一种姜黄素纳米脂质体佐剂及其制备方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体的涉及一种姜黄素纳米脂质体佐剂及其制备方法。

背景技术

姜黄素是一种黄色素，从姜黄中提取，多用于食品着色，是一种常用的天然色素。具有邻二羟基基因的姜黄素在抗氧化过程中，会产生稳定性很好的醌类物质，使其成为抗氧化物质的冠军。诸多研究表明具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗人免疫缺陷病毒等作用，目前，国内外对姜黄素的研究主要集中于药物代谢动力学以及抗肿瘤、抗炎和抗病毒效应。但是姜黄素本身因水溶性差、生物利用度低、半衰期短、易降解等缺点而制约了自身的使用。

佐剂是指能增强机体抗原免疫应答或改变免疫应答类型的物质，其主要作用是为了增强机体免疫系统的反应强度和持久性。现有疫苗佐剂多为油佐剂或铝胶佐剂，存在局部刺激大、不良反应多、疫苗稳定性差、效力不高等问题。目前我国疫苗企业使用的佐剂主要依赖进口，造成疫苗制剂的生产成本大幅度提高和产品价格上涨。此外，现有疫苗佐剂产生免疫保护率低、免疫期短，同时油乳剂不易被机体吸收并有刺激性，容易导致注射部位红肿或溃烂等副作用，影响动物产品的品质。随着人们对食品安全的高度关注，开发高效、安全、绿色的新型纳米佐剂具有广阔的应用前景。

因此，需要研制一种新型疫苗佐剂。

发明内容

为克服上述缺陷，本申请的目的在于提出一种姜黄素纳米脂质体佐剂及其制备方法。该佐剂包含有姜黄素，因而具有较强的抗自由基，抗脂质过氧化和稳定细胞膜的作用，可抑制氧自由基的产生增加谷胱甘肽的水平，进而保护机体组织器官免受侵害。

为了达到以上目的，本申请如下技术方案：

一种姜黄素纳米脂质体佐剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤：

S1.将质量比为0.05～0.4:2:1:1的姜黄素、大豆磷脂、DOTAP及DOPE分别溶解在有机溶剂中；

S2.超声震荡第一时间，使得黄素、大豆磷脂、DOTAP及DOPEPE充分混合,

S3.将无水乙醇的混合溶液滴加到去离子水中，所述去离子水处于40-45℃水浴条件下，并维持水浴旋转搅拌，

S4.在40-45℃的条件下真空旋转蒸发第二时间、以除去无水乙醇,获得姜黄素脂质体佐剂。

在一较佳的实施方式中，该步骤S1中，称取姜黄素1mg、大豆磷脂10mg、OTAP5mg及DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)5mg,并溶解在有机溶剂中。

在一较佳的实施方式中，该有机溶剂为无水乙醇。

在一较佳的实施方式中，该步骤S4中，包括真空度为0.1MPa和转速介于100～200r/min条件下，真空旋转蒸发30分钟。

在一较佳的实施方式中，该步骤S4中，还包括

S5.将获得的姜黄素脂质体佐剂依次通过滤膜筛选。

在一较佳的实施方式中，该步骤S5中包括所述姜黄素脂质体佐剂依次通过孔径为400nm、200nm及100nm的碳酸纤维膜筛选，以制备粒径均匀的姜黄素纳米脂质体佐剂。

本申请实施例提供一种上述制备方法制备的姜黄素纳米脂质体佐剂，所述姜黄素纳米脂质体佐剂的包封率超过88％。

有益效果

本申请提出的姜黄素纳米脂质体佐剂及其制备方法。利用该制备方法制备的脂质体将姜黄素包裹在脂质双分子层中,这样克服姜黄素水溶性差和生物利用度低的问题。同时该佐剂具有明显的缓释效果,可延长药物在体内的循环时间,提高药物的稳定性，利用该佐剂制备的疫苗与传统动物用疫苗佐剂相比，纳米姜黄素脂质体疫苗佐剂具有明显的优势。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1为本申请实施例的纳米姜黄素脂质体佐剂的体外释放试验示意图。

图2为本申请实施例的制备的疫苗在不同实验组脾脏淋巴细胞IL-2分泌水平比较；

图3为本申请实施例的制备的疫苗在不同实验组脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平比较；

图4为本申请实施例的制备的疫苗不同实验组脾脏淋巴细胞IL-4分泌水平比较示意图；

图5为本申请实施例的制备的疫苗免疫后各组SPF鸡体内特异性抗体增长曲线示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本申请而不限于限制本申请的范围。实施例中采用的实施条件可以如具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

本申请揭示一种姜黄素纳米脂质体佐剂及其制备方法。制备的脂质体将姜黄素包裹在脂质双分子层中,这样克服姜黄素水溶性差和生物利用度低的问题。同时该佐剂具有明显的缓释效果,可延长药物在体内的循环时间,提高药物的稳定性，辅助激活免疫应答反应，增加炎症因子分泌，提高抗体滴度，延长免疫保护时间，减少免疫次数、降低毒副作用和动物应激反应。与传统动物用疫苗佐剂相比，纳米姜黄素脂质体疫苗佐剂具有明显的优势。

接下来描述本申请提出的姜黄素纳米脂质体佐剂的制备方法，该方法包含如下步骤：

S1.将质量比为0.05～0.4:2:1:1的姜黄素、大豆磷脂、DOTAP及DOPE分别溶解在有机溶剂中；

S2.超声震荡第一时间(如5min)，使得黄素、大豆磷脂、DOTAP及DOPEPE充分混合,

S3.将无水乙醇的混合溶液滴加到去离子水中，所述去离子水处于40-45℃水浴条件下，并维持水浴旋转搅拌，

S4.在40-45℃的条件下真空旋转蒸发第二时间、以除去无水乙醇,获得姜黄素脂质体佐剂。

在一实施方式中，步骤S1中.称取姜黄素1mg，称取大豆磷脂10mg、DOTAP(2,3-二油酰基-丙基-三甲胺)5mg和DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)5mg,并溶解在有机溶剂中,

步骤S2.超声震荡5分钟，使得黄素、大豆磷脂、DOTAP及DOPEPE充分混合在无水乙醇中,

步骤S3.将10ml去离子水置于40-45℃水浴条件下，搅拌速度为100r/min，将该无水乙醇的混合溶液滴加到去离子水中并维持水浴搅拌，

步骤S4.在40-45℃、真空度0.1MPa和转速150r/min条件下，无水乙醇和去离子水的混合溶液通过真空旋转蒸发30min除去无水乙醇,获得姜黄素脂质体佐剂。

在其他的实施方式中，姜黄素可选取0.25mg、0.5mg或2mg其他组分的重量不变。

较佳的，还包括步骤S5.将获得的姜黄素脂质体佐剂依次通过孔径为400nm、200nm及100nm的滤膜(如碳酸纤维膜)筛选粒径，制备粒径均匀的姜黄素纳米脂质体佐剂。

上述方法制备的佐剂采用微柱离心法测量纳米姜黄素脂质体佐剂的包封率,取适量脂质体,滴加于葡聚糖G-50凝胶柱的顶端,离心收集滤液。用适量去离子水洗脱多次(如，3次),合并滤液于容量瓶中破乳定容,采用高效液相色谱法测定姜黄素含量,计算脂质体中包裹的姜黄素含量：

ER＝(W

式中：W

上述方法制备的佐剂粒径与电位的检测，取1ml的纳米姜黄素脂质体佐剂,加入9ml去离子水稀释至10倍,使用马尔文粒度分析仪分别测定纳米姜黄素脂质体佐剂的粒径和电位。

(1)、纳米姜黄素脂质体佐剂的包封率、粒径和Zeta电位(n＝3)

表1

从表1中看出姜黄素纳米脂质体佐剂包封率均超过88％,具有明显的缓释性,使得姜黄素免疫后在体内的作用时间更长，有望减少注射次数，降低禽类的应激反应。同时,该姜黄素制备成纳米脂质体疫苗佐剂后，理化性质更加稳定,更加便于储存和运输，表1中测试数据选取姜黄素1mg、大豆磷脂10mg、OTAP5mg及DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)5mg。

如图1所示为上述方法制备的姜黄素脂质体佐剂的体外释放试验统计表，分别取2ml纳米姜黄素脂质体佐剂各3份,置于煮沸处理过的透析袋中,将透析袋封口,悬挂于200ml的溶出介质中。其中，溶出介质为含10％胎牛血清的PBS溶液(pH值为7.4)，水浴温度为37℃,转速为100r/min,于0.5,1,2,3,4,6,8,10,12,24,36,48,72h时各取样2ml,同时补加2ml溶出介质。将取出的溶液过0.22μm微孔滤膜后,采用高效液相色谱法测定姜黄素含量,计算累计释放率,并绘制溶出曲线。研究结果表明，姜黄素载入纳米脂质体后，72小时内累计释放率低于10％,证明姜黄素纳米脂质体佐剂具有较好的稳定性。

下面通过分组实验描述利用上述纳米姜黄素脂质体佐剂制备的姜黄素脂质体佐剂H5N2疫苗与ISA71 H5N2疫苗组、H5N2灭活疫苗组及阴性对照组(阴性对照组以PBS为水相制备的疫苗免疫)试验效果。

试验将80只SPF(无菌鸡)鸡随机分成4组，每组20只，分别为姜黄素脂质体佐剂H5N2疫苗组、ISA71 H5N2疫苗组、H5N2灭活疫苗组及阴性对照组(阴性对照组以PBS为水相制备的疫苗免疫)。疫苗组鸡血凝素(HA)免疫剂量为10μg/只，各组均采用颈部皮下注射方式免疫。各组均采用颈部皮下注射方式免疫。免疫后第60天，无菌剖取SPF鸡脾脏,剪碎后研磨,并用100目的尼龙网过滤,将细胞悬液置于5ml淋巴细胞分离液上层,1500r/min离心20min,取中间层单个核细胞,PBS离心清洗2次,细胞计数,用10％小牛血RPMI-1640培养基将细胞悬液稀释到活细胞数为2×106个/ml后,加入96孔细胞培养板,100μL/孔,补加1640培养基100μL,同时加入H5N2流感裂解疫苗原液，37℃,5％CO2培养72h,收集上清,用细胞因子ELISA检测试剂盒对培养上清中IL-2、IL-4、IFN-γ水平进行检测,检测方法按试剂盒说明书要求进行。

图2：不同实验组脾脏淋巴细胞IL-2分泌水平比较，图3：不同实验组脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平比较，图4：不同实验组脾脏淋巴细胞IL-4分泌水平比较。与其他各实验组相比，本申请提出的姜黄素纳米脂质体佐剂表现明显的的免疫增强作用。分泌高水平细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4。表明姜黄素纳米脂质体佐剂可通过刺激抗原提呈细胞促进释放不同类型的细胞因子，诱导Th细胞分化为Th1或Th2型细胞,Th1细胞通过释放Th1型细胞因子IFN-γ等诱导细胞免疫应答。Th2型细胞通过释放Th2型细胞因子IL-4等诱导体液免疫应答。姜黄素纳米脂质体佐剂诱导分泌高水平的IL-2,表明脾脏淋巴细胞经抗原刺激后均已活化,并分泌细胞因子。

免疫后0、3、7天以及每隔大约1-2周，采集各疫苗组及对照组鸡的血液0.3-0.4ml，分离血清，通过血凝抑制试验检测特异性抗体效价。从图5中可以看出使用本申请提出的姜黄素纳米脂质体佐剂后，长达3个月时间的检测结果表明，与其它各实验组相比，给予H5N2免疫后在SPF鸡体内可产生更高水平的抗体，保护时间更长。表明阳离子脂质体佐剂姜黄素纳米脂质体佐剂对于诱导体液免疫和细胞免疫，均具有明显的增强作用。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的实施描述，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。本公开无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的权利要求的保护范围之内。