用于组织脱细胞的复合溶液、其制备方法以及组织脱细胞的方法

技术领域

本发明涉及脱细胞技术领域，具体而言，涉及用于组织脱细胞的复合溶液、其制备方法以及组织脱细胞的方法。

背景技术

在骨缺损的组织工程修复中，天然骨组织致密坚硬，胶原含量与无机组分构成的优势，在临床修复中具有广泛的前景。但是由于骨组织中的细胞和其他蛋白成分的抗原反应，限制了异体人工骨在临床中的应用。通常，人们通过脱细胞的方式，灭活异体骨组织中生物活性物质，减少免疫原性。

现行脱细胞基质的制备方法主要包括：1物理法；2化学法；3酶法。物理法指的是通过冷冻，高压，超声波，渗透压改变、电流等物理方式破坏细胞，其优点在于得到的脱细胞基质没有其他外加成分的残留，但这类方法的最大缺点是：在破坏细胞的同时也不同程度的破坏了细胞外基质的超微结构，通常需要联合其他脱细胞方法。化学法包括使用某些酸、碱、表面活性剂等化学方法裂解细胞。这类方法其优点在于脱细胞过程短，速度快，但这类方法同样会破坏细胞外基质的超微结构，并且还会造成各种可溶性基质成分(如蛋白多糖)的丢失。酶法主要使用各种蛋白酶(如胰蛋白酶，中性蛋白酶)核酸酶(核酸外切酶，核酸内切酶)，通过水解细胞蛋白成分和核酸成分达到破坏细胞的目的。蛋白酶可以有效地去除细胞成分，但由于胰蛋白酶和中性蛋白酶的作用底物比较广泛，造成细胞外基质中的结构和功能蛋白大量降解。核酸酶选择性的降解核酸，不会造成细胞外基质成分的破坏，但其分子量过大，极易引起免疫反应。磷脂酶法虽可特异性的水解细胞膜磷脂，但其代谢产物一溶血卵磷脂具有极强的溶血性，如果清洗不彻底会产生一定溶血毒性。总而言之，目前的脱细胞方法容易出现以下问题：(1)组织的微观结构容易被破坏；(2)降低组织的机械性能，特别是骨组织时，降低骨组织的机械性能；(3)脱细胞不彻底，容易引发抗原反应。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供用于组织脱细胞的复合溶液、其制备方法以及组织脱细胞的方法。本发明实施例提供一种用于脱细胞的复合溶液，其能够维持组织的微观结构，减少脱细胞溶液对组织微观结构的破坏，同时，提升脱细胞效果，减少使用组织时抗原反应的发生。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种用于组织脱细胞的复合溶液，其活性成分包括蛋白溶解酶、核酸酶、醇类物质以及阴离子表面活性剂，所述蛋白溶解酶、所述核酸酶、所述醇类物质以及所述阴离子表面活性剂的质量比为(0.005-0.008)：(0.003-0.005)：(3-5)：(2-8)。

在可选的实施方式中，以质量百分比计，其包括0.005-0.008％所述蛋白溶解酶、0.003-0.005％所述核酸酶，3-5％所述醇类物质、2-8％所述阴离子表面活性剂，其余量为辅料。

在可选的实施方式中，所述辅料包括缓冲液、渗透压调节剂、防腐剂和分散剂；

优选地，所述缓冲液包括磷酸氢盐、磷酸二氢盐以及螯合剂；

优选地，所述缓冲液包括磷酸氢二钠十二水、磷酸二氢钠二水以及EDTA；

优选地，所述渗透压调节剂为氯化钠；

优选地，所述分散剂为吐温，优选为吐温20。

在可选的实施方式中，以质量百分比计，其包括0.005-0.008％所述蛋白溶解酶、0.003-0.005％所述核酸酶，3-5％所述醇类物质、2-8％所述阴离子表面活性剂、6-14％缓冲液、5-12％渗透压调节剂、0.03-0.05％防腐剂、0.1-0.8％分散剂，其余量为溶剂。

在可选的实施方式中，以质量百分比计，其包括0.005-0.008％所述蛋白溶解酶、0.003-0.005％所述核酸酶，3-5％所述醇类物质、2-8％所述阴离子表面活性剂、4-8％磷酸氢二钠十二水、1-3％磷酸二氢钠二水、1-3％EDTA、5-12％氯化钠、0.1-0.8％吐温、0.03-0.05％proclin300，其余量为水。

在可选的实施方式中，所述蛋白溶解酶包括蛋白酶K；

优选地，核酸酶包括限制性内切酶；

优选地，所述醇类物质为一元醇，优选为C1-C5一元醇；更优选为甲醇、乙醇或丙醇，最优选为乙醇；

优选地，所述阴离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。

在可选的实施方式中，以质量百分比计，其包括0.005-0.008％蛋白酶K、0.003-0.005％限制性内切酶，3-5％乙醇、2-8％十二烷基硫酸钠、4-8％磷酸氢二钠十二水、1-3％磷酸二氢钠二水、1-3％EDTA、5-12％氯化钠、0.1-0.8％吐温、0.03-0.05％proclin300，其余量为水。

第二方面，本发明实施例提供一种前述实施方式任一项所述的用于组织脱细胞的复合溶液的制备方法，制备步骤包括：将形成前述实施方式任一项所述的用于组织脱细胞的复合溶液的原料按配比混合形成所述用于组织脱细胞的复合溶液。

第三方面，本发明实施例提供一种组织脱细胞的方法，包括：利用前述实施方式任一项所述的用于组织脱细胞的复合溶液处理组织，脱除所述组织的细胞；

优选地，所述组织为骨组织。

在可选的实施方式中，包括将组织浸泡于所述复合溶液内，而后恒温处理，接着，再去除组织表面和内部残留的所述复合溶液，而后再进行冻干。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种复合溶液，其通过蛋白溶解酶、核酸酶、醇类物质以及阴离子表面活性剂，并控制上述4种活性成分的配比，使得复合溶液提高脱细胞比例的同时，增强对胶原蛋白，弹性蛋白等支架蛋白的保护，维持蛋白的三维结构，继而保护组织微观结构的完整性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为未进行脱细胞的硬组织切片图；

图2为经过复合溶液脱除细胞的组织切片图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

现有技术中脱细胞的方法采用物理法、化学法或者酶法都可能会存在导致组织的微观结构被破坏以及脱细胞不完全的缺陷，继而导致脱细胞后的组织的使用受到限制，因此，本发明实施例提供一种用于组织脱细胞的复合溶液，该复合溶液不仅仅能够有效提升脱细胞的效果，还可以保持组织的微观结构。

具体地，该复合溶液的活性成分包括蛋白溶解酶、核酸酶、醇类物质以及阴离子表面活性剂，所述蛋白溶解酶、所述核酸酶、所述醇类物质以及所述阴离子表面活性剂的质量比为(0.005-0.008)：(0.003-0.005)：(3-5)：(2-8)。采用蛋白溶解酶、核酸酶、醇类物质以及阴离子表面活性剂复配，能够使得上述4种物质相互作用，同时对组织的脱细胞进行化学和酶处理，提升脱细胞效率，但是又能保证组织微观结构的完整性，不破坏细胞外基质的微观结构。且进一步上述四种物质的比例，能够进一步促进上述4种物质的作用，进一步保证脱细胞的效果和微观结构的完整性。

进一步地，以质量百分比计，该复合溶液包括0.005-0.008％所述蛋白溶解酶、0.003-0.005％所述核酸酶，3-5％所述醇类物质、2-8％所述阴离子表面活性剂，其余量为辅料。采用上述比例且添加有辅料，能够进一步促进复合溶液的效果。

其中，辅料包括缓冲液、渗透压调节剂、防腐剂和分散剂；所述辅料还包括溶剂；所述缓冲液包括磷酸氢盐、磷酸二氢盐以及螯合剂；所述缓冲液包括磷酸氢二钠十二水、磷酸二氢钠二水以及EDTA；所述渗透压调节剂为氯化钠；所述分散剂为吐温，优选为吐温20。上述物质不仅仅起到对应的辅料功能，还能促进上述活性成分的功效，例如吐温，不仅仅有利于各物质的分散，其还可以为蛋白溶解酶以及核酸酶等提供合适的环境，有利于活性成分发挥功效，提升脱细胞效果，且能减少醇类溶剂、阴离子表面活性剂、酶、防腐剂等物质对细胞外基质的超微的三维结构的破坏，提升微观结构的完整性。还例如渗透压调节剂不仅仅能够调节复合溶液的渗透压，还可以进一步促进活性成分发挥其功效。

需要说明的是，虽然本发明实施例仅列举了部分辅料可以选择的物料，例如分散剂为吐温，优选为吐温20，但是其他现有的可以起到对应功效的辅料也是采用的，例如分散剂还可以采用吐温80等，缓冲溶液还可以选择Tris-HCl，或者其他缓冲体系。

具体地，含有各个辅料时，复合溶液的配比为：以质量百分比计，其包括0.005-0.008％所述蛋白溶解酶、0.003-0.005％所述核酸酶，3-5％所述醇类物质、2-8％所述阴离子表面活性剂、6-14％缓冲液、5-12％渗透压调节剂、0.03-0.05％防腐剂、0.1-0.8％分散剂，其余量为溶剂。更具体地，以质量百分比计，其包括0.005-0.008％所述蛋白溶解酶、0.003-0.005％所述核酸酶，3-5％所述醇类物质、2-8％所述阴离子表面活性剂、4-8％磷酸氢二钠十二水、1-3％磷酸二氢钠二水、1-3％EDTA、5-12％氯化钠、0.1-0.8％吐温、0.03-0.05％proclin300，其余量为水。

采用上述配比的辅料和活性成分能够进一步提升复合溶液的效果，提升脱细胞效率，保证微观结构的完整性。

进一步地，具体可以采用的活性成分如下：蛋白溶解酶包括蛋白酶K；核酸酶包括限制性内切酶；所述醇类物质为一元醇，优选为C1-C5一元醇；更优选为甲醇、乙醇或丙醇，最优选为乙醇；所述阴离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。采用上述物质能够进一步保证4种活性成分相互协同作用，继而保证复合溶液的效果。

此时，复合溶液的配比如下：以质量百分比计，其包括0.005-0.008％蛋白酶K、0.003-0.005％内切酶，3-5％乙醇、2-8％十二烷基硫酸钠、4-8％磷酸氢二钠十二水、1-3％磷酸二氢钠二水、1-3％EDTA、5-12％氯化钠、0.1-0.8％吐温、0.03-0.05％proclin300，其余量为水。

本发明实施例还包括复合溶液的制备方法，将上述形成该复合溶液的原料按照配比进行混合，使得固体物料都溶解在溶剂(水)中，得到对应配比的复合溶液。

进一步地，本发明实施例还提供一种组织脱细胞的方法，包括：利用上述用于组织脱细胞的复合溶液处理组织，脱除所述组织的细胞；可选择的组织包括骨组织等。

具体地，脱细胞的方法包括以下步骤：将组织浸泡于上述复合溶液中，且复合溶液要浸没组织，继而保证组织充分脱细胞，减少组织脱细胞不充分导致的抗原反应。而后恒温处理，一般的温度为37℃左右，即能够保证脱细胞效果，又不会对组织造成太大影响，一般恒温处理的时间为12小时左右。而后再去除组织表面和内部残留的所述复合溶液，具体去除复合溶液的方法包括但不限于采用流水冲洗以及透析等，而后对组织进行冻干。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种复合溶液，其成分如下表：

上述物质混合均匀得到上述复合溶液。

实施例2

本实施例提供一种复合溶液，其成分如下表：

实施例3

本实施例提供一种复合溶液，其成分如下表：

实施例4

本实施例提供一种复合溶液，其成分如下表：

实验例1

样品：实施例1；

方法：将剔除骨膜、脂肪和肌肉组织后的鲜骨放置在是实施例1的溶液中，注意样品溶液要没过骨组织。37℃搅拌悬浮液恒温过夜。分别经过流水冲洗和透析，去除骨组织表面和内部残留的混合液。置于-20℃冰箱冷冻72小时后，用冷冻干燥机去除水分。

结果参见图1-图2，其中，图1为未进行脱细胞的硬组织切片图；图2为经过复合溶液脱除细胞的组织切片图，由图1和图2可知，图片为多聚甲醛固定后，硬组织切片的HE伊红染色结果。图中未经过脱细胞液处理的骨组织，经过HE伊红染色后可以看多很多粉红色的细胞膜组织结构，细胞结构完整，经过脱细胞液处理后的骨组织材料，骨组织结构保持完整，但是细胞膜已经损坏，不具备完整的细胞结构，细胞内具有免疫原性的物质已经完全脱离，只保留少量破碎的细胞膜碎片，骨组织脱细胞液具有良好的脱细胞作用，适合作为骨组织脱细胞工作液对新鲜骨进行处理。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。