约1,000kDa至约3,500kDa的范围内。然而，由于不稳定的透明质酸的快速降解，本领域技术人员将理解，组合物作为软组织填充物的体内性能在很大程度上受交联聚合物和背后的巯基修饰的透明质酸的性质驱动。优选地，未修饰的多糖以低于交联聚合物的浓度被包含。示例性地，未修饰的透明质酸以3mg/mL至7mg/mL，例如5mg/mL的浓度包含在组合物中，其中该浓度优选是指盐(透明质酸钠)的浓度。

此外，在一个实施方案中，交联透明质酸包含至少一个根据式IV的亚基

其中被表示为R

在另外的实施方案中，本发明的组合物包含至少0.1摩尔的至少一种富含氘的透明质酸。

该组合物可以还包含无毒的稳定剂。

为了延长作为软组织填充物的功效，该组合物可以还包含至少一种透明质酸降解抑制剂。

所述抑制剂可以选自由以下组成的组：1,2,3,4,6-五-O-没食子酰葡萄糖、芹菜素、β-七叶素、caltrin、顺式异扁柏脂素(CHR)、紫锥花素(echinacin)、二十碳三烯酸(C20:3)、非诺洛芬(fenoprofen)、硫代苹果酸金钠、棉酚、肝素、橙皮苷磷酸酯(hesperidinphosphate)、吲哚美辛、L-抗坏血酸、L-肉碱、L-氨基肉碱、myochrisine(金硫丁二钠(sodium aurothiomalate))、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)和N-α-对-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)、磷酸化橙皮苷、聚(4-苯乙烯磺酸钠)(T-PSS)、聚磷酸雌二醇(polyoestradiol phosphate)、聚磷酸根皮素(polyphloretin phosphate)、PS53(对苯二酚/磺酸/甲醛聚合物)、聚苯乙烯磺酸钠(N-PSS)、硫酸化2-羟基苯基单乳糖二苷(sulphated2-hydroxyphenyl monolactobioside)、硫酸化对苯二酚二半乳糖苷、硫酸化毛蕊花糖、车前糖和新霉素低聚糖、十四烷基硫酸钠(TDSS)、具有一个双键的C14:1至C24:1不饱和脂肪酸、尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)、尿石素B(urolithin B)、WSG或甘草次酸，或其组合。

所述组合物还可包含粘性亲水性生物相容性醇，优选甘油，优选为0.5-5％重量/体积。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含相对于所述组合物的重量为0.1至5重量％的量的交联透明质酸。

此外，将理解的是，水凝胶组合物的主要组分是水。优选地，使用注射用水或纯净水以生产组合物。此外，将认识到，可以缓冲组合物以具有在6.7至7.8范围内的生理学上可接受的pH。合适的缓冲剂是本领域技术人员已知的，并且包括例如磷酸盐缓冲剂。该组合物还具有生理学上可接受的渗量(osmolality)，这与待治疗的受试者(例如人)中细胞外液的正常渗量类似。因此，该组合物可以具有在250-350mOsmol/kg范围内的渗量，并且可以包括其它溶质以调节渗量，例如氯化钠、氯化钙和/或氯化钾。

根据本发明的水凝胶组合物是无菌的，这可以通过现有技术方法来实现。用高压灭菌器进行湿热灭菌是标准方法之一，其包括使凝胶经受121℃的高压饱和蒸汽约15至20分钟。较短时间(例如，约1分钟至5分钟)和较高温度(例如，约130℃至135℃)的高压灭菌可能会更好地保留凝胶中透明质酸分子的分子量(参见Fedegari whitepaper,US2016/0220729)。其它高压灭菌参数的优化(例如确保产品快速冷却)对于保留聚合物的分子量可能也是有利的(http://www.steriflow.com/en/news/Sterilization-hyaluronic-acid)。

本文所用的术语水凝胶组合物应理解为描述兼具固体和流体(液体)特性的组合物。一方面，水凝胶可以是可注射的，即其表现出流体样行为。另一方面，水凝胶可以足够坚硬(或刚性)以保持某种形式，例如水凝胶可以以预成型的植入物、线或细丝的形式提供。因此，术语水凝胶不以定量方式限制组合物的流变性质。

可以使用水凝胶组合物，其中水凝胶组合物是药物、美容或医疗装置。优选地通过针或套管的注射将水凝胶植入在施用部位，优选软组织。替代地，可以通过外科手术植入水凝胶。一旦施用，水凝胶就可被称为(水凝胶)植入物或储库。根据本发明的水凝胶是生物相容性的，并形成可吸收的(即可生物降解的)植入物。因此，根据本发明的水凝胶可用作软组织填充物。

将包含生物材料(例如稳定的透明质酸)的软组织填充物递送至其中期望借助可注射的水凝胶组合物来增大的组织部位。涉及软组织填充的用途或方法的目的包括增大软(皮肤)组织，矫正先天性异常、获得性缺陷或美容缺陷。

水凝胶组合物的主要作用是纯粹物理的，因为其具有基于植入物的原始体积和膨胀的填充作用。因此，在没有任何生理或药理学相互作用的情况下，该用途可以被分类为美容，并且该组合物可以被认为是美容或医疗装置。其中可以将根据本发明的水凝胶组合物的用途视为美容的应用包括，例如，减少年龄的痕迹，例如：

-应用于外阴和阴道组织，以用于非手术的女性生殖器恢复目的

-应用于真皮、皮下或骨膜上的应用。

示例性地，水凝胶组合物可用于美容目的(方法)，例如用于填充皱纹、治疗皮肤缺陷、恢复面部或身体(例如乳房、耳垂)的损失体积、减小蜂窝织炎中的凹陷、治疗泪槽畸形、塑造面部或身体轮廓(例如臀部增大、髋部增大、小腿增大)、用于阴茎增大(阴茎周长增大、龟头增大)。

在另一些情况下，软组织的填充和增大可导致疾病的治疗或预防，即，其中疾病症状的减少、减轻和/或预防(再)发生。由软组织缺损引起的疾病可受益于所施用的水凝胶对周围组织的暂时和/或局部结构填充、阻尼(damping)、支撑或增大。其中水凝胶组合物可用于治疗或预防的疾病包括例如

-跖骨痛，即跖骨球的脂肪垫的疼痛疾病，对于该用途，可以将根据本发明的水凝胶施用于跖骨球软组织的脂肪垫，

-尿失禁或大便失禁，对于该适应症，可以将根据本发明的水凝胶施用于限定括约肌的组织，

-外阴阴道萎缩(也是更年期生殖泌尿综合症)，对于该适应症，可以通过注射到阴道粘膜和前庭而将本发明的水凝胶施用于外阴阴道区域，和/或用于大阴唇增大，其中重建大阴唇将确保两个大阴唇之间紧密接触，以保护外阴的内部结构

-声带受损，

-静脉瓣膜功能不全，或

-面部脂肪萎缩、使人虚弱的瘢痕或形态不对称或变形(先天性或由于创伤或手术(例如胸部或面部)所致)，对于该适应症，可以施用水凝胶以用于重建目的。

具体实施方式

如上所述，优选的实施方案，交联透明质酸是修饰的透明质酸的反应产物，其中所述修饰的透明质酸被提供交联反应性基团(例如巯基)的内源性分子修饰。在以下关于巯基修饰的透明质酸制剂的制备的更多细节中，给出了作为氧化产物的交联透明质酸以及包含其的组合物。

优选通过在透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基与修饰剂之间形成酯键或酰胺键来引入修饰剂(上述式III)。在合成过程中，修饰剂可以包含二硫键形式的或作为受保护巯基的巯基。

在一个优选的实施方案中，修饰剂通过酰胺键与透明质酸中的葡糖醛酸部分的羧基连接。因此，修饰剂包含至少一个能够与透明质酸中的葡糖醛酸部分的羧基形成酰胺键的氨基，并且修饰剂包含巯基。例如，巯基修饰的透明质酸是透明质酸-半胱胺缀合物，其中半胱胺通过酰胺键与透明质酸连接。

类似地，其它带有巯基的修饰剂可以用于通过修饰剂的氨基(伯氨基或仲氨基，优选伯氨基)与透明质酸中的葡糖醛酸部分的羧基之间的酰胺键形成来合成巯基修饰的透明质酸。潜在的修饰剂包括例如半胱胺、半胱氨酸或高半胱氨酸的衍生物，其中半胱胺、半胱氨酸或高半胱氨酸的氨基与氨基酸的羧基偶联。这些衍生物优选通过使用N-保护的氨基酸来合成。

优选低分子量的修饰剂，以尽可能保留透明质酸的独特物理化学性质。为了获得可用于根据本发明组合物的可交联的巯基修饰的透明质酸，合适的低分子量修饰剂优选地进一步选自包括谷胱甘肽、半胱氨酸和高半胱氨酸的组。

合适的接头L或天然存在的分子LH

-胱胺，其为半胱胺的二硫化物二聚体，即式V的L

-NH-CH

-氧化型谷胱甘肽，其为谷胱甘肽的二硫化物二聚体，即式VI的LH

-胱氨酸，其为半胱氨酸的二硫化物二聚体，即式VII的LH

-高胱氨酸，其为高半胱氨酸的二硫化物二聚体，即式VIII的LH

-胱胺的氨基酸衍生物，其为天然存在分子胱胺与天然存在的氨基酸的缀合物，即式(IX)的LH

其中两个X可以彼此相同或不同(对称或不对称衍生物)，并且X的性质取决于氨基酸。在一个实施方案中，两个X都是氢原子，即对称的甘氨酸衍生物；

-脲，即式X的LH

根据本发明的水凝胶组合物中使用的交联透明质酸可以如下产生：首先用具有交联反应性基团(例如巯基)的内源性分子修饰透明质酸。半胱胺、半胱氨酸和谷胱甘肽是天然存在于人中的这种非遗传毒性内源性分子的实例。例如，半胱氨修饰的(HA-半胱氨)和甘氨酰-半胱胺修饰的(HA-甘氨酰-半胱胺)可通过二硫化物形成来交联的巯基修饰的透明质酸的相关亚结构分别示出在式XI中

或式XII中

反应在不会对透明质酸的分子量产生不利影响的条件下进行，例如小于40℃的温度，以及对于pH 11或更高和小于pH 4的范围内的pH值的非常有限(如果有的话)的暴露时间。

Aeschlimann(EP 1 115 433B1)描述了使透明质酸官能化的方法，其不会损害透明质酸的分子量并且还提供了在体内具有良好耐受性且可生物降解的透明质酸分子。该方法用于产生具有不同的用于交联的末端官能团(例如巯基)的透明质酸。使用活性酯中间体，通过含(受保护)巯基的伯胺或含二硫键的二氨基或二酰肼配体与葡糖醛酸部分的羧基的碳二亚胺介导的偶联，将这些侧链引入透明质酸。然后还原具有二硫键的中间产物，然后通过除去保护基团使具有受保护巯基的中间产物脱保护。

EP 0587715公开了如何合成水不溶性阴离子多糖，其通过以下进行：将至少一种聚阴离子多糖(例如透明质酸)溶解在水性混合物；用活化剂(例如二酰亚胺，如EDC或ETC或BOP)活化聚阴离子多糖；用修饰化合物(例如1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)或1-羟基苯并三唑一水合物)修饰活化的聚阴离子多糖；和使活化的聚阴离子多糖与合适的亲核试剂(例如氨基硫醇)反应以形成期望的不溶性组合物。发明人指出，聚阴离子多糖的BOP活化的一个主要优点是，在与亲核试剂偶联后聚阴离子多糖的分子量不会降低。

Borke等人描述了用DMT-MM进行的三嗪介导的酰胺化，用于用半胱胺对透明质酸进行有效和受控的官能化。与其它偶联剂(例如EDC介导的取代)相比，温和的反应条件和多糖链的最低降解被列为使用这组偶联剂的优点(Borke等人,Carbohydrate Polymers 116(2015)42–50)。Liang等人描述了在CDMT和NMM的存在下通过侧羧酸盐与胱胺的酰胺化反应然后与DTT的还原反应将巯基引入透明质酸的方法(Liang等人,Carbohydrate Polymers132(2015)472–480)。

关于在制备无菌水凝胶组合物期间在交联过程中保留透明质酸的分子量，现有技术没有报道。

然后在其依然未交联的情况下纯化修饰的透明质酸，这允许通过不同的方法(例如沉淀法、色谱法和透析法)进行非常有效的纯化。

然后，使经修饰和纯化的透明质酸交联以形成高粘性凝胶。因此，不必通过透析进一步纯化凝胶，这是常规应用于高粘度水性凝胶的唯一纯化方法。交联的条件取决于接头的性质。在用具有反应性巯基的内源性分子修饰透明质酸的情况下，交联涉及巯基团的氧化以形成分子间和分子内二硫键。

一旦将凝胶填充到注射器中，需要对其进行灭菌。

实施例

实施例1：与脲交联

将8g透明质酸钠溶解在72g盐水中。独立地，通过将4g脲溶解在0.2M 16g HCl来制备溶液。将制备的两种溶液混合，直到最终溶液均匀为止；测量pH，其必须在3.5至4的范围内。

将产物在35(+/-2)℃下恒温20-24小时，然后除去过量的脲；一旦纯化，测量所得产物的pH，其为5.5至7.5。

然后将产物填充到注射器中，并用高压灭菌器灭菌。

实施例2：与胱胺的交联

为了制备水凝胶，将MW为至少约700kDa的HA-半胱胺粉末溶解在水性介质中。将MW为至少1000kDa的未修饰的HA和任选的局部麻醉剂(例如盐酸利多卡因)添加到该溶液中。然后在温和的氧化条件下(pH 7.4，存在O

TH-260417-1、TH-270217-2，TH-220317-2和TH-070217-2的制备

为了制备无菌水凝胶组合物TH-260417-1，将3580mg HA-半胱胺(MW 730kDa)、600mg盐酸利多卡因和1160mg NaCl溶解在185g注射用水中，在室温下机械搅拌约3小时。然后将1000mg透明质酸钠(MW 2400kDa)添加到该溶液中，在室温下继续搅拌约3小时。然后添加pH 11的磷酸盐缓冲液至最终量为200g的制剂。将溶液均质化约15分钟。在室温下孵育过夜后，将现在的交联水凝胶填充到1ml玻璃注射器中，并通过高压灭菌法进行灭菌。无菌水凝胶的pH为约7.7，并且渗量在270–330mOsmol/kg的范围内。

根据相同的方法但是以更小的批量大小(50g)生产了TH-270217-2和TH-070217-2。根据与无菌水凝胶组合物TH-270217-2和TH-070217-2相同的方法但是利用MW为约900kDa的HA-半胱胺原料生产了无菌水凝胶组合物TH-220317-2。

TH-260417-2的制备

为了制备无菌水凝胶组合物TH-260417-2，将3580mg HA-半胱胺(MW 730kDa)、600mg盐酸利多卡因和1160mg NaCl溶解在185g注射用水中，在室温下机械搅拌约3小时。然后将1000mg透明质酸钠(MW 1300kDa)添加到该溶液中，在室温下继续搅拌约3小时。然后添加pH 11的磷酸盐缓冲液至最终量为200g的制剂。将溶液均质化约15分钟。在室温下孵育过夜后，将现在的交联水凝胶填充到1ml玻璃注射器中，并通过高压灭菌法进行灭菌。无菌水凝胶的pH为约7.7，并且渗量在270–330mOsmol/kg的范围内。

TH-260917_200的制备

为了制备无菌水凝胶组合物TH-260917_200，将3580mg HA-半胱胺钠盐(MW730kDa，修饰度151μmol/g聚合物)、600mg盐酸利多卡因和1160mg NaCl溶解在185g注射用水中，在室温下机械搅拌约3小时。然后将1000mg透明质酸钠(MW 2400kDa)添加到该溶液中，在室温下继续搅拌约3小时。然后添加pH 11的磷酸盐缓冲液至最终量为200g的制剂。将溶液均质化约15分钟。在室温下孵育过夜后，将现在的高粘度的凝胶压过筛孔尺寸为200μm的滤板。然后将水凝胶填充到1ml玻璃注射器中，并通过高压灭菌法进行灭菌(121℃/15分钟)。无菌水凝胶的pH为约7.5，并且渗量在270–330mOsmol/kg的范围内。

TH-250417-1的制备

为了制备无菌水凝胶组合物TH-250417-1，将2685mg HA-半胱胺(MW 730kDa)、450mg盐酸利多卡因和870mg NaCl溶解在85.5g pH 3的磷酸盐缓冲液中，在室温下在机械搅拌下过夜。然后通过添加碱性磷酸盐缓冲液将包含HA-半胱胺的溶液的pH调节至pH 7.6，以获得包含2.7％(m/m)的HA-半胱胺的溶液。均质化10分钟后，将溶液在室温下在不搅拌的情况下孵育过夜。接下来，使交联凝胶压过筛孔尺寸为200μm的滤板。制备在10mM pH 6.7的磷酸盐缓冲液中的含有1.5％(m/m)MW为2400kDa的透明质酸钠的溶液。然后将1份在10mMpH 6.7的磷酸盐缓冲液中的含有1.5％(m/m)MW为2400kDa的透明质酸钠的溶液添加到两份过筛并且交联的水凝胶中。机械混合10分钟后，将最终产物填充到1ml玻璃注射器中，并通过高压灭菌法进行灭菌。无菌水凝胶的pH为约7.4，并且渗量在270–330mOsmol/kg的范围内。

TH-250417-2的制备

为了制备无菌水凝胶组合物TH-250417-2，将2685mg HA-半胱胺(MW 730kDa)、450mg盐酸利多卡因和870mg NaCl溶解在103.5g pH 3的磷酸盐缓冲液中，在室温下在机械搅拌下过夜。然后通过添加碱性磷酸盐缓冲液将包含HA-半胱胺的溶液的pH调节至pH 7.6，以获得包含2.2％(m/m)的HA-半胱胺的溶液。均质化10分钟后，将溶液在室温下在不搅拌的情况下孵育过夜。接下来，使交联凝胶压过筛孔尺寸为200μm的滤板。制备在10mM pH 6.7的磷酸盐缓冲液中的含有2.5％(m/m)MW为1300kDa的透明质酸钠的溶液。然后将1份在10mMpH 6.7的磷酸盐缓冲液中的含有2.5％(m/m)MW为1300kDa的透明质酸钠的溶液添加到三份过筛并且交联的水凝胶中。机械混合10分钟后，将最终产物填充到1ml玻璃注射器中，并通过高压灭菌法进行灭菌。无菌水凝胶的pH为约7.6，并且渗量在270–330mOsmol/kg的范围内。

THM-040717-1-53的制备

为了制备无菌水凝胶组合物THM-040717-1-53，将750mg HA-半胱胺钠盐(MW730kDa，修饰度151μmol/g聚合物)、450mg透明质酸钠(MW 2400kDa)、450mg盐酸利多卡因和795mg NaCl溶解在132g 0.01M HCl中，在室温下机械搅拌约21小时。然后添加pH 12.5的磷酸盐缓冲液至最终量为150g的制剂。将溶液均质化约15分钟。在室温下孵育过夜后，将现在的高粘度的水凝胶填充到1ml玻璃注射器中，并通过高压灭菌法进行灭菌。无菌水凝胶的pH为约7.3，并且渗量为267mOsmol/kg。

实施例3：包含二硫化物交联的HA的无菌水凝胶组合物中可提取HA的MW的测量样品制备(还原提取)

在对包含二硫化物交联的HA和游离HA的水凝胶进行灭菌之后，将还原剂添加到水凝胶中以定量地破坏二硫键。然后同时测定其还原(未交联)形式的修饰的HA和游离HA的MW分布。将约900mg水凝胶用1500mg注射用水稀释，然后添加还原剂(2500mg TCEP.HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐(2.5mg/ml注射用水)以裂解二硫桥。在3小时的还原时间之后，将400mg反应溶液用50μl 5N HCl酸化。用乙醇沉淀游离HA和修饰的透明质酸。通过离心回收沉淀物，然后溶解在4ml的水溶液中，该水溶液包含浓度为2mg/ml的用于游离巯基部分的封端剂(2-(2-氨基乙基二硫烷基)吡啶-3-羧酸)。室温下孵育3小时之后，用PBS进一步稀释样品。

分子量测定

对于尺寸排阻色谱(SEC)分析，将样品溶液用SEC洗脱液稀释，导致最终HA浓度为0.1mg/ml。使用Viscotek TDAmax温度控制的多检测器SEC系统进行测量，该系统包括串联的高灵敏度检测器—光电二极管阵列UV、光散射(RALS和LALS)、折射率和粘度计。折射率检测器记录样品的浓度，得到各自的分布曲线。结合光散射检测器，测定分子量MW。

结果

发现在将样品在室温下存储指定天数后，根据实施例2制备的无菌水凝胶组合物中HA的低MW级分(MW<200kDa)在8％至15％的范围内(表1)。

表1：根据本发明的多种水凝胶的分子量(MW)结果

实施例4(比较例)在如WO 2016/005785A1中所述与TMP(三偏磷酸)交联所必需的反应条件下透明质酸的分子量降低。

水合步骤

将初始分子量为2.4MDa的透明质酸钠(HA)在0.01M NaOH中以90mg/ml的终浓度水合2.5小时，并进行机械均质化(pH 11)。

模拟交联步骤

在水合步骤中获得的混合物的一个样品在70℃下孵育48小时。通过使用pH 7.0的磷酸盐缓冲液中和来停止透明质酸骨架的降解。

分子量测定

测定用作起始材料的透明质酸钠、水合步骤后的透明质酸钠以及模拟交联步骤期间获得的所有三个样品的分子量。

对于尺寸排阻色谱(SEC)分析，将样品溶液用SEC洗脱液稀释，导致最终HA浓度为0.1mg/ml。使用Viscotek TDAmax温度控制的多检测器SEC系统进行测量，该系统包括串联的高灵敏度检测器—光电二极管阵列UV、光散射(RALS和LALS)、折射率和粘度计。折射率检测器记录样品的浓度，得到各自的分布曲线。结合光散射检测器，测定分子量MW。

结果

发现暴露于高温和高pH值增加了HA的低MW级分。在pH 11和70℃下48小时后，低分子量级分为30％。预期在生产最终的软组织填充物制剂所必需的灭菌步骤期间低MW级分将进一步增加。

表2：分子量分析结果

实施例5.包含二硫化物交联的HA的无菌水凝胶组合物的体内停留时间

在将每种制剂的总共12次施用皮内注射到雌性Sprague Dawley大鼠的背部皮肤中之后，在2个月的时期内确定无菌水凝胶组合物TH-250417-1和TH-260417-1的降解动力学(参见实施例2和3)。通过MRT扫描监控所施用的填充物储库的体积。计算相对于起点的储库体积的平均储库体积。植入后108天，TH-260417-1的平均相对储库体积为115％，并且TH-250417-1的平均相对储库体积为106％，表明两种包含二硫化物交联的HA的无菌水凝胶组合物均具有较高的抗降解性。

实施例6.包含二硫化物交联的HA和现有技术BDDE交联的HA的组合物中HA的MW分布之间的比较

研究包含二硫化物交联的HA(胱胺交联的HA)的组合物

将修饰度为每g聚合物147μmol巯基的巯基修饰的透明质酸(MW 730kDa)用于制备包含17.9mg/mL交联HA-半胱胺钠盐、3mg/mL盐酸利多卡因和5mg/mL未修饰的透明质酸钠(MW 1.94MDa)的组合物。为了将pH和渗量调节至生理学上可接受的值，水凝胶还包含10mM磷酸盐缓冲液和95mM NaCl。简单地说，通过在室温下搅拌8小时将HA-半胱胺钠盐、透明质酸钠、盐酸利多卡因和氯化钠溶解在0.01M HCl中。如下来开始交联：将1份100mM pH 12.1的磷酸盐缓冲液添加到9份溶液中以将pH调节至7.4，然后添加稀释的过氧化氢溶液以使巯基修饰的透明质酸的游离巯基与过氧化氢的摩尔比为2:1。在室温下交联48小时后，将水凝胶过筛，填充到1ml玻璃注射器中，并通过高压灭菌法进行灭菌。组合物中交联聚合物的平均降低的灭菌后分子量(MRPMW)为610kDa。无菌水凝胶的pH为7.5，并且渗量为296mOsmol/kg。

研究包含BDDE交联HA的组合物

获得了包含浓度为23mg/ml的BDDE交联的HA(MW 2.7MDa)的无菌水凝胶。该水凝胶的pH为7，并且渗量为298mOsmol/kg。

用于通过保守提取进行WM确定的样品制备

如下所述研究两种水凝胶组合物。将约200mg的水凝胶用1800mg PBS稀释。在物理(“保守”)提取游离HA 4小时之后，将分散体离心然后回收上清液。

对于尺寸排阻色谱(SEC)分析，将上清液用SEC洗脱液稀释，导致最终HA浓度为0.1mg/ml。使用Viscotek TDAmax温度控制的多检测器SEC系统进行测量，该系统包括串联的高灵敏度检测器—光电二极管阵列UV、光散射(RALS和LALS)、折射率和粘度计。折射率检测器记录样品的浓度，得到各自的分布曲线。结合光散射检测器，测定分子量MW。

结果

表3.分子量分析的结果

*双峰分子量分布

包含二硫化物交联的HA的无菌水凝胶的提取的HA的浓度(5.2mg/mL)与在水凝胶制备过程中添加至组合物的未修饰的HA的浓度(5mg/mL)非常好地对应。这表明交联过程非常有效且温和，因为没有大量的修饰的HA在水凝胶的制备过程中保持未交联或在透明质酸链降解时释放。在水凝胶生产后的一个月内进行首次测量(表3)。8个月后的重复测量表明提取的HA或MW<200KDa级分的浓度没有增加。相对于透明质酸的总量(包括修饰的HA和未修饰的HA)，分子量小于200kDa的可提取的透明质酸的量小于1重量％。

相比之下，在包含BDDE交联的HA的水凝胶中提取的HA的总浓度为7.5mg/ml，这意味着用于水凝胶生产的HA的约三分之一保持未交联，或在交联、灭菌和储存的过程中在透明质酸链降解时释放。制造商未指定在产品生产过程中主动添加的游离HA的浓度。相对于透明质酸的总量，分子量小于200kDa的可提取的透明质酸的量为23重量％。

实施例7双(甘氨酰)-胱胺二盐酸盐的制备

向胱胺二盐酸盐(1g，4.44mmol)和N-(叔丁氧基羰基)-甘氨酸(1.59g，9.10mmol)在无水二氯甲烷:THF＝1:1(20mL)中的混合物中首先添加三乙胺(1270μL,9.16mmol)，然后添加EDC*HCl(1.75g,9.10mmol)的二氯甲烷溶液。将反应溶液在环境温度下搅拌5小时，然后在减压下蒸发挥发物。将残余物收集到乙酸乙酯(250mL)中，并用1n HCl(2×50mL)、半饱和NaHCO

向N-Boc保护的双(甘氨酰基)-胱胺(300mg，0.64mmol)的MeOH(5mL)溶液中添加乙酰氯(300μL,4.20mmol)。放热反应停止后，将混合物在密封烧瓶中于环境温度下搅拌5小时，然后添加甲苯(2mL)并将挥发物蒸发，直至产物沉淀出来。通过抽滤分离白色固体，并用正戊烷(2x 5mL)洗涤。产量：146mg(67％)。m.p.＝184℃(decomp.)；1H NMR(400MHz,D2O)δ3.81(s,2H,α-CH

双(甘氨酰基)-胱胺二盐酸盐是修饰剂，其允许制备透明质酸-甘氨酰-半胱胺钠盐(HA-GLYC)。该修饰的透明质酸形成交联透明质酸HA-L-HA，其中接头LH

实施例8：包含交联透明质酸-甘氨酰-半胱胺的水凝胶组合物的配制和表征

产生了包含17.9mg/mL的交联透明质酸-甘氨酰-半胱胺钠盐(HA-GLYC)和5mg/mL的未修饰的透明质酸钠的无菌水凝胶组合物。简单地说，将537mg HA-GLYC(干重，MMW610kDa，修饰度162μmol/g聚合物)和150mg透明质酸钠(干重，MMW 2.4MDa)溶解在26g0.01M HCl(包含NaCl)中，在室温下机械搅拌约5小时。向19.02g该溶液中添加2.115mL的100mM pH 11.85的磷酸盐缓冲液，其导致pH调节至约pH 7.4。然后添加273μL的0.3％H

实施例9：包含交联透明质酸-高半胱氨酸的水凝胶组合物的配制和表征

产生了包含17.9mg/mL的交联透明质酸-高半胱氨酸钠盐(HA-HCYS)和5mg/mL的未修饰的透明质酸钠的无菌水凝胶组合物。简单地说，将537mg HA-HCYS(干重，MMW 610kDa，修饰度136μmol/g聚合物)和150mg透明质酸钠(干重，MMW 2.4MDa)溶解在26g 0.01M HCl(包含NaCl)中，在室温下机械搅拌约5小时，然后静置1小时以除去气泡。向23.68g该溶液中添加2.63ml 100mM pH 12.04的磷酸盐缓冲液，其导致溶液的pH调节至约pH 7.2。将该混合物在室温下静置48小时以进行交联，然后将交联的水凝胶填充到1mL玻璃注射器中，并通过高压灭菌进行灭菌。无菌水凝胶的pH为约7.0。