非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于动物病原分子诊断技术领域，涉及一种非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fevervirus，ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。该病病程短，死亡率高，对养猪业危害甚大，为世界动物卫生组织（OIE）规定须通报动物疫病，也是我国重点防控的一类动物疫病。2018年我国在辽宁省首次报告发现ASF疫情，随后其扩散蔓延到全国其他地区，给我国养猪业带来了极大经济损失。由于ASF的临床症状和病理变化很难与猪瘟等其他疫病区分，并且目前没有有效疫苗可用，因此快速准确的实验室诊断具有重要意义。经典的血吸附试验、病毒分离鉴定等检测诊断方法，对生物安全设施条件要求较高，在试验特异性以及检测时间等方面也有所限制。相比之下，荧光PCR具有较高的敏感性和特异性，可同时快速检测高通量样品，被广泛应用于ASF诊断和检测。

目前，主要有三个因素影响荧光PCR的实验结果，即标本因素（样本的采集部位、样品的质量以及样本的保存方法、保存时间等）、人员因素（实验人员的工作态度、技术水平以及在实际操作过程中的操作习惯等）、仪器因素（仪器设备的稳定性、均匀度、光敏感感应管、加热退火的模块和时间、激发灯管的强度、数据分析的难易程度）。针对以上技术问题，本发明通过设计ASFV VP72基因、外源基因、内源基因三重特异性引物与探针，监测样本采集、提取和扩增的全过程，解决荧光PCR检测过程中因采样不规范、核酸提取操作失误造成的假阴性、假阳性现象，提高检测结果的准确性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒，包括荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照、外源基因标准液、阴性提取对照液；所述荧光PCR反应液包含2×TaqMan® Fast Advanced Master Mix及VP72基因、外源基因、内源基因的上、下游引物和探针。其中，VP72基因为非洲猪瘟病毒结构蛋白VP72基因片段，外源基因为人工合成的特异性基因片段（WY基因）、内源为猪肌动蛋白β-actin基因片段（Pactin基因）。

上述三对特异性引物序列为：

VP72-F：5’-GTGGAAGGGTATGTAAGAGCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

VP72-R：5’-AATGTTTTTAATAATAGGTAATGTG-3’， 如SEQ ID NO.2所示；

WY-F：5’-CGGGTGATTCGCAAGATCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

WY-R：5’-CCAGTGTAGAGAAGGAAAAT-3’ ，如SEQ ID NO.4所示；

Pactin-F：5’-TTGTCATGGACTCTGGGGATGG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

Pactin-R：5’-AGTCCTGCGGCATCCACGAGACCA-3’，如SEQ ID NO.6所示。

特异性探针序列为：

VP72-P：5’-FAM-TTGATGGAAACTTATCGATAAGATTG-TAMRA-3’，如SEQ ID NO.7所示；

WY-P：5’-VIC-GCAGGTCTGTCCGTTCAACAGGGGAT-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.8所示；

Pactin-P：5’-ROX-TCACCGCTTCCGGTGTCCAGAGGC-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.9所示，其中，VP72基因探针、WY基因探针、Pactin基因探针中的FAM、VIC、ROX为荧光报告基团，TAMRA、BHQ1、BHQ2为荧光淬灭基团。

所述非洲猪瘟病毒结构蛋白VP72基因片段的核苷酸序列为：

TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATTGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTATCGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAAATGTTTTTAATAATAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGGGGCTAATATCCGATATAGATGAACATGCGTCTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCTTATCTCTGCGTGGTGAGTAGGCTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGATTTTGATCGGAGATGTTC，如SEQ IDNO.10所示；

所述人工合成的特异性基因片段的核苷酸序列为：

ATAGTCCTAATCCCGGGTGATTCGCAAGATCTTGACAGCAGGTCTGTCCGTTCAACAGGGGATTGTTCGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTAGAGAAGGAAAATTGTAGACGAAGGGTCGAAAGCTCAAGGACAATTAGGCTGGTTGGAGAATAAAGATATTGACTTTTCTTGGAAAGTGGCGCAGTCAAGTATTTGGAAGGGCACGGGTTCCGTTTTGAAGTCAAGAATAGACATAGAAGTTGATGATGCTGAGCAATTCAATATCTTGCTAGCTTCCATCTTGGCTCAAATTTGGGCGTGATGGAGTGAAGCGCCTT，如SEQ ID NO.11所示；

所述猪肌动蛋白β-actin基因片段的核苷酸序列为：

AGACCTTCAACACGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGGCCGCACCACTGGCATTGTCATGGACTCTGGGGATGGGGTCACCGCTTCCGGTGTCCAGAGGCGCTCTTCCAGCCCTCCTTCTTGGGCATGGAGTCCTGCGGCATCCACGAGACCACCTTCAACTCGATCATGAAGTGCGACGTGGACATCAGGAAGGACCTCTACGCCAACACGGTGCTGTCTGGCGGGAC，如SEQ ID NO.12所示。

上述试剂盒中，所述阳性对照为含有阳性质粒pMD18T-VP72-WY-β-actin的TE缓冲液，DNA含量为1×10

本发明还提供了上述非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样本DNA模板；

（2）对待检样本DNA模板进行荧光PCR扩增，反应体系为：

2×TaqMan® Fast Advanced Master Mix 12.5μL

VP72-F/R 各0.5μL

WY-F/R 各0.5μL

Pactin-F/R 各0.5μL

VP72-P 0.5μL

WY-P 0.75μL

Pactin-P 0.25μL

DNA模板 5μL

ddH

（3）在多通道荧光PCR仪上进行检测，选择荧光信号FAM、VIC和ROX，反应条件为：50℃反应2min；95℃反应3min；95℃反应10s，58℃反应20s，重复45个循环；

（4）结果判定：

实验成立条件：

阳性对照：Ct值≤30；

阴性对照：无Ct值；

阴性对照提取：VP72基因、Pactin基因探针无Ct值，WY基因探针Ct值=质控Ct值±3；

在实验成立的情况下，按照如下方法判定：

如果VP72基因探针和Pactin基因探针Ct值≤45，WY基因探针Ct值=阴性对照提取Ct值±4，则该样品中存在非洲猪瘟病毒；

如果VP72基因探针无Ct值，Pactin基因探针Ct值≤45，WY基因探针Ct值=阴性对照提取Ct值±4，则该样品中不存在非洲猪瘟病毒；

如果VP72基因探针Ct值≤45，Pactin基因探针无Ct值，WY基因探针Ct值=阴性对照提取Ct值±4，则该样品污染，需重新采样核酸提取后再进行检测；

如果WY基因探针Ct值超出阴性对照提取Ct值±4范围，无论VP72基因探针和Pactin基因探针有无Ct值，均为无效结果，表明核酸提取异常或样本中有PCR抑制剂，建议重新采样核酸提取或稀释核酸样本后再进行检测。

本发明提供的非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒具有以下优点和效果：

（1）本发明通过设置内源基因作为整个检测过程中的内部质控，监测样本采集、提取和扩增的全过程；设置外源基因作为核酸提取过程中的外部阳性质控，将外源基因添加于样本核酸提取过程中伴随着样本一起进行核酸提取，根据外源基因PCR反应Ct值的变化来监测核酸提取试剂盒的核酸提取效果，增大了检测结果的准确性，减少了假阴性结果。

（2）本发明以VP72基因高度保守区域序列设计特异性引物、探针，合成的引物、探针与非洲猪瘟主要流行基因型病毒基因序列进行同源性比对分析，靶标序列能够覆盖目前所有非洲猪瘟病毒的基因型；与美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中的非洲猪瘟病毒基因序列进行Blast分析，均可正确匹配。

（3）本发明以猪肌动蛋白β-actin基因作为内源基因，它在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时用来做参照物，可增加了检测结果的准确性。

（4）本发明为我国非洲猪瘟病毒的临床检测和实验室诊断提供了新手段，该试剂盒操作便捷、灵敏度高、特异性强、检测时间短，可用于生产实践中对非洲猪瘟病毒的疫情监控、鉴别诊断以及疫病的净化。

附图说明

图1为非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒两个基因不同拷贝数的扩增曲线，1-8分别代表9×10

图2为VP72基因引物、探针与不同ASFV序列进行同源性比对分析结果。

图3为VP72基因引物、探针在NCBI中的Blast的部分结果。

图4为非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒两个基因不同样本的扩增曲线，1-14分别代表健康猪全血（N1）、健康猪血清（N2）、健康猪肌肉（N3）、健康猪脾脏（N4）、健康猪淋巴结（N5）、猪伪狂犬病毒灭活疫苗（N6）、猪圆环病毒2型细胞培养液（N7）、猪细小病毒细胞培养液（N8）、大肠杆菌细胞培养液（N9）、猪链球菌细胞培养液（N10）、猪肺炎支原体细胞培养液（N10）、阴性对照（N11）、健康鸡血清（N12）、健康羊血清（N13）、健康牛血清（N14），其中，A为VP72基因不同样本的扩增曲线，B为Pactin基因不同样本的扩增曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒制备

1.1 非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒组成

非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒由荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照、外源基因标准液、阴性对照提取液组成。

1.2 非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒制备

1.2.1 荧光PCR检测引物、探针设计

根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72基因、猪肌动蛋白β-actin基因高度保守且具有特异性区域的序列与人工合成的特异性外源基因序列，结合自身经验设计出各基因之间互不干扰的特异性引物和TaqMan探针，具体为：

引物序列如下：

VP72-F：5’-GTGGAAGGGTATGTAAGAGCTG-3’；

VP72-R：5’-AATGTTTTTAATAATAGGTAATGTG-3’；

WY-F：5’-CGGGTGATTCGCAAGATCTTG-3’；

WY-R：5’-CCAGTGTAGAGAAGGAAAAT-3’；

Pactin-F：5’-TTGTCATGGACTCTGGGGATGG-3’；

探针序列如下：

VP72-P：5’-FAM-TTGATGGAAACTTATCGATAAGATTG-TAMRA-3’；

WY-P：5’-VIC-GCAGGTCTGTCCGTTCAACAGGGGAT-BHQ1-3’；

Pactin-P：5’-ROX-TCACCGCTTCCGGTGTCCAGAGGC-BHQ2-3’，

上述引物、探针均由赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成。

1.2.2 荧光PCR扩增试剂

本发明中使用的2×TaqMan® Fast Advanced Master Mix购自爱普拜斯应用生物系统贸易（上海）有限公司。

1.2.3 阳性质粒制备

①重组质粒合成：以非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72基因、猪肌动蛋白β-actin基因高度保守且具有特异性区域的序列与人工合成的特异性外源基因序列与pMD18T克隆载体连接得到重组质粒pMD18T-VP72、重组质粒pMD18T-WY、重组质粒pMD18T-β-actin与重组质粒pMD18T-VP72-WY-β-actin，DNA含量均为9×10

②重组质粒转化：重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含50µg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12-16h，挑菌筛选测序鉴定后，扩大培养阳性菌液后提取质粒。

1.2.4 荧光PCR反应体系优化

以1×10

表1 荧光PCR反应体系

1.2.5 荧光PCR反应液制备

量取上游引物VP72-F 3mL、WY-F 3mL Pactin-F 3mL、下游引物VP72-R 3mL、WY-R 3mL、Pactin-R 3mL和探针VP72-P 3 mL、WY-P 4.5mL、Pactin-P 1.5mL于150 mL的烧杯中，后加入2×TaqMan®Fast Advanced Mast Mix 75mL，搅拌使充分混匀，加入无菌水18mL，过滤，1.2mL/管无菌分装，贴签，于-20℃的条件下贮存，备用。

1.2.6 阳性对照制备

使用1×TE溶液将阳性质粒pMD18T-VP72-WY-β-actin稀释9×10

1.2.7 阴性对照制备

量取纯化水20mL于烧杯中，过滤，200μL/管无菌分装，贴签，于-20℃的条件下贮存，备用。

1.2.8 外源基因标准液制备

使用1×TE溶液将阳性质粒pMD18T-WY稀释5×10

1.2.9 阴性对照提取液制备

量取1M Tris-HCL（pH8.0）2mL、0.5M EDTA（pH8.0）4mL，加超纯水194mL，过滤，2mL/管无菌分装，贴签，于-20℃的条件下贮存，备用。

1.2.10 试剂盒组装

①荧光PCR反应液：1管（1.2mL）

②阳性对照：1管（200μL）

③阴性对照：1管（200μL）

④外源基因标准液：1管（300μL）

⑤阴性对照提取液：1管（2mL）

1.3 荧光PCR反应条件确定

将阳性质粒pMD18T-VP72-WY-β-actin梯度稀释1×10

表2 荧光PCR反应条件

1.4 非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒性能验证

因核酸提取过程中试剂板裂解槽位孔和阴性提取对照孔均需加入含有1×10

1.4.1 敏感性验证

①敏感性研究：将阳性质粒pMD18T-VP72-WY-β-actin梯度稀释1×10

表3 敏感性检测结果

②对不同非洲猪瘟基因型样本检出能力的研究：从GenBank上下载了31株主要流行基因型非洲猪瘟病毒毒株的VP72基因序列（包括22种非洲猪瘟病毒基因型的代表毒株（28株）及我国提交的3株非洲猪瘟病毒（家猪毒株2、野猪毒株1），详见表4。将本发明设计的引物、探针序列和上述基因序列进行同源性比对分析，并将本发明设计的引物、探针序列和美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中的非洲猪瘟病毒基因序列进行Blast分析。分析结果见图2、图3，可看出本发明设计的引物、探针的靶标序列能够覆盖目前所有非洲猪瘟病毒的基因序列，敏感性良好。

表4 引物、探针设计的部分非洲猪瘟病毒参比毒株

1.4.2 特异性验证

将健康猪全血（N1）、健康猪血清（N2）、健康猪肌肉（N3）、健康猪脾脏（N4）、健康猪淋巴结（N5）、猪伪狂犬病毒灭活疫苗（N6）、猪圆环病毒2型细胞培养液（N7）、猪细小病毒细胞培养液（N8）、大肠杆菌细胞培养液（N9）、猪链球菌细胞培养液（N10）、猪肺炎支原体细胞培养液（N10）、阴性对照（N11）、健康鸡血清（N12）、健康羊血清（N13）、健康牛血清（N14）作为特异性质控品，使用非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒对其进行检测，重复检测3次。两个基因不同样本扩增的Ct值见表5，两个基因不同样本的扩增曲线见图4（A、B）。结合图表可看出，猪源样本的Pactin基因有荧光信号，其他病毒、细菌和支原体的基因组均无荧光信号，表明本发明研制的试剂盒特异性良好，且能够分辨样本核酸是否含有猪源基因，可增加了检测结果的准确性，减少假阴性。

表5 特异性检测结果

1.4.3 重复性验证

将1×10

表6 重复性检测结果

1.4.4 稳定性验证

对非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒成品及各组分进行长期稳定性试验和加速稳定性试验，长期试验条件为-20℃，频率为0个月、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、15个月，结果显示成品及各组分在15个月检测结果未见明显变化；加速试验条件为37℃，频率为0日、1日、2日、3日、6日、12日、15日，结果显示成品和各组分在15日内未见明显变化。综合长期试验和加速试验，非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒保存期定为-20℃保存12个月。

实施例2、非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒的应用

2.1 作用与用途

本发明可用于以下样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测：

血液：全血、血清、血浆；

免疫器官：淋巴结、脾脏；

肉及肉制品：肌肉、猪头肉、猪蹄、猪尾巴、猪肥膘、猪油、猪内脏等。

2.2 用法与判定

2.2.1 样本前处理

样本进行核酸提取时需要添加外源基因标准液，同时制备阴性提取对照，具体可参照如下两种方法：

①自动化磁珠法：每次核酸提取时均需要预留1头份试剂作为阴性提取对照。选择试剂盒试剂板裂解槽位孔其中的一孔作为阴性提取对照孔，将试剂盒试剂板上的铝箔膜撕去，在试剂板裂解槽位孔和阴性提取对照孔均需加入外源基因标准液5μL/孔，然后在试剂板裂解槽位孔加入待检样本，在阴性提取对照孔加入与样本等体积的阴性提取对照液，随后请按照核酸提取试剂盒说明书进行后续自动化提取步骤；

②柱式手动提取法：每次核酸提取时均需要预留1头份试剂作为阴性提取对照。在核酸提取裂解步骤，在所需数量的1.5 mL离心管（包括样本和阴性提取对照）中预先加入外源基因标准液5μL/管，然后在样本管中加入待测样本，在阴性提取对照管中加入与样本等体积的阴性提取对照液，随后请按照试剂盒说明书进行后续手动提取步骤。

注：使用的DNA提取试剂盒为杭州博日科技股份有限公司的MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒。

2.2.2 PCR操作步骤

试剂准备区

①取出试剂盒，从中取出实验所需试剂，融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着的液体；

②取需要数量的PCR管（需设置阴性提取对照、阳性对照及阴性对照），在各PCR管中分别加入20μL荧光PCR反应液（含内源基因和外源基因），转移至样本准备区；

样本准备区

③分别加入样品处理步骤获得的上清液、阴性提取对照、阴性对照、阳性对照各5μL，混匀，瞬时离心，转移至扩增区；

扩增区

④将各PCR管放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序；

⑤按表7设置仪器核酸扩增相关参数，进行PCR扩增。

表7 荧光PCR反应仪器核酸扩增相关参数设置

2.2.3 结果判定

①实验成立条件见表8。

表8 荧光PCR反应实验成立条件

注：随每批次试剂盒均提供产品质检说明，请参阅质检说明中Ct

②判定标准见表9。

表9 荧光PCR反应判定标准

序列表

<110> 北京明日达科技发展有限责任公司

<120> 非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> VP72-F(Artificial Sequence)

<400> 1

gtggaagggt atgtaagagc tg 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> VP72-R(Artificial Sequence)

<400> 2

aatgttttta ataataggta atgtg 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> WY-F(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggtgattc gcaagatctt g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> WY-R(Artificial Sequence)

<400> 4

ccagtgtaga gaaggaaaat 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Pactin-F(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgtcatgga ctctggggat gg 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Pactin-R(Artificial Sequence)

<400> 6

agtcctgcgg catccacgag acca 24

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> VP72-P(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgatggaaa cttatcgata agattg 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> WY-P(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaggtctgt ccgttcaaca ggggat 26

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Pactin-P(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaccgcttc cggtgtccag aggc 24

<210> 10

<211> 520

<212> DNA

<213> VP72(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaggtactg taacgcagca cagctgaacc gttctgaaga agaagaaagt taatagcaga 60

tgccgatacc acaagatcag ccgtagtgat agaccccacg taatccgtgt cccaactaat 120

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ccaatctcgg tgttgatgag gattttgatc ggagatgttc 520

<210> 11

<211> 317

<212> DNA

<213> WY(Artificial Sequence)

<400> 11

atagtcctaa tcccgggtga ttcgcaagat cttgacagca ggtctgtccg ttcaacaggg 60

gattgttcgg caaagagtca tcccagtgta gagaaggaaa attgtagacg aagggtcgaa 120

agctcaagga caattaggct ggttggagaa taaagatatt gacttttctt ggaaagtggc 180

gcagtcaagt atttggaagg gcacgggttc cgttttgaag tcaagaatag acatagaagt 240

tgatgatgct gagcaattca atatcttgct agcttccatc ttggctcaaa tttgggcgtg 300

atggagtgaa gcgcctt 317

<210> 12

<211> 255

<212> DNA

<213> P-actin(Artificial Sequence)

<400> 12

agaccttcaa cacgccggcc atgtacgtgg ccatccaggc cgtgctgtcc ctgtacgcct 60

ctggccgcac cactggcatt gtcatggact ctggggatgg ggtcaccgct tccggtgtcc 120

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gctgtctggc gggac 255