一株具有耐广盐性的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有耐广盐性的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906及其应用。

背景技术

苯胺作为日常生活生产中重要的有机化工原料之一，具有重要与广泛的应用价值，目前已被应用在多达300余种化工产品生产与中间体的制取过程中，在农业、医药等行业都有广泛的应用。但苯胺本身具有剧烈毒性且对环境和人体健康都具有严重的威胁，含此物质的废水属于较难处理的废水之一，其在生活中可通过呼吸道与皮肤接触等渠道侵入人体，进而造成机体组织缺氧使人产生头疼、眩晕、呼吸不畅等临床症状，长期与苯胺接触严重的还会引起致畸、致癌等严重疾病的发生。此外，处理高浓度苯胺废水时常常需要使用大量水进行稀释，以降低苯胺浓度，提升处理效率，导致大量水资源的浪费。另外，苯酚也是作为一种重要的化工原料，在许多化工生产中均有应用，如作为造纸、炼油、炼焦、农药、塑料以及医药合成等行业生产过程中的原料和中间体进行使用，由于行业发展与该原料的大量应用，苯酚废水的治理与污染问题也日渐突出。由于该类废水的不易降解性，因而导致其废水较难处理。且其对人类的危害非常严重，因此，研究探索能够高效降解含以上两类物质的废水具有重要价值与意义。

目前在废水处理过程中，生物处理法作为关键废水处理工艺的组成部分己被广泛应用于各类废水的处理中。但含高盐与高浓度苯酚及苯胺的废水对微生物具有较强的抑制作用。因此，寻找能够耐盐、并可高效降解且耐高浓度苯酚与苯胺的微生物成为该技术领域突破的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一株具有耐广盐性的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906及其应用。所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906具有很好的耐盐生长特性，且具有耐高浓度苯酚与苯胺的特点，同时还具备高效降解高浓度苯酚与苯胺的能力。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了具有耐广盐性的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906，其分类命名为克拉夫新鞘氨醇杆菌Novosphingobium clarifavum，保藏编号为CGMCC No.20365。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的菌落为圆形，黄色，直径1-2μm，表面光滑湿润，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906具有耐广盐性，在盐度15～35‰内能够生长良好。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的适宜生长温度为10～40℃。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的最适生长温度为25-30℃。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的适宜生长pH值为6～9。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的最适生长pH值为7.0-8.0。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906为兼性厌氧菌。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在培养12h后进入对数生长期，在28-30h时进入对数生长末期，菌数达到5.0×10

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906能够耐受高浓度苯酚和苯胺。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906能够高效降解废水中的苯酚和苯胺。

本发明还提供了所述的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在制备用于降解废水中苯酚和苯胺的微生物菌剂中的应用。

进一步的，在应用时，所述微生物菌剂包括菌含量为2.0×10

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的发酵条件为：罐压0.2～0.3MPa，温度28～30℃，溶氧≥20％，搅拌速度150～180rpm，发酵时间32～36h。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的添加浓度为70-100ppm。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液对苯酚的降解率高于65％。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液对苯胺的降解率高于78％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906分离自高盐水体环境，具有耐盐生长特性，在15～35‰的盐度范围内均能良好生长。克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906具有耐受高浓度苯酚与苯胺的特点，且对高浓度条件下的该两种物质均具有良好的降解能力，对初始浓度均为2000mg/L的苯酚与苯胺在96h的降解率分别为66％与79％，因此克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906经培养发酵后，自身或与载体一起制备成微生物菌剂而用于降解废水中的苯酚和苯胺，其能够有效提升含苯酚与苯胺废水的处理效果，在针对含该类物质废水的微生物治理方面将会具有广阔的应用前景和价值。

附图说明

图1为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在改良营养肉汤(NB)固体培养基平板上的菌落形态特征。

图2为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的生长曲线。

图3为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906去除苯酚的应用试验结果。

图4为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906去除苯胺的应用试验结果。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

下述实施例中所需培养基的配方如下：

1、耐盐生长微生物富集筛选液体培养基：葡萄糖15g，蛋白胨3g，K

2、耐盐生长微生物分离纯化固体培养基：葡萄糖15g，蛋白胨3g，K

3、改良营养肉汤(NB)培养基：牛肉膏10g，蛋白胨5g，酵母粉5g，氯化钠5g，FeSO

4、改良营养肉汤(NB)固体培养基：牛肉膏10g，蛋白胨5g，酵母粉5g，氯化钠5g，FeSO

5、发酵培养基：葡萄糖100g/L、玉米浆30g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、KH

以上培养基在使用前，均需在121℃下灭菌20min，然后室温保存。

实施例1：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的筛选、分离与鉴定

1、克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的筛选与纯化

取污水厂生化系统各段混合废水10ml，加入200mL的PBS缓冲溶液中，振荡20min，使样品充分混匀，800rpm离心1min，收集样品上清液，备用。取10mL上述样品上清液，分别加入到装有200mL耐盐生长微生物富集筛选液体培养基的锥形瓶中，30℃，180rpm恒温摇床培养3d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μL涂布于耐盐生长微生物分离纯化固体培养基上，置于30℃培养箱培养。在48h之后，挑取不同形态单菌落在改良营养肉汤(NB)固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到单菌落，将该单菌落命名为GBW-HB1906。

如图1所示，所述菌株GBW-HB1906在改良营养肉汤(NB)固体培养基平板上的菌落为圆形，黄色，直径1-2μm，表面光滑较湿润，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。

2、克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的鉴定

以所述的菌株GBW-HB1906的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-HB1906的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-HB1906与Novosphingobium clarifavum的同源性最高，因此确定该菌株GBW-HB1906为克拉夫新鞘氨醇杆菌。

将筛选到的菌株GBW-HB1906进行菌种保藏，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年07月15日；克拉夫新鞘氨醇杆菌Novosphingobium clarifavum的保藏编号为：CGMCC No.20365。

实施例2：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的生长测定及生理生化特征

1、克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的生长测定

将斜面培养的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906接种至改良NB培养基中，在pH7.0-7.5，28℃下恒温摇床培养40h，制得GBW-HB1906菌液，其中每1.0h取样一次，在OD600nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。如图2所示，实验结果表明，GBW-HB1906在培养的前12h为生长迟缓期，随后进入对数生长期，待培养至28-30h时进入对数生长末期，菌数达到5.0×10

2、克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的生理生化特征

将制得的GBW-HB1906菌液在NB培养基中进一步培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》的菌株生理生化检测方法对克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906进行检测。结果如表1所示，克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在15～40℃温度范围都能正常生长，最适生长温度为25～30℃；在pH值6～9的范围内均能生长，最适生长pH值为7.0～8.0；其属于兼性厌氧菌，在好氧与厌氧条件下均可生长；并且该菌能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶、过氧化氢酶及甘油，同时还能够降解动力-硝酸盐和西蒙式枸橼酸盐及分解半固体琼脂。另外，克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906适宜生长的培养基配方如下：葡萄糖100g/L、玉米浆30g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、KH

表1克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的生理生化特征

注：<+>表示阳性，<->表示阴性。

实施例3：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的盐度耐受试验

为了检验克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的耐盐生长特性，故对其在不同盐度条件下进行生长情况的检测分析。试验中，通过调整氯化钠在NB培养基中的用量而配制成不同盐浓度的培养基，然后将斜面培养的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906接种至不同盐浓度的NB培养基中，在pH 7.0-7.5，温度为30℃的恒温摇床中培养32h，得到克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906培养液，检测该克拉夫新鞘氨醇杆菌在不同盐浓度培养基中的生长状况。结果如表2所示，GBW-HB1906具有耐盐生长特性，在15～35‰的盐度范围内均能生长良好。

表2克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在不同盐浓度中的生长情况

实施例4：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906对苯酚去除率的效果测试

1、将斜面培养的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906接种至改良NB培养基中，在pH7.5，温度为28℃的恒温摇床中培养28h，得到克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906种子液；将克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906种子液按20％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.2MPa，温度28℃，溶氧≥20％，搅拌速度为160rpm，发酵34h，得到克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液。

2、试验过程中采用4-氨基安替比林分光光度法(HJ 503-2009)检测苯酚含量。试验开始时将试验水质中苯酚初始浓度均控制为2000mg/L，其中CK为不加克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的空白对照组，F为添加克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的试验组，每组设3个重复实验，克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的添加浓度为100ppm，且使用前将所用菌液含菌量调整为2.0×10

结果如图3所示，经过96h的苯酚降解试验，克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液对初始浓度为2000mg/L的苯酚的去除率为66％，表明该菌株具有高效显著降解高浓度苯酚的能力，其在去除含苯酚的环境污染方面将具备重大应用价值与意义。

实施例5：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906对苯胺去除率的效果测试

试验过程中采用气相色谱-质谱法(HJ 822-2017)检测苯胺含量。试验开始时将试验水质中苯胺初始浓度均控制为2000mg/L，其中CK为不加克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的空白对照组，A为添加发酵菌液的试验组，每组设3个重复实验，克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906菌液的添加浓度为100ppm，且使用前将所用菌液含菌量调整为2.0×10

本发明所述的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906可以单独或与其他载体一起制备成微生物菌剂，用于去除污水、废水或其他环境中的苯酚与苯胺，且制备工艺成熟，使用方法简单，只需将克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的种子液按20％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.2MPa，温度28℃，溶氧≥20％，搅拌速度为160rpm，发酵32h制得所需菌液；其使用浓度为100ppm时，便可具备高效降解高浓度苯酚与苯胺的能力，故其在应用于处理与修复含苯酚或苯胺的环境污染方面将具有重要价值与意义。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。