一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法

技术领域

本发明涉及心肌病治疗技术领域，尤其涉及一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法。

背景技术

自身免疫机制不仅参与系统性自身免疫疾病伴发的心律失常，而且是特发性心律失常的主要病因；已经有明确定论的是抗Ro/SSA抗体和胎儿和新生儿先天性心脏传导阻滞的发生有明确的相关性，而其他特殊的自身抗体只是影响心肌组织的生物电活动导致心律失常。

在医疗研究领域内，通常会通过对动物模型的间接研究，有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，这种方法有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。

因此，我们提出了一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法用于解决上述问题。但是在该制备方法的过程中，需要对离心后的血清进行检测，而由于检测时间不一定，就可能会导致在中间间隔的时间内会令血清中滋生细菌，从而影响后期的检测，而且如果这血清存放时间过久，也很容易出现凝固的现象，也会对后期的检测造成影响。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法。

一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，包括以下步骤：

S1、选取健康成年且重量大于四斤的家兔14只，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫家兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的家兔；

S2、选取各组中免疫后的家兔，采取静脉血并装于离心管中，将离心管放置于37℃烘箱内，2小时后转移到4℃沉淀过夜，第二天早上取出离心10分钟，再在血清中加入柠檬酸钠和NaN

S3、检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；

S4、摘取各组中免疫后的家兔心脏，切片并染色，得到心脏染色图片；

S5、将得到的心脏染色图片与统计数据对应，即得到心肌病模型。

优选的，所述S1中常规微量多次免疫法为：在家兔的脊柱两旁选6点并用注射器进行皮内注射，每点注0.1mL，间隔2周后在于上述部位选不同点注射，两周后进行第二次免疫，按照每两周免疫一次方式，免疫八周。

优选的，所述常规微量多次免疫法中每次免疫的抗原量为50μg。

优选的，所述第一次免疫采用完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，第二次免疫及以上均采用不完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽。

优选的，所述S2中离心转速为1200rpm～1500rpm。

优选的，所述S4中染色采用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色。

优选的，所述S4中摘取过程为：将选定的家兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死家兔后，利用止血摘取法，摘取家兔的心脏，无菌低温保存。

本发明的有益效果是：

本发明通过将免疫的家兔的静脉血采集于离心管内，经加热、沉淀后再离心，并向离心后的血清中加入柠檬酸钠和NaN

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

一种β1肾上腺素能受体的心肌病模型的制备方法，包括以下步骤：

S1、选取健康成年且重量大于四斤的家兔14只，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫家兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的家兔；

S2、选取各组中免疫后的家兔，采取静脉血并装于离心管中，将离心管放置于37℃烘箱内，2小时后转移到4℃沉淀过夜，第二天早上取出以1200rpm的转速离心10分钟，再在血清中加入柠檬酸钠和NaN

S3、检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；

S4、将选定的家兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死家兔后，利用止血摘取法，摘取家兔的心脏，无菌低温保存，再对保存的心脏切片并用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色，得到心脏染色图片；

S5、将得到的心脏染色图片与统计数据对应，即得到心肌病模型。

其中，常规微量多次免疫法为：在家兔的脊柱两旁选6点并用注射器进行皮内注射，每点注0.1mL，间隔2周后在于上述部位选不同点注射，两周后进行第二次免疫，按照每两周免疫一次方式，免疫八周，每次免疫的抗原量为50μg，第一次免疫采用完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽，第二次免疫及以上均采用不完全弗氏佐剂混合多抗原β1多肽。

实施例：

S1、选取健康成年且重量大于四斤的家兔14只，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫家兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的家兔；

S2、选取各组中免疫后的家兔，采取静脉血并装于离心管中，将离心管放置于37℃烘箱内，2小时后转移到4℃沉淀过夜，第二天早上取出以1200rpm的转速离心10分钟，再在血清中加入柠檬酸钠和NaN

S3、检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；

S4、将选定的家兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死家兔后，利用止血摘取法，摘取家兔的心脏，无菌低温保存，再对保存的心脏切片并用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色，得到心脏染色图片；

S5、将得到的心脏染色图片与统计数据对应，即得到心肌病模型。

对比例一（不加柠檬酸钠）：

S1、选取健康成年且重量大于四斤的家兔14只，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫家兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的家兔；

S2、选取各组中免疫后的家兔，采取静脉血并装于离心管中，将离心管放置于37℃烘箱内，2小时后转移到4℃沉淀过夜，第二天早上取出以1200rpm的转速离心10分钟，再在血清中加入NaN

S3、检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；

S4、将选定的家兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死家兔后，利用止血摘取法，摘取家兔的心脏，无菌低温保存，再对保存的心脏切片并用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色，得到心脏染色图片；

S5、将得到的心脏染色图片与统计数据对应，即得到心肌病模型。

对比例二（不加NaN

S1、选取健康成年且重量大于四斤的家兔14只，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫家兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的家兔；

S2、选取各组中免疫后的家兔，采取静脉血并装于离心管中，将离心管放置于37℃烘箱内，2小时后转移到4℃沉淀过夜，第二天早上取出以1200rpm的转速离心10分钟，再在血清中加入柠檬酸钠至终浓度为0.02%；

S3、检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；

S4、将选定的家兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死家兔后，利用止血摘取法，摘取家兔的心脏，无菌低温保存，再对保存的心脏切片并用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色，得到心脏染色图片；

S5、将得到的心脏染色图片与统计数据对应，即得到心肌病模型。

对比例三（不加柠檬酸钠和NaN

S1、选取健康成年且重量大于四斤的家兔14只，利用多抗原β1多肽，采取常规微量多次免疫法免疫家兔，根据免疫注射的抗原的量不同，分组，得到免疫后的家兔；

S2、选取各组中免疫后的家兔，采取静脉血并装于离心管中，将离心管放置于37℃烘箱内，2小时后转移到4℃沉淀过夜，第二天早上取出以1200rpm的转速离心10分钟；

S3、检测得到的免疫后血清中的β1-AR抗体含量，统计不同免疫注射的抗原的量对应的β1-AR抗体含量，得到不同抗原β1多肽注射量与对应的β1-AR抗体的统计数据；

S4、将选定的家兔麻醉，通过麻醉插管窒息法，致死家兔后，利用止血摘取法，摘取家兔的心脏，无菌低温保存，再对保存的心脏切片并用苏木精—伊红染色，将心脏切片细胞内的核酸和染色质染成紫蓝色，细胞质与细胞外基质染成红色，得到心脏染色图片；

S5、将得到的心脏染色图片与统计数据对应，即得到心肌病模型。

试验一-检测离心后的血清的凝固程度：

取实施例、对比例一和对比例三中S2步骤最后获得的血清，将其置于同一环境下3-7天，观察其凝固的程度，并记录于下表：

注：上表中“√”表示加入了柠檬酸钠，“×”表示未加入柠檬酸钠

由上表数据可以发现，在血清中加入柠檬酸钠之后，可以有效地缓解血清中液体凝固的现象，为后期的检测提供了期限保障。

试验二-检测离心后的血清的细菌增殖程度：

取实施例、对比例二和对比例三中S2步骤最后获得的血清，将其置于同一环境下一周后，从各血清样本中吸取一滴血清，于显微镜下观察其血清中细菌的增殖程度，并记录于下表：

注：上表中“√”表示加入了NaN

由上表数据可以发现，在血清中加入了NaN

综上所述，向离心后的血清中加入柠檬酸钠和NaN

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。