用于快速检测目标生物或目的基因的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于快速检测目标生物或目的基因的试剂盒，更具体涉及一种快速检测幽门螺杆菌的试剂盒，更具体涉及一种基于多重PCR和胶体金试纸条的用于快速检测幽门螺杆菌的试剂盒。

背景技术

基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息的DNA或RNA序列，通过复制，把遗传信息传递给下一代，指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者外周静脉血或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，分析它所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常的一种方法，从而使人们能了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险。

幽门螺杆菌(H.Pylori)是世界上最常见的病原体之一。流行病学研究表明幽门螺杆菌感染了世界范围内一半以上的人口。幽门螺杆菌在我国人群中的感染率高达60％，其中城市为50％，农村为68.8％，每年新感染病例超过1200万人。幽门螺杆菌是引起消化性溃疡和慢性活动性胃炎的主要病因，也是世界卫生组织于2012年认定其为胃癌第一类致癌原。及时地诊断并根除幽门螺杆菌是治愈胃病的前提。

目前幽门螺杆菌的检查方法主要包括：细菌的直接检查、尿素酶检查、免疫学检测、聚合酶链反应技术等。现有幽门螺杆菌的检查方法的不足之处如下：

(1)细菌的直接检查。通过胃镜检查钳取胃粘膜(多为胃窦粘膜)作直接涂片、染色，组织切片染色及细菌培养来检测幽门螺杆菌。缺点：直接涂片、染色，组织切片染色受检测者的经验、细菌的状态、取材的部位影响较大，并且幽门螺杆菌的培养非常缓慢、费时。

(2)尿素酶检查。因为幽门螺杆菌能够产生尿素酶，故可通过检测尿素酶来诊断幽门螺杆菌感染。尿素酶分解胃内尿素生成氨和二氧化碳，使尿素浓度降低、氨浓度升高。基于此原理已发展了多种检测方法：胃活检组织尿素酶试验、呼吸试验、胃液尿素或尿素氮测定、15N-尿素试验。缺点：受到其他能产生尿素酶菌的干扰，检测前病人服用抗酸药物等会影响检测结果。

(3)免疫学检测。免疫学检测方法是通过测定血清，或粪便中的幽门螺杆菌抗体来检测幽门螺杆菌感染。缺点：一般感染幽门螺杆菌一段时间才呈抗体阳性，幽门螺杆菌感染初期检测结果常常会出现假阴性，从而使患者失去治疗的最佳时机；此外，由于幽门螺杆菌即使被根除，但该抗体下降缓慢，患者往往需要1-2年才能转阴，不利于判断治疗结果。

(4)聚合酶链反应技术。胃镜下采样后可采用聚合酶链反应(PCR)检测，这种方法灵敏度较高，结果也比较可靠。缺点：一方面，幽门螺杆菌的DNA突变性非常高，存在大量的变异，具有高度不一致性，单一引物PCR常常不能检测到DNA突变的菌种，很容易造成假阴性的结果；另一方面，只用一对PCR引物会有很高的概率与其他菌种或生物体的DNA片段具有同源性，而导致假阳性结果(例如目前常用的16S亚基序列虽具有保守性比较高的优点，但是它的特异性相对较低，因为所有的细菌核糖体中均有16S亚基序列，虽然在胃酸这一强腐蚀性的液体中能存活的细菌大多为幽门螺杆菌，但是在取样和DNA提取的过程中若发生细菌污染，则会影响检测结果，造成假阳性)。

无法准确判断幽门螺杆菌感染，会影响临床医生治疗方案，造成患者抗生素的滥用，不利于患者健康。因此，提供一种检测快速、准确、特异性强且普适性广的检测方法尤为重要。

幽门螺杆菌的致病性主要归因于其毒性成分，比如鞭毛，脂多糖(LPS)，空泡毒素vac A和细胞毒素相关基因致病性岛(cag-PAI)。其中cag-PAI是最有效、最具研究价值的毒性成分之一。Cag A蛋白是由cag毒力岛(PAI)编码的蛋白，cag A基因位于其C末端，是幽门螺杆菌最重要的致病因子，感染CagA+的人群较感染CagA阴性Hp患者更易发生胃癌。

幽门螺杆菌分为西方型和东亚型，其中东亚型又称东亚高危型。东亚型的幽门螺杆菌毒力更高，更容易引起胃病的发展以及胃癌的发生。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于快速检测目标生物或目的基因的试剂盒。

本发明提供了一种用于检测目的生物的试剂盒，包括扩增引物和胶体金检测试纸；

所述扩增引物包括目标生物扩增引物；目标生物扩增引物包括至少一个引物对；每个引物对由用于扩增目的生物基因组中的特异性DNA片段的两条引物组成；所述引物对的两条引物均在5’末端具有标记物，分别命名为标记物甲和标记物乙，标记物甲和标记物乙为不同标记物；

所述胶体金检测试纸中包括胶体金垫和检测垫；胶体金垫上具有胶体金标记的结合物甲，检测垫的T线上具有结合物乙；

所述标记物甲和结合物甲具有特异性结合的特性；所述标记物乙和结合物乙具有特异性结合的特性。

所述扩增引物由目标生物扩增引物和内参基因扩增引物组成；所述内参基因扩增引物用于扩增内参基因。

所述试剂盒还包括乙醇。

所述检测目的生物为微生物。

所述检测目的生物具体可为幽门螺杆菌。

所述目标生物扩增引物具体可为HP引物组。

所述目标生物扩增引物具体可由HP引物组和H48引物对组成。

所述内参基因扩增引物具体可为H1引物对。

本发明还提供了一种用于检测幽门螺杆菌的试剂盒，包括HP引物组、H48引物对、H1引物对和胶体金检测试纸；

HP引物组由如下四个引物对组成：H2引物对、H3引物对、H4引物对和H5引物对；H2引物对由引物H2-F和引物H2-R组成，引物H2-F为序列表的序列3所示的单链DNA分子，引物H2-R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；H3引物对由引物H3-F和引物H3-R组成，引物H3-F为序列表的序列5所示的单链DNA分子，引物H3-R为序列表的序列6所示的单链DNA分子；H4引物对由引物H4-F和引物H4-R组成，引物H4-F为序列表的序列7所示的单链DNA分子，引物H4-R为序列表的序列8所示的单链DNA分子；H5引物对由引物H5-F和引物h5-R组成，引物H5-F为序列表的序列9所示的单链DNA分子，引物H5-R为序列表的序列10所示的单链DNA分子；

H48引物对由引物H48-F与引物H48-R组成，引物H48-F为序列表的序列11所示的单链DNA分子；引物H48-R为序列表的序列12所示的单链DNA分子；

H1引物对由引物H1-F与引物H1-R组成，引物H1-F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物H1-R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

每个引物对的两条引物均在5’末端具有标记物，分别命名为标记物甲和标记物乙，标记物甲和标记物乙为不同标记物；

所述胶体金检测试纸中包括胶体金垫和检测垫；胶体金垫上具有胶体金标记的结合物甲，检测垫的T线上具有结合物乙；

所述标记物甲和结合物甲具有特异性结合的特性；所述标记物乙和结合物乙具有特异性结合的特性。

所述试剂盒还包括乙醇。

具体来说，所述试剂盒包括3种预混液，HP引物组、H48引物对、H1引物对分别存在于三种预混液中。

IPC-PCR预混液：DNA聚合酶、H1-F、H1-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。预混液中，引物H1-F的浓度为1/2μM、引物H1-R的浓度为1/2μM。预混液中，dNTP的浓度为1/3mM。9μl预混液中，DNA聚合酶的含量为0.5U。9μl预混液中，10×Buffer的加入量为1μl。

HP-PCR预混液：DNA聚合酶、H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F、H5-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。预混液中，引物H2-F的浓度为1/9μM、引物H2-R的浓度为1/9μM、引物H3-F的浓度为1/9μM、引物H3-R的浓度为1/9μM、引物H4-F的浓度为1/6μM、引物H4-R的浓度为1/6μM、引物H5-F的浓度为1/9μM、引物H5-R的浓度为1/9μM。预混液中，dNTP的浓度为1/3mM。9μl预混液中，DNA聚合酶的含量为0.5U。9μl预混液中，10×Buffer的加入量为1μl。

cagA-PCR预混液：DNA聚合酶、H48-F、H48-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。预混液中，引物H48-F的浓度为1/2μM、引物H48-R的浓度为1/2μM。预混液中，dNTP的浓度为1/3mM。9μl预混液中，DNA聚合酶的含量为0.5U。9μl预混液中，10×Buffer的加入量为1μl。

本发明还提供了一种用于检测目的基因的试剂盒，包括扩增引物和胶体金检测试纸；

所述扩增引物包括至少一个引物对；每个引物对由用于扩增目的核酸或目的核酸片段的两条引物组成；所述引物对的两条引物均在5’末端具有标记物，分别命名为标记物甲和标记物乙，标记物甲和标记物乙为不同标记物；

所述胶体金检测试纸中包括胶体金垫和检测垫；胶体金垫上具有胶体金标记的结合物甲，检测垫的T线上具有结合物乙；

所述标记物甲和结合物甲具有特异性结合的特性；所述标记物乙和结合物乙具有特异性结合的特性。

所述试剂盒还包括乙醇。

所述标记物甲和结合物甲具有特异性结合的特性。例如，可为抗原与抗体的关系，可为生物素和亲和素的关系，等等。

所述标记物乙和结合物乙具有特异性结合的特性。例如，可为抗原与抗体的关系，可为生物素和亲和素的关系，等等。

所述标记物甲具体可为地高辛，相应的所述结合物甲具体可为地高辛抗体(例如兔抗地高辛抗体)。

所述标记物乙具体可为生物素，相应的所述结合物乙具体可为亲和素。

所述胶体金标记的结合物甲具体可为如下：胶体金标记的羊抗兔IgG与兔抗地高辛抗体的结合物。相应的，检测垫的C线上具有兔IgG。

胶体金检测试纸包括卡壳、底板、样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫。沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上。

C线靠近吸水垫、远离胶体金垫。T线靠近胶体金垫、远离吸水垫。

卡壳套设于试纸条外，具有检测窗和加样孔。加样孔位于样品垫上方。检测窗用于观察C线和T线的显色情况。

所述试剂盒的使用方法为：

(1)提取待测样本的总DNA，作为模板DNA，分别进行三个体系的PCR；

(2)完成PCR后，体系置于冰上，45min内加入乙醇并使其在体系中的体积百分含量为0.5％-1.5％(优选为1％)，混匀后取1μl加入至400μl样本稀释液中，充分混合，然后吸取70μl，滴加至胶体金检测试纸的加样孔，水平放置，然后读取结果。

三个体系的PCR，其中1个体系采用HP引物组、1个体系采用H48引物对、1个体系采用H1引物对。

IPC反应体系的组成(10μl)具体可为：模板(DNA含量为20ng)、DNA聚合酶、H1-F、H1-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H1-F的浓度为0.45μM，H1-R的浓度为0.45μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

HP反应体系(10μl)具体可为：模板(DNA含量为20ng)、DNA聚合酶、H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F、H5-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H2-F的浓度为0.1μM，H2-R的浓度为0.1μM，H3-F的浓度为0.1μM，H3-R的浓度为0.1μM，H4-F的浓度为0.15μM，H4-R的浓度为0.15μM，H5-F的浓度为0.1μM，H5-R的浓度为0.1μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

cagA反应体系的组成(10μl)具体可为：模板(DNA含量为20ng)、DNA聚合酶、H48-F、H48-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H48-F的浓度为0.45μM，H48-R的浓度为0.45μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

PCR反应程序具体见表1。

为了解决目前PCR检测方法在临床检测幽门螺杆菌方面的限制，克服常规的PCR方法的假阳性和假阴性问题,本发明提供了一种用于快速检测幽门螺杆菌的胶体金试剂盒。试剂盒中的特异引物组由四对引物组成，针对幽门螺杆菌中具有高特异性的4个基因片段，可以有效鉴定幽门螺杆菌，解决假阴性和假阳性的问题。试剂盒中的cag A引物对针对cagA基因，可以有效鉴定出东亚型幽门螺杆菌。本发明提供的试剂盒采用具有标记的引物对模板进行多重PCR扩增，然后通过免疫反应实现显色(在C线显色的前提下，T线显色说明感染幽门螺杆菌，T线不显色说明未感染幽门螺杆菌)。进一步，本发明提供的试剂盒采用具有标记的引物对模板进行以CagA基因为靶标的扩增，然后通过免疫反应实现显色(在C线显色的前提下，T线显色说明感染东亚型幽门螺杆菌，T线不显色说明未感染东亚型幽门螺杆菌)。进一步，本发明提供的试剂盒中包括乙醇，PCR完成后在45min以内加入乙醇，可以有效抑制引物二聚体的产生。本发明提供的试剂盒结合了多重PCR扩增和核酸试纸条检测技术，可以实现简单、快速(PCR扩增产物稀释后直接滴加至试剂盒中的试纸条，1-2min即可判读结果)、准确、灵敏以及可视化，减少了实验仪器，节约了成本，减少了对实验环境的污染。本发明提供的试剂盒，组成简单、成本低廉、便于操作，同时还具有普适性广的优点，无需专业技能人员即可操作，大大节约了时间成本和人力成本，特别适用于条件有限的基层检测。

本发明提供的试剂盒实现了准确、快速地检测幽门螺杆菌感染，能够为临床医师的治疗方案提供有价值的信息，对临床医师的用药具有重要的价值，能够使患者得到及时的治疗，避免因误诊而延误病情。本发明对我国诊断试剂行业的整体发展具有非常重要的意义，还有利于降低我国居民胃癌的发生率，有利于整体提高我国居民的健康水平，也能给为降低国家医保支出做出巨大贡献。

附图说明

图1为实施例1的步骤一的结果。

图2为实施例1的步骤二的结果(检测单独引物对的扩增效果)。

图3为实施例1的步骤二的结果(检测多重引物组的扩增效果)。

图4为实施例5的步骤二的结果。

图5为实施例5的步骤三的结果。

图6为实施例7中样本28的结果。

图7为实施例7中样本26和样本29的结果。

图8为实施例8的结果。

图9为实施例9的结果(试纸结果)。

图10为实施例9的结果(电泳结果)。

图11为实施例10的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.2-7.4、0.2M的PBS缓冲液。

实施例中的10×Buffer为GeneAmp

实施例中的DNA聚合酶为IMMOLASE

https://www.bioline.com/us/immolase-dna-polymerase.html。

市售预混液1：TB

市售预混液2：TB

实施例1、引物的筛选

一、cagA引物对的筛选

由于cagA基因具有多态性，因此设计针对东亚型幽门螺杆菌cagA基因的特异区中的多个靶区段的多个引物对。示例性的，部分引物对序列如下：引物对1：

F：TCTAATTAAGGGAAGAATACTCCAATAA；R：TCGCGATCGGGTGTTGATTTTA。

引物对2：

F：GATCAGGCAAGCTTTTGATG；

R：CTAAAAGATTGTTTGGCAGA。

引物对3：

F：TCTAATTAAGGGAAGAATACTCCAATAA；R：CTGTAGAAGATTGTTTGGCAGA。

引物对4：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGATG；

R：TCGCGATCGGGTGTTGATTTTA。

引物对5：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGAAG；

R：CTGCAAAAGATTGTTTGGGA。

引物对6：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGAAG；

R：TCGTCGATCGGGTGTTGATTA。

引物对7：

F3：GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG；

R：CTGCAAAAGATTGTTTGGGA。

引物对8：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG；

R：TCGGATCGATCGGGTGTTGATTA。

引物对9：

F：AGGCATGATAAAGTTGAT；

R：AAAGGTCCGCCGAGATCAT。

引物对10：

F：ACCCTAGTCGGTAATGGG；

R：TGCCCTACACCACCCAAA。

引物对11：

F：AAAAATCCGACTCAATC；

R：GCTTTAGCTGATACCGC。

引物对12：

F：AAAGGAGTGGGCGGTTTCA；

R：CCTGCTTGATTTGCCTCATCA。

引物对13：

F：ACCCTAGTCAGTAATGGG；

R：GCAATTTTGTTAATCCGGTC。

引物对14：

F：GCATCAGCAGGTAAAGGAGT；

R：GTTTTAGCTTCTGACACTGC。

引物对15：

F：AGGCATGATAAAGATGAT；

R：CCTGCTTGATTTTCATCA。

引物对16、

F(序列表的序列11)：GCATCAGCAGGTAAAGGAGT；

R(序列表的序列12)：CCTGCTTGATTTGCCTCATCA。

18例临床样本：样本为通过胃镜获取的患者的胃部组织或黏液，均已由医院确诊为幽门螺杆菌阳性。患者均为知情同意的志愿者。

1、将18例临床样本等质量混合，然后提取总DNA。

2、以步骤1得到的DNA为模板，分别采用各个引物对进行PCR扩增。

反应体系组成(10μl)：1μl模板溶液(DNA含量为5-20ng)、2.5μl市售预混液1、2μl市售预混液2、每条引物，余量为水。反应体系中，引物F的浓度为0.4μM、引物R的浓度为0.4μM。

PCR扩增程序：

第一步：94℃2min；

第二步：94℃1min，63-59℃(第一个循环为63℃，每个循环降低1℃)40s，72℃30s，5个循环；

第三步：94℃20s，58℃20s，72℃25s，35个循环；72℃收集SYBR荧光信号。

结果见图1。引物对16的扩增效果显著优于其他引物对。由于模板DNA提取自混合临床样本，引物对扩增效果越高，意味着其靶序列越多，也就是说其可以实现扩增的cagA基因多态类型出现的频率较高。

3、分别提取18例临床样本的DNA。

4、分别以步骤3提取的各个DNA为模板，分别采用各个引物对进行PCR扩增。

反应体系组成以及PCR扩增程序同步骤2。

对于18例临床样本来说，引物对1的检出率为0，引物对2的检出率为5.6％，引物对3的检出率为5.6％，引物对4的检出率为0，引物对5的检出率为0，引物对6的检出率为11.1％，引物对7的检出率为0，引物对8的检出率为0，引物对9的检出率为0，引物对10的检出率为5.6％，引物对11的检出率为0，引物对12的检出率为0，引物对13的检出率为0，引物对14的检出率为0，引物对15的检出率为0，引物对16的检出率为83.3％。

结果表明，引物对16可以鉴定东亚型幽门螺杆菌cagA基因的特异区最多的突变形式。

二、HP引物组的筛选

引物对H2：

F(序列表的序列3)：GTGGAAAAAGGCGGTATCGGTCAA；

R(序列表的序列4)：CATGCCTTTATCGCCTTTTCTCCA。

引物对H3：

F(序列表的序列5)：AATCGCAGGGGTGGGCATAGG；

R(序列表的序列6)：TGAGGGGTAAAGCAGGGGTGAAAC。

引物对H4：

F(序列表的序列7)：CCTTGAGCGCGGTTTGATTCTTG；

R(序列表的序列8)：GTGGTGGCTTTGTTAGTGGGATGC。

引物对H5：

F(序列表的序列9)：AGAGCCTGCTGGTGGGGATTG；

R(序列表的序列10)：AAGCCTTGTATGTCGGTGGTGGTA。

引物对U235：

F：GGTTGAAATAGGCACACAATTC；

R：CTTCCCCAGTCTCTAATCCTACC。

引物对S279：

F：GAGCGGAAGTCCTAGTC；

R：GATGATATGCCCAATAGC。

模板为幽门螺杆菌基因组DNA(ATCC，43504D-5

1、检测单独引物对的扩增效果

取模板，分别采用各个引物对进行PCR扩增。

反应体系组成和PCR扩增程序同步骤一的2。

部分结果见图2。扩增效率最高的为引物对H2、引物对H3、引物对H4、引物对H5、引物对U235和引物对S279，其他引物对扩增效果不好。

2、检测多重引物组的扩增效果

(1)取模板，采用多重引物组(由引物对H2、引物对H3、引物对H4、引物对H5、引物对U235和引物对S279，共12条引物组成)进行PCR扩增。

反应体系组成和PCR扩增程序同步骤一的2。反应体系中，6种引物F的浓度均为0.4μM、6种引物R的浓度均为0.4μM。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。引物之间存在相互干扰。

(2)取模板，采用多重引物组(由引物对H2、引物对H3、引物对H4和引物对H5，共8条引物组成)进行PCR扩增。

反应体系组成和PCR扩增程序同步骤一的2。反应体系中，4种引物F的浓度均为0.4μM、4种引物R的浓度均为0.4μM。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。多重扩增效果非常好。

实施例2、引物以及标准品质粒的制备

一、引物的制备

分别制备以下各条引物(均为单链DNA分子)：

H1-F(序列表的序列1)：5’-GGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTC-3’；

H1-R(序列表的序列2)：5’-CCCAGGGCCTCACCACCAAC-3’；

H2-F(序列表的序列3)：5’-GTGGAAAAAGGCGGTATCGGTCAA-3’；

H2-R(序列表的序列4)：5’-CATGCCTTTATCGCCTTTTCTCCA-3’；

H3-F(序列表的序列5)：5’-AATCGCAGGGGTGGGCATAGG-3’；

H3-R(序列表的序列6)：5’-TGAGGGGTAAAGCAGGGGTGAAAC-3’；

H4-F(序列表的序列7)：5’-CCTTGAGCGCGGTTTGATTCTTG-3’；

H4-R(序列表的序列8)：5’-GTGGTGGCTTTGTTAGTGGGATGC-3’；

H5-F(序列表的序列9)：5’-AGAGCCTGCTGGTGGGGATTG-3’；

H5-R(序列表的序列10)：5’-AAGCCTTGTATGTCGGTGGTGGTA-3’；

H48-F(序列表的序列11)：5’-GCATCAGCAGGTAAAGGAGT-3’；

H48-R(序列表的序列12)：5’-CCTGCTTGATTTGCCTCATCA-3’。

F代表上游引物，R代表下游引物。上游引物的5’末端均标记生物素。下游引物的5’末端均标记地高辛。

H1-F与H1-R的靶序列位于人β-globin基因。

H2-F与H2-R的靶序列位于幽门螺杆菌烷基过氧化氢还原酶基因(alkylhydroperoxidereducatase gene，又称tsaA基因)。

H3-F与H3-R的靶序列位于幽门螺杆菌磷酸葡萄糖胺变位酶基因(phosphoglucosaminemutase gene)。

H4-F与H4-R的靶序列位于幽门螺杆菌鞭毛鞘粘附素基因(flagellar sheathadhesingene，又称hpaA基因)。

H5-F与H5-R的靶序列位于幽门螺杆菌cagA基因(西方型幽门螺杆菌cagA基因和东亚型幽门螺杆菌cagA基因的共有的保守区)。

H48-F与H48-R的靶序列位于幽门螺杆菌cagA基因(东亚型幽门螺杆菌cagA基因独有的特异区)。

H1-F和H1-R组成IPC引物对(又称H1引物对)。H48-F与H48-R组成cagA引物对(又称H48引物对)。H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F和H5-R组成HP引物组。

二、标准品质粒的制备

将序列表的序列13所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H1。

将序列表的序列14所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H2。

将序列表的序列15所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H3。

将序列表的序列16所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H4。

将序列表的序列17所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H5。

将序列表的序列18所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H48。

后续实施例中所述的6种标准品质粒均指的是标准品质粒H1、标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4、标准品质粒H5和标准品质粒H48。

实施例3、快速检测卡的制备

1、胶体金垫的制备

胶体金：上海晶都生物技术有限公司，货号为JD-59012；产品网址链接：https://www.biomart.cn/infosupply/30558508.htm？from＝search_1。羊抗兔IgG：Solarbio,货号为SPA134；产品形态为液态；产品网址链接：http://www.solarbio.com/goods-1558.html。兔抗地高辛抗体：Abcam，货号为ab30512；产品形态为液态；产品网址链接：https://www.abcam.cn/digoxin-antibody-ab30512.html。兔IgG：产品形态为干粉，纯度为每22.2mg干粉含10mg兔IgG；Solarbio，货号为SP034；产品形态为干粉；产品网址链接：https://www.solarbio.com/goods-1508.html。亲和素：invitrogen，货号为434323；产品形态为液态，规格为2.5mg/2ml；产品网址链接：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/434323？SID＝srch-hj-434323。

本实施例中采用的封闭剂溶液为20g/100ml BSA水溶液。实际应用中，可以作为封闭剂溶液的包括但不限于PEG溶液、Casein-Na溶液等。

复溶液：含30mM Tris，0.6g/100ml Casein-Na，0.5g/100ml PVP-40，0.2g/100mlBSA，0.1g/100ml PEG20000，2g/100ml蔗糖，2g/100ml海藻糖，余量为水。

稀释液：含0.5g/100ml Casein-Na，20mM EDTA-Na

(1)取1ml胶体金，加入6μl 0.2M K

(2)取步骤(1)得到的液相体系，通过加压的方式以雾状均匀喷在玻璃纤维素膜上，每平方厘米玻璃纤维素膜1μl，然后45℃烘干1h，即为胶体金垫，密封干燥保存。

2、检测垫的制备

兔IgG用稀释液溶解并稀释至1.0mg/ml(该浓度指的是经纯度换算后的兔IgG浓度)，得到C溶液。亲和素用稀释液稀释至0.5mg/ml，得到T溶液。

取硝酸纤维素膜，用C溶液在硝酸纤维素膜的上表面喷一条C线(C线线宽为1mm；C线线长方向，每厘米C线喷0.5μL C溶液)，用T溶液在硝酸纤维素膜的上表面喷一条T线(T线线宽为1mm；T线线长方向，每厘米T线喷0.5μL T溶液)，室温晾干，然后75℃烘干1h，即为检测垫，密封干燥保存。

3、快速检测卡的制备

快速检测卡包括卡壳、底板、样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫。沿样品流动方向，样品垫、胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上(相邻垫之间略重叠)。

沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度为0.42cm。试纸条的总长度为6cm，其中样品垫的长度为2cm，胶体金垫的长度为0.5cm，检测垫的长度为2cm，吸水垫的长度为2cm。C线靠近吸水垫、远离胶体金垫。T线靠近胶体金垫、远离吸水垫。C线和T线平行。C线和T线的垂直距离为0.7cm。

样品垫的材质为玻璃纤维膜。吸水垫的材质为吸水纸。

底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如PVC。

卡壳套设于试纸条外，具有检测窗和加样孔。加样孔位于样品垫上方。检测窗用于观察C线和T线的显色情况。

后续实施例中使用的快速检测卡均为本实施例制备的快速检测卡。

实施例4、反应体系的确定

本实施例中所用到的样本稀释液均同实施例6中的样本稀释液。

一、HP反应体系的确定

1、进行PCR

PCR反应体系(10μl)：模板、DNA聚合酶、引物、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。模板中提供的有效成分为6种标准品质粒。反应体系中，每种标准品质粒的含量均为32000拷贝/μl。

设置多种反应体系。不同反应体系采用的引物分别为：H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)。

PCR反应程序见表1。

表1

2、完成PCR后，取1μl产物加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

采用H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)时，T线未明显显色。采用H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)时，T线未明显显色。采用H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)时，T线显色但色暗。采用H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)时，T线未明显显色。采用H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)时，T线未明显显色。其他情况下，T线明显显色。各个情况下，C线均明显显色。

根据C线和T线的显色以及亮度，将各个引物的优化浓度确定为：H2-F 0.1μM、H2-R0.1μM；H3-F 0.1μM、H3-R 0.1μM；H4-F 0.15μM、H4-R 0.15μM；H5-F 0.1μM、H5-R0.1μM。采用上述优化浓度时，引物加入量较少从而节省成本，C线和T线都明显显色，且采用各引物时亮度相近。

二、cagA反应体系的确定

1、进行PCR

PCR反应体系(10μl)：模板、DNA聚合酶、H48-F、H48-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。模板中提供的有效成分为6种标准品质粒。反应体系中，每种标准品质粒的含量均为32000拷贝/μl。

设置4个反应体系。反应体系1中，H48-F和H48-R浓度均为0.45μM。反应体系2中，H48-F和H48-R浓度均为0.4μM。反应体系3中，H48-F和H48-R浓度均为0.2μM。反应体系4中，H48-F和H48-R浓度均为0.1μM。

PCR反应程序见表1。

2、完成PCR后，取1μl产物加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

采用4个反应体系时，C线均明显显色。采用反应体系1和反应体系2时，T线明显显色。采用反应体系3时，T线显色但色暗。采用反应体系4时，T线未明显显色。

将引物的优化浓度确定为：H48-F 0.45μM、H48-R 0.45μM。该浓度下条带亮度符合要求。

三、内标反应体系的确定

1、进行PCR

PCR反应体系(10μl)：模板、DNA聚合酶、H1-F、H1-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。模板中提供的有效成分为6种标准品质粒。反应体系中，每种标准品质粒的含量均为32000拷贝/μl。

设置4个反应体系。反应体系1中，H1-F和H1-R浓度均为0.45μM。反应体系2中，H1-F和H1-R浓度均为0.4μM。反应体系3中，H1-F和H1-R浓度均为0.2μM。反应体系4中，H1-F和H1-R浓度均为0.1μM。

PCR反应程序见表1。

2、完成PCR后，取1μl产物加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

采用4个反应体系时，C线均明显显色。采用反应体系1和反应体系2时，T线明显显色。采用反应体系3时，T线显色但色暗。采用反应体系4时，T线未明显显色。

将引物的优化浓度确定为：H1-F 0.45μM、H1-R 0.45μM。该浓度下条带亮度符合要求。

实施例5、关于引物二聚体

本实施例中所用到的样本稀释液均同实施例6中的样本稀释液。

一、PCR扩增

IPC反应体系的组成(10μl)：DNA聚合酶、H1-F、H1-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H1-F的浓度为0.45μM，H1-R的浓度为0.45μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

HP反应体系(10μl)：DNA聚合酶、H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F、H5-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H2-F的浓度为0.1μM，H2-R的浓度为0.1μM，H3-F的浓度为0.1μM，H3-R的浓度为0.1μM，H4-F的浓度为0.15μM，H4-R的浓度为0.15μM，H5-F的浓度为0.1μM，H5-R的浓度为0.1μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

cagA反应体系的组成(10μl)：DNA聚合酶、H48-F、H48-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H48-F的浓度为0.45μM，H48-R的浓度为0.45μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

PCR反应程序见表1。

二、完成PCR后，取1μl产物加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

结果见图4。图4中，因为未加入模板，所以T线理论上不显色，如果显色的话表明有引物二聚体形成。结果表明，有一定概率形成引物二聚体,从而造成检测结果的假阳性。

三、完成PCR后，将PCR产物放置于冰上，立即加入乙醇并使其在体系中的体积百分含量为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％，漩涡震荡混匀后取1μl加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

结果表明，加入乙醇后(乙醇在体系中的体积百分含量为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％)T线均不显色，即加入乙醇可以有效抑制引物二聚体的形成，无假阳性。乙醇在体系中的体积百分含量为1％时的照片见图5。

四、完成PCR后，将PCR产物放置于冰上，分别于放置5min、10min、20min、30min、45min、1h或2h后加入乙醇并使其在体系中的体积百分含量为1.0％，漩涡震荡混匀后取1μl加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

结果表明：在45min以内加入乙醇T线均不显色，可以有效抑制引物二聚体的形成；放置1h或2h后加入乙醇，不能有效抑制引物二聚体的形成。

五、PCR扩增

基本同步骤一，与步骤一的差异仅在于反应体系中加入模板。模板中提供的有效成分为6种标准品质粒。反应体系中，每种标准品质粒的含量均为32000拷贝/μl。

完成PCR后，将PCR产物放置于冰上，立即加入乙醇并使其在体系中的体积百分含量为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％，漩涡震荡混匀后取1μl加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

结果表明，乙醇在体系中的体积百分含量为1.0％时，T线显色最亮。乙醇浓度为2.5％以上时，T线显色明显变暗，即加入乙醇浓度过高影响PCR扩增产物与兔抗地高辛抗体的结合。

实施例6、胶体金试剂盒的制备和使用方法

一、胶体金试剂盒的制备

胶体金试剂盒包括6个组件，即样本稀释液、快速检测卡、PCR预混液、乙醇、阳性对照品和阴性对照品。

1、样本稀释液(pH7.2-7.4)：含十二水合磷酸氢二钠0.2027mol/L、磷酸二氢钾0.0353mol/L、氯化钠2.7379mol/L、氯化钾0.0537mol/L，余量为水。

2、快速检测卡。

3、PCR预混液

IPC-PCR预混液：DNA聚合酶、H1-F、H1-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。预混液中，引物H1-F的浓度为1/2μM、引物H1-R的浓度为1/2μM。预混液中，dNTP的浓度为1/3mM。9μl预混液中，DNA聚合酶的含量为0.5U。9μl预混液中，10×Buffer的加入量为1μl。

HP-PCR预混液：DNA聚合酶、H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F、H5-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。预混液中，引物H2-F的浓度为1/9μM、引物H2-R的浓度为1/9μM、引物H3-F的浓度为1/9μM、引物H3-R的浓度为1/9μM、引物H4-F的浓度为1/6μM、引物H4-R的浓度为1/6μM、引物H5-F的浓度为1/9μM、引物H5-R的浓度为1/9μM。预混液中，dNTP的浓度为1/3mM。9μl预混液中，DNA聚合酶的含量为0.5U。9μl预混液中，10×Buffer的加入量为1μl。

cagA-PCR预混液：DNA聚合酶、H48-F、H48-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。预混液中，引物H48-F的浓度为1/2μM、引物H48-R的浓度为1/2μM。预混液中，dNTP的浓度为1/3mM。9μl预混液中，DNA聚合酶的含量为0.5U。9μl预混液中，10×Buffer的加入量为1μl。

4、乙醇(作为PCR反应抑制剂)。

5、阳性对照品：标准品质粒H1、标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4、标准品质粒H5、标准品质粒H48，混合,六种质粒的浓度均为32000拷贝/μL。

6、阴性对照品：灭菌超纯水。

二、胶体金试剂盒的使用方法

1、提取待测样本的总DNA，作为模板DNA，分别进行三个体系的PCR。

IPC反应体系(10μl)：1μl模板(DNA含量为20ng)，9μl IPC-PCR预混液。

HP反应体系(10μl)：1μl模板(DNA含量为20ng)，9μl HP-PCR预混液。

cagA反应体系的组成(10μl)：1μl模板(DNA含量为20ng)，9μl cagA-PCR预混液。

PCR反应程序见表1。

2、完成PCR后，体系置于冰上，尽快加入乙醇并使其在体系中的体积百分含量为1％，混匀后取1μl加入至400μl样本稀释液中，充分混合，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置1-2min，然后读取结果。

3、如果C线显色，说明试纸条结果可信。采用IPC引物对时，如果T线显色，说明样本可信。采用HP引物组时，如果T线显色，说明待测样本中具有幽门螺杆菌。采用cagA引物对时，如果T线显色，说明待测样本中具有东亚型幽门螺杆菌。

三、胶体金试剂盒的工作原理

快速检测卡的胶体金垫上，标记有胶体金的羊抗兔IgG与兔抗地高辛抗体结合。快速检测卡的C线上具有兔IgG，可以捕获胶体金的羊抗兔IgG从而显色。快速检测卡的T线上具有亲和素。模板中存在靶标片段时，引物有效扩增，从而扩增产物(双链DNA片段)的两端分别标记上生物素和地高辛，地高辛与兔抗地高辛抗体结合从而标记上胶体金，生物素和亲和素结合从而被T线捕获，从而T线实现显色。

实施例7、检测幽门螺杆菌以及东亚型幽门螺杆菌

42例临床样本：样本为通过胃镜获取的患者的胃部组织或黏液，均已由医院确诊为幽门螺杆菌阳性。患者均为知情同意的志愿者。

一、分别提取各个临床样本的总DNA。

二、进行PCR

每个临床样本的总DNA分别进行七个体系的PCR。

IPC反应体系：同实施例6的IPC反应体系。

HP反应体系：同实施例6的HP反应体系。

cagA反应体系：同实施例6的cagA反应体系。

H2反应体系(10μl)：模板(DNA含量为20ng)、DNA聚合酶、H2-F、H2-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H2-F的浓度为0.1μM，H2-R的浓度为0.1μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

H3反应体系(10μl)：模板(DNA含量为20ng)、DNA聚合酶、H3-F、H3-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H3-F的浓度为0.1μM，H3-R的浓度为0.1μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

H4反应体系(10μl)：模板(DNA含量为20ng)、DNA聚合酶、H4-F、H4-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H4-F的浓度为0.15μM，H4-R的浓度为0.15μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

H5反应体系(10μl)：模板(DNA含量为20ng)、DNA聚合酶、H5-F、H5-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H5-F的浓度为0.1μM，H5-R的浓度为0.1μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。

PCR反应程序见表1。

三、完成PCR后，体系置于冰上，尽快加入乙醇并使其在体系中的体积百分含量为1％，混匀后取1μl加入至400μl样本稀释液中，充分混合，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置1-2min，然后读取结果。

C线均显色。

对于42例临床样本，IPC反应体系均T线显色。

对于42例临床样本，HP反应体系均T线显色，即检测结果均与临床确诊结果一致。对于42例临床样本中有1例样本(样本9)，H2反应体系T线不显色，出现了假阴性的结果。对于42例临床样本中有2例样本(样本9和样本28)，H3反应体系T线不显色，出现了假阴性的结果。对于42例临床样本中有3例样本(样本9、样本13和样本28)，H4反应体系T线不显色，出现了假阴性的结果。对于42例临床样本中有1例样本(样本9)，H5反应体系T线不显色，出现了假阴性的结果。样本28的结果见图6。图6中,A为HP反应体系的结果，B为H4反应体系的结果。结果表明，HP引物组可以同时扩增幽门螺杆菌DNA中的多个靶标片段，从而有效避免DNA突变导致单个引物对扩增出现假阴性结果的问题，提高幽门螺杆菌的检出率。

对于42例临床样本中有27例样本cagA反应体系T线显色。对该42例样本进行PCR扩增和测序，结果完全一致。样本26和样本29的检测结果见图7。图7中：A为样本26，B为样本29；试纸条顺序依次为IPC反应体系、HP反应体系和cagA反应体系。样本26：IPC反应体系T线显色,HP反应体系T线显色,cagA反应体系T线不显色，患者感染幽门螺杆菌，但该幽门螺杆菌为非东亚型。样本29：IPC反应体系T线显色,HP反应体系T线显色,cagA反应体系T线显色，患者感染东亚型幽门螺杆菌。

实施例8、临床样本检测

取三个临床样本(52号、53号和82号)。临床样本为通过胃镜获取的患者的胃部组织或黏液，均已由医院确诊为幽门螺杆菌阳性。患者均为知情同意的志愿者。

采用实施例6制备的试剂盒并按照实施例6的使用方法进行操作。

检测结果见图8。图8中：A为52号样本，B为53号样本，C为82号样本；试纸条顺序依次为IPC反应体系、HP反应体系和cagA反应体系。52号：IPC反应体系T线显色,HP反应体系T线不显色,cagA反应体系T线不显色，患者未感染幽门螺杆菌。53号：IPC反应体系T线显色,HP反应体系T线显色,cagA反应体系T线不显色，患者感染幽门螺杆菌，但该幽门螺杆菌为非东亚型。82号：IPC反应体系T线显色,HP反应体系T线显色,cagA反应体系T线显色，患者感染东亚型幽门螺杆菌。

三个临床样本(52号、53号和82号)进一步由医院确诊，确诊结果与试剂盒检测结果一致。

实施例9、两种方法的比较

取40例临床样本。临床样本为通过胃镜获取的患者的胃部组织或黏液，均已由医院确诊为幽门螺杆菌阳性。患者均为知情同意的志愿者。

一、采用试剂盒进行检测

采用实施例6制备的试剂盒并按照实施例6的使用方法进行操作(只进行IPC反应体系和HP反应体系的PCR扩增)。

HP反应体系的结果见图9。

二、进行普通PCR联合电泳检测

取步骤一中得到的PCR产物，进行3％琼脂糖凝胶电泳。

结果见图10。

结果见表2。采用试剂盒进行检测具有如下优势：完成PCR扩增后，读取结果的时间仅需2-5min，具有操作简便、快捷，诊断敏感，检出率高等优点，作为用于临床检测幽门螺杆菌辅助诊断，可显著提高疾病的检出率和准确率，有利于疾病的早期发现，早期治疗；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用支出，提高被检者的生存质量。

表2

实施例10、

制备引物H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F和H5-R，与实施例2中相应引物的差异仅在于用FITC代替地高辛。

按照实施例3制备快速检测卡，差异仅在于用兔抗FITC抗体代替兔抗地高辛抗体。

一、进行PCR扩增

HP反应体系(10μl)：模板、DNA聚合酶、H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F、H5-R、10×Buffer、dNTP、余量为水。反应体系中H2-F的浓度为0.1μM，H2-R的浓度为0.1μM，H3-F的浓度为0.1μM，H3-R的浓度为0.1μM，H4-F的浓度为0.15μM，H4-R的浓度为0.15μM，H5-F的浓度为0.1μM，H5-R的浓度为0.1μM，dNTP的浓度为0.3mM，10×Buffer的浓度为1×，DNA聚合酶的含量为0.5U。模板中提供的有效成分为6种标准品质粒。反应体系中，每种标准品质粒的含量均为32000拷贝/μl。

PCR反应程序见表1。

二、完成PCR后，取1μl产物加入至400μl样本稀释液中，充分混匀，然后吸取70μl，滴加至快速检测卡的加样孔，水平放置2-5min，然后读取结果。

结果见图11，不能实现有效捕获。

实施例11、

16株菌的信息如下(北京北纳创联生物技术研究院)：脆弱拟杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、两歧双歧杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、白假丝酵母菌、甲型溶血性链球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺菌、乙型溶血性链球菌、厌氧消化链球菌。

3株菌的信息如下(自行分离)：大肠杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌。

采用实施例6制备的试剂盒并按说明操作，分别对各菌株进行检测。

各菌株的结果均为幽门螺杆菌阴性。

各菌株的结果均为东亚型幽门螺杆菌阴性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳祥伴科技有限公司

<120> 用于快速检测目标生物或目的基因的试剂盒

<130> GNCYX191117

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gggagggctg agggtttgaa gtc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cccagggcct caccaccaac 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtggaaaaag gcggtatcgg tcaa 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

catgccttta tcgccttttc tcca 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aatcgcaggg gtgggcatag g 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgaggggtaa agcaggggtg aaac 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ccttgagcgc ggtttgattc ttg 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtggtggctt tgttagtggg atgc 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

agagcctgct ggtggggatt g 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aagccttgta tgtcggtggt ggta 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gcatcagcag gtaaaggagt 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cctgcttgat ttgcctcatc a 21

<210> 13

<211> 327

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gggagggctg agggtttgaa gtccaactcc taagccagtg ccagaagagc caaggacagg 60

tacggctgtc atcacttaga cctcaccctg tggagccaca ccctagggtt ggccaatcta 120

ctcccaggag cagggagggc aggagccagg gctgggcata aaagtcaggg cagagccatc 180

tattgcttac atttgcttct gacacaactg tgttcactag caacctcaaa cagacaccat 240

ggtgcacctg actcctgagg agaagtctgc cgttactgcc ctgtggggca aggtgaacgt 300

ggatgaagtt ggtggtgagg ccctggg 327

<210> 14

<211> 276

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gtggaaaaag gcggtatcgg tcaagtgtct ttccctatgg tggctgatat cactaagagc 60

atttctagag actatgatgt gctgtttgaa gaagcgatcg ctttgagagg cgcttttttg 120

attgataaaa acatgaaagt aagacatgca gtgatcaatg acttgccatt aggtaggaat 180

gcagatgaaa tgcttcgcat ggtagacgct ctcttacact ttgaagaaca tggtgaagta 240

tgcccagcag gttggagaaa aggcgataaa ggcatg 276

<210> 15

<211> 218

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aatcgcaggg gtgggcatag gccctatttg aatcacatta tagcctatgg aagttagagc 60

gctcactaaa gcgttttcta ccatatagcc gctttttctg gtgtctttac cgattagaat 120

tttattcgtt tgagaatgtt ttttaaaata caatccggca gcaatgccta aacgcatcac 180

aaacatgggg gtgagtttca cccctgcttt acccctca 218

<210> 16

<211> 199

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ccttgagcgc ggtttgattc ttgaatttgt tttcatactc tttagcaata ttatcgctgt 60

attgaaaagc tggccttaaa agcaaaatct tttcatctaa cgcttgaact ttctcgctag 120

ctggatggta attcaatttc aaagcgactt cattggtttc aataatatgc gggctgcatc 180

ccactaacaa agccaccac 199

<210> 17

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

agagcctgct ggtggggatt ggcttgatat ttttctctca tttgtattca acaaaaaaca 60

atcttccgat ctcaaagaaa cgctccatca agagccaagg cctgattttg aacaaaatat 120

agccactacc accaccgaca tacaaggctt 150

<210> 18

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gcatcagcag gtaaaggagt gggcggtttc agtggagcag ggcgatcagc tagccctgaa 60

cccatttacg ctacaattga ttttgatgag gcaaatcaag cagg 104