一种脯氨酸键合硅胶质谱毛细管色谱柱

技术领域

本发明涉及色谱填料，具体涉及一种键合聚脯氨酸片段的硅胶填料，及应用于毛细管蛋白质谱色谱柱的制备方法，本发明属于色谱固定相领域。

背景技术

色谱柱是色谱分离的核心，对蛋白质谱所需要的分离填充毛细管色谱柱来说，色谱填料直接影响其对分析物的选择性和分离效率。近十年来，在蛋白质谱领域软电离方法的迅速发展和成熟不令使质谱技术本身得到长足的发展，而且使它在生命科学领域的应用大为拓展。高效液相-质谱联用通用技术则更是对毛细管蛋白色谱柱的高分辨率、高灵敏度等优点和质谱方法的高精确度，提出了更高的要求。

目前，色谱固定相大多以二氧化硅为基质进行表面化学修饰制备而成，根据所键合官能团的不同具有不同的色谱分离机制，进而为分离复杂样品提供多种选择。

聚脯氨酸多肽是一类特殊的生物活性多肽，其主要特点是多肽中富集脯氨酸残基，可在诱导和调节细胞因子的产生、调控和平衡机体的免疫系统中发挥重要作用。这可能和脯氨酸的特殊性质有关。脯氨酸的存在不利于α-螺旋的形成，但有利于形成顺式肽键。在20种天然存在的氨基酸中，脯氨酸是非常独特的一种，其侧链原子与骨架原子形成吡咯烷环。环状结构导致脯氨酸在结构和构象层面拥有非常独特的性质，它能限制吡咯烷环中单键旋转，这是富含脯氨酸序列的二级结构顺式/反式异构化困难的主要原因。同时，聚脯氨酸片段上，降低了传统酰胺结构的氢键吸附能力，但与氮原子间隔的羰基，依然具有活化氢键的功能，对于复杂的蛋白质样本，即含有氨基酸片段的物质，具有适中的吸附与流出效率。

另一方面，在聚氨基酸链段获取手段上，聚氨基酸材料来源广泛，可从农副产品中提取。然而，从天然产物中提取或通过发酵法获得聚氨基酸，周期长、污染大、投资高，并且分离得到目标产物有一定难度。化学合成法可以合成生物法所不能得到的特殊结构的聚α-氨基酸，且可以避免生物法中产物纯化难、基因合成周期冗长和非天然聚氨基酸不能表达等问题。而且特殊要求的均聚氨基酸，目前只能通过化学法合成。常见的化学合成法有固相合成法、缩聚法、开环聚合法等。氨基酸的氮内羧酸酐（NCA）和以及开环聚合所得的聚氨基酸继续受到化学家和生物学家的关注，主要包括两个方面，一是 NCA 开环聚合的催化机理和聚合机理，二是通过 NCA 合成的聚氨基酸在生物医药领域的应用。

利用氨基(Amino-NH

目前，上述脯氨酸键合硅胶无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种脯氨酸键合硅胶。

所述的脯氨酸键合硅胶具有以下结构：

其中，n为10-30的整数。

本发明的另一目的是提供一种制备脯氨酸键合硅胶蛋白质质谱色谱柱的方法。

一种脯氨酸键合硅胶毛细管蛋白质谱色谱柱，其特征在于，所述色谱柱用以下技术手段制得，包括以下三个步骤：

（1）步骤1：脯氨酸与三光气在干燥的溶剂中反应得到脯氨酸氮内羧酸酐。

具体措施为取脯氨酸、三光气，溶于干燥溶剂中。磁力搅拌，微通氮气。油浴控制在60 °C使反应体系达到回流状态。反应液澄清透明，此时猛烈鼓吹氮气。反应终止时液澄清透明淡黄色。迅速撤去油浴。趁热将反应液倒入正己烷中，析出白色固体。放置低温冰箱静置。过滤，以四氢呋喃和正己烷重结晶，过滤，干燥，得到脯氨酸氮内羧酸酐。

（2）步骤2：氨基硅胶与步骤1中所得的脯氨酸氮内羧酸酐在干燥的溶剂中反应得到脯氨酸键合硅胶。

具体措施为氨基硅胶与步骤1中所得的脯氨酸氮内羧酸酐溶于干燥溶剂中，室温搅拌，混合液倒入正己烷中，以四氢呋喃洗涤，干燥，得到脯氨酸键合硅胶。

（3）步骤3：将步骤2中所得脯氨酸键合硅胶进行石英毛细管装填。

具体措施为：截取石英毛细管，用氢氧化钠/氯化钠混合溶液处理15min，再用超纯水洗涤至流出液呈中性；然后用盐酸溶液处理0.5 h，再用超纯水洗涤至流出液呈中性，将处理后的石英毛细管用于脯氨酸键合硅胶固定相的装填。取脯氨酸键合硅胶加入玻璃小瓶，加入乙腈混匀；将小瓶放入填柱器内，磁力搅拌；安装洗涤过的石英毛细管，打开气阀，填柱压力600—800Bar；调料填充长度15 cm，压柱3h。封口液为硅酸钾、甲酰胺体积比3:1的混合溶液，封口长度2mm，制备得到脯氨酸键合硅胶蛋白质质谱色谱柱。

步骤2中所述氨基硅胶，其氨基键含量为1.0—1.5 mmol/g，步骤2中脯氨酸氮内羧酸酐与氨基硅胶氨基键的摩尔比例为30/1—10/1。

步骤1与2中所述溶剂为甲苯、乙醚、乙腈、二氧六环、乙酸乙酯、四氢呋喃中的一种。

本发明有益效果：

1. 本发明提供一种脯氨酸键合硅胶，所述脯氨酸键合硅胶含有大量与氮院子间位的羰基，对氨基酸、蛋白质具有很好的氢键螯合作用，同时氮原子不含有氢键，提高了洗脱能力，与传统酰胺键结构相比，总体氢键结合能力适中，且完全适用于蛋白质各级结构样本分离；

2. 本发明还提供了一种制备并利用脯氨酸键合硅胶填充毛细管，制备蛋白质谱色谱柱的方法，氨基硅胶引发氮内羧酸酐开环的方法，可以有效控制最终氨基酸单元数目。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。实施例中所用填柱系统为：PC77-MAG高压装柱系列（尚域发展公司）。

实施例1

脯氨酸氮内羧酸酐的制备

脯氨酸1.6 g、三光气2.4 g，溶于50 mL干燥的四氢呋喃中。磁力搅拌，微通氮气。油浴控制在50 °C，使反应体系达到回流状态。约15 min后反应液澄清透明，此时猛烈鼓吹氮气1h。反应终止时液澄清透明淡黄色。撤去油浴。趁热将反应液倒入250 mL正己烷中，有大量白色固体生成。放置-20 °C冰箱静置过夜。过滤，以四氢呋喃和正己烷重结晶，结晶物呈微小针状白色粉末，过滤，干燥，得产物白色固体2.1g。

实施例2

脯氨酸键合硅胶的制备

取上述实施例1中所述白色固体1.41g，取氨基硅胶1.1g，置于干燥的四氢呋喃中，微通氮气，室温下反应60 min，旋蒸去除溶剂，固体以甲醇洗涤3次，过滤，再以乙醚洗涤，真空干燥，得白色胶装固体2.6 g。

实施例3

蛋白质质谱色谱柱的制备

截取50 cm石英毛细管，用各1 moL／L氢氧化钠/氯化钠混合溶液处理15min，再用超纯水洗涤至流出液呈中性；然后用0.1 moL／L HCl处理0.5 h，再用超纯水洗涤至流出液呈中性，将处理后的石英毛细管用于脯氨酸键合硅胶固定相的装填。取脯实施例3中白色胶装固体2.0 g加入玻璃小瓶，加入5 mL乙腈混匀；将小瓶放入填柱器内，磁力搅拌；安装洗涤过的石英毛细管，打开气阀，填柱压力700Bar；调料填充长度15 cm，压柱3h。封口液为硅酸钾、甲酰胺体积比3:1的混合溶液，封口长度2mm，。填柱在烘箱内50℃，制备得到脯氨酸键合硅胶蛋白质质谱色谱柱。