通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法。

背景技术

骨质疏松是一种全身骨代谢性疾病，其主要特征是骨量减少及骨微结构改变，伴随骨强度下降、骨脆性增加及骨折危险性增加等。根据流行病学统计，我国50岁以上人群中骨质疏松的患病率女性为20.7％，男性为14.4％。并且根据全球的流行病学调查，各国的骨质疏松的患病率均较高。骨质疏松的发病与多种因素相关，其中性别因素和年龄因素对骨质疏松发生的相关性最大。骨质疏松导致的疼痛和骨折严重的影响了患者的生活质量，危及患者生存，而现有的治疗手段对骨质疏松的治疗效果相对有限。在老年女性中，病理性骨折多继发于骨质疏松症之后，骨质疏松性骨折致残致死率高，目前其病死率已超过老年女性罹患乳腺癌、宫颈癌及子宫体癌病死率的总和。

目前临床上诊断骨质疏松的方法主要有：1.医生询查既往病史，通过病史提供可能患有骨质疏松的高危因素，比如酗酒，大量吸烟，绝经前双侧卵巢切除术等，然后还需要进一步的检查。2.测量骨量，以测量骨矿含量和骨密度为依据，但是骨折及骨质疏松的发生不仅仅依赖于骨量。3.超声骨测定，测量超声通过骨组织的速度，振幅衰减和硬度指数反映骨结构和骨量。

现有诊断骨质疏松的方法主要有如下缺点：1.医生询查既往病史只能提供参考，并不能准确判断是否患有骨质疏松。2.骨量测量是现在常用的手段，但是是否发生骨折主要是有骨强度决定的，而骨强度由骨量、骨质量、骨骼的构成成分及骨的外形等多方面组成，因此仅仅通过骨量进行判断也不够准确。3.超声测量的结果不是骨密度或骨矿含量，不能与真值相比，需要更多的观察资料，此外超声设备巨大不便移动，每次测量成本较高等缺点。因此一种改进的诊断骨质疏松的产品是目前市场需要的。

发明内容

本发明的提供一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法。

本发明的方案是：

一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法，包括下列步骤：

1)所需DNA样本制备，通过全血提取样本DNA，获得的样本DNA后，置于-20℃～4℃中保存待用；

2)样本DNA的qPCR扩增，取步骤1)中的样品DNA进行稀释，稀释至5～30ng/μL，然后在PCR管中构建反应体系，然后送入PCR扩增仪器中，设定好反应程序进行反应，反应完成后获得目的基因；

3)位点检测，将步骤2)中的目的基因进行检测，获得检测报告。

通过检测BsmI位点和PvuⅡ位点的碱基序列，判断骨质疏松的风险。

作为优选的技术方案，所述全血提取样本DNA如下所示：

1-mL Tip头剪去尖头，插移液器上，伸入采血管中反复吹打全血3～4次，沉淀的白细胞充分悬浮，转移全血至EP管中，加MGS裂解液，加蛋白酶K混匀，在60℃的水浴锅中加热10min～15min，混匀次数大于2次；

从水浴锅中取出EP管，将EP管内溶液全部倒入离心吸附柱中，吸附柱放入收集管内，8000rpm，离心1min，取出吸附柱，倒掉收集管中废液；

向吸附柱中加入清洗液

漂洗处理两次，完成后取出吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm，离心1min，除去残留的乙醇；

将吸附柱置于新的1.5ml离心管中室温环境干燥2-3min；向吸附柱靠近吸附膜中央悬空滴加60℃的洗脱液ET，12000rpm，离心1-2min，离心管内收集到液体即为样本DNA溶液，盖盖子后轻拨离心管内液体混匀。

作为优选的技术方案，所述漂洗处理为向吸附柱中加入漂洗液Wash，8000rpm，离心30s，取出吸附柱，倒掉收集管中废液。

作为优选的技术方案，所述步骤2)中反应体系如下：

作为优选的技术方案，MGB-TaqMan-FAM在Apa I位点采用FAM6,其余均为FAM。

作为优选的技术方案，所述步骤2)中反应程序如下：

S3至S4进行45次循环。

由于采用了上述技术方案一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法，1)所需DNA样本制备，通过全血提取样本DNA，获得的样本DNA后，置于-20℃～4℃中保存待用；2)样本DNA的qPCR扩增，取步骤1)中的样品DNA进行稀释，稀释至5～30ng/μL，然后在PCR管中构建反应体系，然后送入PCR扩增仪器中，设定好反应程序进行反应，反应完成后获得目的基因；3)位点检测，将步骤2)中的目的基因进行检测，获得检测报告。

本发明的优点：操作步骤简单，图形结果直观，易于解读，缩短了检测时间，提高了检测效率，提升了检测的准确性；

提供了有效的信息，从而对提高了对骨质疏松风险的预测准确度。

附图说明

图1为本发明实施例VDR BsmI检测位点GG扩增曲线图；

图2为本发明实施例VDR BsmI检测位点AG扩增曲线图；

图3为本发明实施例VDR BsmI检测位点AA扩增曲线图；

图4为本发明实施例ESR PvuⅡ检测位点AA扩增曲线图；

图5为本发明实施例ESR PvuⅡ检测位点AG扩增曲线图；

图6为本发明实施例ESR PvuⅡ检测位点GG扩增曲线图。

图7为本发明分析流程图；

图8为本发明实施例罗氏480分析软件选择分析位点界面图；

图9为本发明实施例罗氏480分析软件选择分析样品界面图；

图10为本发明实施例罗氏480分析软件选择分析参数界面图；

图11为本发明实施例罗氏480分析软件选择通道FAM界面图；

图12为本发明实施例罗氏480分析软件FAM分析结果界面图；

图13为本发明实施例罗氏480分析软件更换分析通道界面图；

图14为本发明实施例罗氏480分析软件的VIC通道界面图；

图15为本发明实施例罗氏480分析软件的将分析通道单独导入读取软件界面图；

图16为本发明实施例罗氏480分析软件显示FAM通道扩增图的界面图；

图17为本发明实施例罗氏480分析软件显示VIC通道扩增图的界面图；

图18为本发明实施例罗氏480分析软件显示FAM和VIC双通道扩增图的界面图。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法以解决上述背景技术中的问题。

一种通过全血提取DNA进行qPCR扩增检测获取BsmI与PvuⅡ位点碱基序列的方法，包括下列步骤：

1)所需DNA样本制备，通过全血提取样本DNA，获得的样本DNA后，置于-20℃～4℃中保存待用；

2)样本DNA的qPCR扩增，取步骤1)中的样品DNA进行稀释，稀释至5～30ng/μL，然后在PCR管中构建反应体系，然后送入PCR扩增仪器中，设定好反应程序进行反应，反应完成后获得目的基因；

3)位点检测，将步骤2)中的目的基因进行检测，获得检测报告。

通过检测BsmI位点和PvuⅡ位点的碱基序列，判断骨质疏松的风险。

所述全血提取样本DNA如下所示：

1-mL Tip头剪去尖头，插移液器上，伸入采血管中反复吹打全血3～4次，沉淀的白细胞充分悬浮，转移全血至EP管中，加MGS裂解液，加蛋白酶K混匀，在60℃的水浴锅中加热10min～15min，混匀次数大于2次；

从水浴锅中取出EP管，将EP管内溶液全部倒入离心吸附柱中，吸附柱放入收集管内，8000rpm，离心1min，取出吸附柱，倒掉收集管中废液；

向吸附柱中加入清洗液

漂洗处理两次，完成后取出吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm，离心1min，除去残留的乙醇；

将吸附柱置于新的1.5ml离心管中室温环境干燥2-3min；向吸附柱靠近吸附膜中央悬空滴加60℃的洗脱液ET，12000rpm，离心1-2min，离心管内收集到液体即为样本DNA溶液，盖盖子后轻拨离心管内液体混匀。

所述漂洗处理为向吸附柱中加入漂洗液Wash，8000rpm，离心30s，取出吸附柱，倒掉收集管中废液。

所述步骤2)中反应体系如下：

MGB-TaqMan-FAM在Apa I位点采用FAM6,其余均为FAM。

作为优选的技术方案，所述步骤2)中反应程序如下：

S3至S4进行45次循环。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例：

提取全血中DNA

1、1-mL Tip头剪去尖头，插移液器上伸入采血管中反复吹打全血3-4次，使沉淀的白细胞充分悬浮，转移200μl全血至2ml EP管中，加入200μl MGS裂解液，20μl蛋白酶K混匀，在60℃水浴锅中加热10min(不超过15min)，期间至少混匀2～3次，否则血红蛋白抱团结块。

2、从水浴锅中取出样品，将溶液全部倒入离心吸附柱中，吸附柱放入收集管内，8000rpm，离心1min，取出吸附柱，倒掉收集管中废液。

3、向吸附柱中加入500μl清洗液

4、向吸附柱中加入500μl漂洗液Wash，8000rpm，离心30s，取出吸附柱，倒掉收集管中废液。

5、重复4一次。

6、取出吸附柱，并倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm，离心1min，以尽量除去残留的乙醇。

7、将吸附柱置于新的1.5ml离心管中室温环境干燥2-3min。

8、向吸附柱靠近吸附膜中央悬空滴加50-100μl洗脱液ET(预先将洗脱液ET在65℃预热使用可以提高洗脱效率)。12000rpm，离心1-2min，离心管内收集到液体即为DNA溶液。盖盖子后轻拨离心管内液体混匀。根据用途将样品DNA置于4℃或-20℃长期保存。

9、可直接用于PCR、酶切、建库及测序反应等。

qPCR扩增

质检合格的DNA样本稀释至5-30ng/μL；

qPCR反应体系

罗氏480反应程序

按照结果判读标准判读结果并出具检测报告；罗氏480分析软件操作如图8至图18，从而对扩增曲线分析；

通过检测BsmI位点和PvuⅡ位点的碱基序列，判断骨质疏松的风险，见图1至图6；

骨质疏松风险判读

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。