用于筛选α-淀粉酶的方法
文献发布时间：2023-06-19 10:38:35
本申请是申请日为2012年6月29日，申请号为201280032797.2，发明名称“用于筛选α-淀粉酶的方法”的中国发明专利申请的分案申请。
序列表的引用
本申请含有计算机可读取形式的序列表，所述序列表通过引用的方式结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于筛选在低温具有高性能的、特别是在洗涤剂中在低温具有高性能的α-淀粉酶的方法。本发明还涉及包含这类淀粉酶的洗涤剂组合物。
相关技术的说明
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉和其他直链和支链1,4-糖苷低聚糖和多糖的水解。
α-淀粉酶在工业上用于几种已知应用如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分的用途具有悠久历史。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。
属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作Termamyl，所述Termamyl已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。碱性淀粉酶(如SP707)形成一个特定的已经用于洗涤剂中的α-淀粉酶的组。这些已知的细菌淀粉酶中许多已经经修饰以便改进它们在特定应用中的功能性。
已经充分研究了增加α-淀粉酶热稳定性的方法。铃木(Suzuki)等人(1989)披露了其中已经将解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的指定区域置换为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域的嵌合α-淀粉酶。构建这种嵌合α-淀粉酶，目的在于鉴定负责热稳定性的区域。发现这类区域包含解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的第177-186位氨基酸残基和第255-270位氨基酸残基。五十岚(Igarashi)等人1998显示可以通过从环(F 178至A184)中缺失两个氨基酸残基R179-G180(AmyS编号)而增加AmyS-型淀粉酶的热稳定性。然而，晓(Shiau)等人(2003)显示在相同环中具有缺失的AmyS酶在高温具有比亲本酶更低的玉米淀粉水解比活性，从而否定了AmyS淀粉酶的主要优点之一。
出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经日益重要。然而，大多数酶(包括淀粉酶)具有通常在低温洗涤中所用温度以上的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。因此，重要的是找到这样的α-淀粉酶变体，它们在温度降低时保留其洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。然而，尽管当前洗涤剂酶组合物的效率，仍然存在着难以彻底去除的许多污渍。这些问题因利用低(例如，冷水)洗涤温度的增加和较短的洗涤周期而加剧。因而，需要获得这样的淀粉分解酶，这些酶可以在低温下起作用并同时保留或增加其他令人希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能。
因而，本发明的目的是提供用于筛选具有高性能、尤其在低温具有高洗涤性能的α-淀粉酶和变体的改进方法。
发明简述
在第一方面，本发明涉及用于筛选具有高性能、尤其在低温具有高洗涤性能的α-淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测定这些酶与α淀粉酶的固体或固定底物如淀粉的结合，
b)选择对底物具有低亲和力、特别是在底物结合和活性之间具有低比率的α-淀粉酶。
在一个另外的方面，本发明涉及用于选择亲本α-淀粉酶的变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过在位于亲本α-淀粉酶的表面处的一个或多个氨基酸中置换、缺失或插入一个或多个氨基酸残基产生变体；
b)检验变体与α-淀粉酶的固体或固定底物如淀粉的结合；
c)选择比亲本α-淀粉酶具有较低底物结合的变体。
在一个另外的方面，本发明涉及可以基于要求保护的方法进行选择的变体和包含使用本发明方法所选择的α-淀粉酶的洗涤剂组合物。
发明详细说明
本发明基于以下观察结果：在淀粉酶与生淀粉结合和低温性能、尤其低温洗涤性能之间存在反相关。例如，利用许多实验性洗涤剂淀粉酶样品的数据，在AMSA检验中在米淀粉结合和洗涤性能之间存在着明确的相关性。因而，已经令人惊讶地发现具有低固体底物结合的α-淀粉酶在低温具有高性能，特别是在低温在洗涤剂中的高性能。
定义
α-淀粉酶活性：术语“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，这些酶构成一组催化淀粉和其他直链和支链1,4-糖苷低聚糖和多糖水解的酶。
底物结合：术语“底物结合”或“与固体底物结合”或语法上等同的术语理解为α-淀粉酶与固体底物(包括固定至固体材料的底物)结合的特性。该术语是相对术语并且它通常表述为与参考α-淀粉酶相比的相对结合。对于变体，通常相对于充当变体的起点的亲本α-淀粉酶测量底物结合。可以通过如下方式测量底物结合：将α-淀粉酶的溶液与固体底物孵育，去除底物并测定初始量的α-淀粉酶中仍然与固体底物附着的比例，下文在材料与方法部分中披露了用于测定底物与固体底物结合的优选方法。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变(即，置换、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。置换意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
野生型酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的α-淀粉酶。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指对其进行改变以产生本发明酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。相对于变体，亲本多肽是除了在变体中具体改变的残基之外与变体具有完全相同的序列的多肽。
分离的变体：术语“分离的变体”意指通过人工修饰的变体。在一个方面，该变体是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的并且至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所测定。
基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指按重量计含有最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多肽天然或重组结合的其他多肽物质的制剂。优选地，按在该制剂中存在的总多肽物质的重量计，该变体是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％、至少99.5％纯的、和100％纯的。本发明的变体优选地处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该变体来实现。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后处于其最终形式的多肽。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性由参数“序列一致性”描述。
出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(尼德尔曼(Needleman)和文施(Wunsch),1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度，如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包)，Rice等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)的Needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行的。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)替代矩阵。将Needle标记的“最长一致性”(使用–nobrief选项获得)的输出用作一致性百分比并且计算如下：(相同残基x100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(尼德尔曼(Needleman)和文施(Wunsch)，1970，上文)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间序列一致性的程度，如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包)，Rice等人，2000，上文)的Needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)替代矩阵。将Needle标记的“最长一致性”(使用–nobrief选项获得)的输出用作一致性百分比并且计算如下：(相同脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)
片段术语“片段”意指使得一个或多个(几个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。
子序列：术语“子序列”意指使得一个或多个(几个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'和/或3'末端缺失的多核苷酸；其中所述子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式的任一种。等位基因变异通过突变而自然发生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰过的多核苷酸。在一个方面，分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，至少90％纯的并且至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所测定的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的或它们的任何组合。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因修饰多肽生产系统内部的形式下的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸含有按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组结合的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的，至少94％纯的，至少95％纯的，至少96％纯的，至少97％纯的，至少98％纯的，至少99％纯的，以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的界限通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框通常以ATG起始密码子或替代的起始密码子如GTG和TTG开始并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过逆转录从获自真核细胞的成熟剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，所述前体在作为成熟剪接的mRNA出现之前经一系列步骤(包括剪接)加工。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子从天然存在的基因分离或经修饰以含有处于本来在自然界中不存在的形式的或为合成的核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。
控制序列术语“控制序列”意指为编码本发明变体的多核苷酸表达所必需的所有组分。每个控制序列可以相对于编码变体的多核苷酸是天然或外来的或彼此是天然或外来的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。至少，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列可以配有接头，目的在于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指其中将控制序列相对于多核苷酸的编码序列置于适宜位置处使得控制序列指导编码序列表达的构型。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，所述DNA分子包含编码变体的多核苷酸并且与导致其表表达的另外的核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖因复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
淀粉去除过程：表述“淀粉去除过程”涉及任何种类的借以去除(或转化)淀粉的过程，如在其中从纺织品去除淀粉的洗涤过程中，例如纺织品清洁如洗衣。淀粉去除过程也可能是硬质表面清洁，如餐具洗涤或它可能是一般清洁过程，如工业清洁或机构清洁。该表述通常还包括其他淀粉去除过程或淀粉转化、乙醇生产、淀粉液化、纺织品退浆、纸和纸浆生产、啤酒制造和洗涤剂。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改善的特征。这类改善的特性包括但不限于热活性、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改善的表面特性、产物特异性、在预处理的生物质存在下增加的稳定性或溶解度、在储存条件下改善的稳定性、以及化学稳定性。
洗涤性能：在本发明情况下，使用术语“洗涤性能”作为酶在例如衣物或硬质表面清洁如餐具洗涤期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的能力。可以通过计算在AMSA说明中和在下文方法部分中的烧杯洗涤性能测试中定义的所谓的强度值(Int)将洗涤性能定量。
改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”在此定义为相对于亲本淀粉酶的洗涤性能或相对于具有所述变体的相同氨基酸序列但是在一个或多个指定位置不具有缺失的α-淀粉酶或相对于具有在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性，变体酶显示出淀粉酶变体的洗涤性能的改变，例如增加的污渍去除。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬质表面清洁，如在餐具洗涤中，还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。
低温：“低温”是5℃-35℃、优选5℃-30℃、更优选5℃-25℃、更优选5℃-20℃、最优选5℃-15℃并且特别地5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃、优选10℃-30℃、更优选10℃-25℃、最优选10℃-20℃，并且特别地10℃-15℃的温度。
在第一方面，本发明涉及用于筛选在低温具有高性能、尤其在低温具有高洗涤性能的α-淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测定这些酶与α淀粉酶的固体或固定底物如淀粉的结合，
b)选择与所述底物具有低结合的α-淀粉酶、特别是具有底物结合和活性的低比率的α-淀粉酶。
根据这个方面，本发明涉及筛选在低温具有高性能的α-淀粉酶，特别是筛选在低温具有高洗涤性能的洗涤剂用α-淀粉酶。该方法适用于筛选新α-淀粉酶以便找到在低温具有良好性能的酶。该方法也可以具有被自动化并且适合于高通量筛选程序的优点。
在一个实施例中，该方法适用于找到新的α-淀粉酶。一种合宜的方式是测试许多候选α-淀粉酶并包含一种已知的洗涤剂用α-淀粉酶作为标准，并且然后选择比标准洗涤剂用α-淀粉酶具有更低底物结合的新候选α-淀粉酶。选择的α-淀粉酶将是具有高洗涤性能的候选物并且可以进一步测试对洗涤剂用酶重要的其他特性，如稳定性、比活性等等。
从文献已知几种洗涤剂用淀粉酶，包括野生型淀粉酶如具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、8、10、11和12的α-淀粉酶、任何这些α-淀粉酶的变体，如在WO 2001066712和WO2006002643中披露的变体，并且可以在方法中适当地包含任何这些已知洗涤剂用淀粉酶作为标准洗涤剂用α-淀粉酶。
将这种实施例中的α-淀粉酶选择为比选择的标准洗涤剂用淀粉酶具有更低的底物结合，如具有标准洗涤剂用α-淀粉酶的小于95％的结合，如小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合、更优选地小于10％的结合和最优选地小于5％的结合。
可替代地，使用SP722(具有SEQ ID NO:1的α-淀粉酶)作为标准洗涤剂用α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温洗涤性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比SP722具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可替代地，使用SP707(具有SEQ ID NO:2的α-淀粉酶)作为标准洗涤剂用α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温洗涤性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比SP707具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可替代地，使用AA560(具有SEQ ID NO:3的α-淀粉酶)作为标准洗涤剂用α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温洗涤性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比AA560具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可替代地，使用SP690(具有SEQ ID NO:4的α-淀粉酶)作为标准洗涤剂用α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温洗涤性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比SP690具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可替代地，使用KSM-AP1378(具有SEQ ID NO:5的α-淀粉酶)作为标准洗涤剂用α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温洗涤性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比KSM-AP1378具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可替代地，使用SP7-7(具有SEQ ID NO:6的α-淀粉酶)作为标准洗涤剂用α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温洗涤性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比SP7-7具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
本发明的方法也可以与其他亲本α-淀粉酶如地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(BLA)(具有SEQ ID NO:13的α-淀粉酶)一起使用，用于通过以下方式选择具有改善的低温性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比BLA具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可替代地，使用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacins)α-淀粉酶(BAN)(具有SEQ ID NO:14的α-淀粉酶)作为亲本α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比BAN具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可替代地，使用嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))α-淀粉酶(BSG)(具有SEQ ID NO:15的α-淀粉酶)作为亲本α-淀粉酶时，该方法可以用于通过以下方式选择具有改善的低温性能的α-淀粉酶：选择这样的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比BSG具有更低的底物结合，优选地小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
在一个另外的方面，本发明涉及用于选择亲本α-淀粉酶的变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过在位于亲本α-淀粉酶的表面处的一个或多个氨基酸中置换、缺失或插入一个或多个氨基酸残基产生变体；
b)检验变体与α-淀粉酶的固体或固定底物如淀粉的结合；
c)选择比亲本α-淀粉酶具有较低底物结合的变体。
该方法原则上可以用于任何已知的α-淀粉酶，其中需要对其选择具有改善的低温性能的变体，然而，在优选实施例中，本发明的方法用于产生具有改善的低温洗涤性能的变体。
在其他实施例中，本发明的方法用于找到淀粉酶以便选择亲本α-淀粉酶的变体，这些变体在涉及清洁区域的应用中、在如糖化或液化淀粉以便将淀粉降解成糖(所述糖可以被发酵以提供用于消费或用于燃料的乙醇)的应用中或在纺织品制造应用中具有改善的低温性能。所有这样的应用是本领域已知的并且技术人员将领会可以怎样在这些应用中应用根据本发明方法选择的α-淀粉酶。
在这种优选的实施例中，亲本α-淀粉酶可以是洗涤剂用α-淀粉酶，即在清洁和洗衣中通常所应用的条件下具有活性的α-淀粉酶，如在洗涤剂中常规使用的表面活性剂、螯合剂和其他组分存在下具有活性和在碱性pH如8-11如9-10范围内具有活性的α-淀粉酶。
可以通过在位于亲本α-淀粉酶的表面处的一个或多个氨基酸中置换、缺失或插入一个或多个氨基酸残基来制备变体。
技术人员将知道如何通过鉴定位于亲本分子表面处的残基来鉴定待修饰的残基。在这一点上，位于分子表面上的残基被理解为这样的残基，其中所述残基的至少一部分与分子的天然形式下的周围介质直接接触。应当理解的是，在母体分子的三维结构可获得的情况下，技术人员可以从母体分子的三维结构提取这种类型的信息，或在亲本的三维结构不是可获得的情况下，通过如下方式提取这种类型的信息：将亲本α-淀粉酶与可获得其三维结构的α-淀粉酶比对并且将位于分子表面上的残基鉴定为亲本α-淀粉酶的下述残基，所述残基在比对中相应于α-淀粉酶中位于表面上的残基。由于α-淀粉酶的一种以上的三维结构是本领域已知的，因此鉴定位于给定的亲本α-淀粉酶表面上的残基应当基于亲本α-淀粉酶与下述α-淀粉酶的三维结构的比对，其中所述α-淀粉酶与亲本α-淀粉酶具有最高的序列一致性。
通过以下方式产生变体：在位于亲本α-淀粉酶表面处的一个或多个氨基酸中或在位于亲本α-淀粉酶表面上的位置中的一个或多个氨基酸残基置换、缺失或插入一个或多个氨基酸残基，如位于该表面上置换、缺失或插入至少一个残基，如至少二个残基、例如至少三个残基、例如至少四个残基、例如至少五个残基、例如至少六个残基、例如至少七个残基、例如至少八个残基、例如至少九个残基、例如至少十个残基，如位于亲本α-淀粉酶表面上高达十五个残基，例如高达二十个残基或高达三十个残基。
变体可以另外地含有在不位于分子表面上的一个或多个氨基酸残基中的其他置换、缺失或插入。许多这样的置换、缺失或插入已经在现有技术中披露并且也可以根据本发明使用。作为这样的优选的另外的置换、插入或缺失的实例，可以提到在亲本α-淀粉酶中的残基D183和G184的缺失，如在WO96/23873中披露。
优选地产生多种变体，所述变体与它们的亲本α-淀粉酶具有至少90％的序列一致性、优选地至少95％的序列一致性、更优选至少97％的序列一致性、更优选至少98％的序列一致性和最优选地至少99％的序列一致性。
将变体选择为比亲本α-淀粉酶具有更小的底物结合，如具有亲本α-淀粉酶的小于95％的结合，如小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合，优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
在一个优选的实施例中，本发明涉及用于选择亲本α-淀粉酶的变体的方法，所述亲本α-淀粉酶选自具有SEQ ID NO:1-15的α-淀粉酶和与这些α-淀粉酶之一具有少80％序列一致性、优选地至少85％一致性、优选地至少90％一致性、更优选至少95％一致性、更优选至少97％一致性的α-淀粉酶，所述方法包括以下步骤：
a)通过在位于亲本α-淀粉酶的表面处的一个或多个氨基酸中置换、缺失或插入一个或多个氨基酸残基产生变体，其中所述变体与它们的亲本α-淀粉酶具有至少90％的序列一致性、优选地至少95％的序列一致性、更优选至少97％的序列一致性、更优选至少98％的序列一致性和最优选地至少99％的序列一致性。
b)检验变体与α-淀粉酶的固体或固定底物如淀粉的结合；和
c)选择比亲本α-淀粉酶具有更低底物结合的变体，其中所述变体具有亲本α-淀粉酶的小于95％的结合，如小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
在一个另外的实施例中，本发明涉及用于选择亲本α-淀粉酶的变体的方法，所述亲本α-淀粉酶选自具有SEQ ID NO:1-15的α-淀粉酶以及与这些α-淀粉酶之一具有少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少87％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性和最优选地至少97％序列一致性的α-淀粉酶，其中：
i)该变体与亲本α-淀粉酶具有至少80％序列一致性，优选地至少85％、优选地至少87％序列一致性，优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％，并且
ii)与亲本α-淀粉酶相比，该变体具有较低的固体底物结合，如小于80％的结合、优选地小于70％、优选地小于60％、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
可以使用本发明的方法提供这类变体。
本发明的变体也包括这些变体，其中位于亲本α-淀粉酶表面上的并且为底物结合位点的一部分的一个或多个残基已经被置换或缺失。对于少数亲本α-淀粉酶，已经在文献中披露了存在于亲本α-淀粉酶的表面上的这类底物结合位点，并且技术人员将理解的是，可以通过将给定的亲本α-淀粉酶与已经鉴定出这类底物结合位点的另一个α-淀粉酶序列比对而鉴定出在其他亲本α-淀粉酶中的这类底物结合位点。
可以提到以下作为底物结合位点的一部分的残基的实例：
a)SEQ ID NO:2中的W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476和G477
b)SEQ ID NO:5中的W140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476和G477
c)SEQ ID NO:4中的W140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476和G477
d)SEQ ID NO:13中的W138、W157、W165、E167、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、K315、W342、R437、W467和G475，
e)SEQ ID NO:14中的W136、W155、W163、E165、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、R315、W342、R437、W467和G475，
f)SEQ ID NO:15中的W139、W158、W166、E168、W187、E192、F260、F287、G302、G303、W345、W437、W467，G474和G475。
本发明的变体还包括包含一个或多个修饰的变体，其中所述修饰在作为底物结合位点的一部分的残基(如上文a)-h)中提到的残基)附近的位置内引入一个或多个大体积氨基酸残基。在这一点上，大体积氨基酸残基可以选自具有大侧链的氨基酸，如Tyr、Trp、Phe、His和Ile，其中Tyr和Trp是优选的。在作为底物结合位点的一部分的残基附近旨在表示修饰的残基位于距离作为底物结合位点的一部分的残基小于
其他优选的变体包括这样的变体，它们与SEQ ID NO:2具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少87％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％一致性、更优选至少99％序列一致性，但是小于100％序列一致性并且包含以下置换：
H183*+G184*+W140F；
H183*+G184*+Q169N；
H183*+G184*+Q169A；
H183*+G184*+W189Y+E190P；
H183*+G184*+N260D；
H183*+G184*+G477E；
H183*+G184*+G477Q；
H183*+G184*+G477K；
H183*+G184*+W189E+E190P；
H183*+G184*+A51I+W140Y；
H183*+G184*+W140Y+W189E；
H183*+G184*+W140Y+N260P；
H183*+G184*+W140Y+W284D；
H183*+G184*+W140Y+G476R；
H183*+G184*+W140Y+G477E；
H183*+G184*+W189E+W439R；
H183*+G184*+W284D+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+W439R+G477E；
H183*+G184*+E194D；
H183*+G184*+W439R+D467K；
H183*+G184*+R320M+W439R；
H183*+G184*+W439R+K485R；
H183*+G184*+Y160S；
H183*+G184*+W189F+E190P；
H183*+G184*+F262A；
H183*+G184*+Y363H；
H183*+G184*+G476E；
H183*+G184*+N260P+W439R；
H183*+G184*+N260P+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+K72S+W140Y；
H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G；
H183*+G184*+E194S；
H183*+G184*+E345D+G477R；
H183*+G184*+K302N+W439R；
H183*+G184*+R320K+W439R
H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E；
H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q。
其他优选的变体包括由具有上文提到的置换之一的SEQ ID NO:2组成的变体。
本发明的另一种优选变体是这样的变体，它与SEQ ID NO:13具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％一致性并且包含在与SEQ ID NO:13中的K315和/或W467相应的位置中的置换，优选地K315ANCQEGHILMFPSTWYVM，特别优选地K315M和/或W467AF。在一个优选实施例中，位置K315中的置换与其他置换组合，所述的其他置换优选地选自G48A、T51IL、G107A、H156Y；A181T、N190F、I201F、A209V和Q264S。
在一个另外的方面，本发明涉及一种包含使用本发明方法所选择的α-淀粉酶的洗涤剂组合物。
在一个另外的实施例中，本发明涉及一种包含变体α-淀粉酶的洗涤剂组合物，所述变体α-淀粉酶的特征在于：
i)与SEQ ID NO:1-12之一具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％一致性。
ii)具有与固体或固定底物的结合，所述结合小于亲本α-淀粉酶的95％的结合，如小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
在一个另外的实施例中，本发明涉及一种包含变体α-淀粉酶的洗涤剂组合物，所述变体α-淀粉酶的特征在于：
i)与SEQ ID NO:1-12之一具有至少80％序列一致性、优选地具有至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％一致性。
ii)具有与固体或固定底物的结合，所述结合小于具有SEQ ID NO:8的α-淀粉酶95％的结合，如小于90％的结合；优选地小于80％的结合、优选地小于70％的结合、优选地小于60％的结合、优选地小于50％的结合、优选地小于40％的结合、优选地小于30％的结合、更优选地小于20％的结合和最优选地小于10％的结合。
本发明还涉及一种包含α-淀粉酶的洗涤剂组合物，其中所述α-淀粉酶与米淀粉的结合低于具有SEQ ID NO:8的α-淀粉酶与米淀粉的结合，优选地小于80％、更优选地小于70％、更优选地小于60％、更优选地小于50％、更优选地小于40％、更优选地小于30％、更优选地小于20％和最优选地小于10％。
测定α-淀粉酶与固体底物的结合
出于本发明的目的，原则上可以使用本领域已知的任何这类用于测定底物结合的方法测定α-淀粉酶与固体或固定的底物的结合。通常，这类方法涉及使α-淀粉酶与固体或固定的底物接触并确定与底物结合的α-淀粉酶的比例。
固体或固定的底物可以是在测试条件下基本上不溶的α-淀粉酶的任何底物。固体底物可以是淀粉如小麦淀粉、玉米淀粉或米淀粉，其中优选米淀粉。可替代地可以使用固定的底物进行测定，所述固定的底物包括α-淀粉酶的固定在固体基质上的任何可溶性或不溶性底物。根据本发明，将α-淀粉酶与其底物的结合测定为在20℃在淀粉存在下在pH 8测量的结合淀粉酶的比例。
可以通过将α-淀粉酶的水溶液与淀粉孵育并且使用下文披露的方法确定结合淀粉酶的比例而测定α-淀粉酶与其底物的结合。
变体命名的规则
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中披露的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中披露的成熟多肽比对，并且基于比对，使用Needleman-Wunsch算法(尼德尔曼(Needleman)和文施(Wunsch),1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包)，Rice等人，2000,遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)的Needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行的，确定与在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相应的氨基酸位置编号。
可以通过使用“ClustalW”(拉金(Larkin)等人，2007,生物信息学(Bioinformatics)23:2947-2948)比对多个多肽序列证实另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基的鉴定。
当另一种酶已经偏离SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的成熟多肽，使得基于序列的传统比较法未能检测它们的关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可以使用其他配对序列比较算法。
使用利用多肽家族的概率表示(谱)检索数据库的检索程序，可以在基于序列的检索中实现更高的敏感度。
例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库检索过程产生谱并且能够检测远同源物(阿尔丘尔(Atschul等人)，1997,核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999,分子生物学杂志287:797-815；麦格芬(McGuffin)和琼斯，2003,生物信息学19:874-881)利用来自多种来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化潜力)作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000,分子生物学杂志313:903-919的方法可以用来将结构未知的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型比对。这些比对结果可以进而用来产生多肽的同源性模型，并且可以使用为这种目的所开发的多种工具评定这样的模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，已经将蛋白质的SCOP超家族进行结构比对，并且这些比对是可获取和可下载的。可以使用多种算法，如距离比对矩阵(霍姆(Holm)和桑德(Sander)，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,蛋白质工程(Protein Engineering)11:739-747)来比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外地用来查询具有感兴趣的结构的结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，霍姆和帕克(Park)，2000,生物信息学16:566-567)。
在描述本发明的α-淀粉酶变体时，为了便于参考，采用下文描述的命名法。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
多个突变由加号(“+”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和411分别将甘氨酸(G)置换为精氨酸(R)，并且将丝氨酸(S)置换为苯丙氨酸(F)。
在这样的情况下，根据添加小写字母至所插入氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号，将插入的氨基酸残基编号。在以上实例中，序列因此将是：
包含多个改变的变体由(“+”)加号分隔，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表用酪氨酸和谷氨酸分别置换在位置170和195处的精氨酸和甘氨酸。
亲本α-淀粉酶
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:1的成熟多肽SP722具有至少80％序列一致性的多肽。
在一个方面，亲本与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:1的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:1的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:2的成熟多肽SP707具有至少80％序列一致性的多肽(披露在塚本(Tsukamoto)等人，1988,Biochem.Biophys.Res Comm.151,25-31中)。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:3的成熟多肽AA560具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:3的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:3的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:4的成熟多肽(WO 9526397中披露的SP690)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:4的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:5的成熟多肽(EP 670367中披露的KSM-AP1378)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:5的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:6的成熟多肽sp 7-7具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:6的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:7的成熟多肽(SP722+T183*+G184*)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:7的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:7的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:8的成熟多肽(SP 707+G182*+H183*)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:8的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:8的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:9的成熟多肽(AA560+T183*+G184*)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:9的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:9的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:9的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:10的成熟多肽(SP690+T183*+G184*)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:10的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:10的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:11的成熟多肽(KSM-AP1378+D183*+G184*)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:11的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:11的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:11的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与SEQ ID NO:12的成熟多肽(SP-7-7+G182*+H183*)具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:12的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:12的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:12的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与源自地衣芽孢杆菌的SEQ ID NO:13的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:13的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:13的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:13的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:13的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与源自解淀粉芽孢杆菌的SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:14的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:14的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:14的成熟多肽的等位基因变体。
亲本α-淀粉酶也可以是与源自嗜热脂肪芽孢杆菌(嗜热脂肪土芽孢杆菌)的SEQID NO:15的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。
在另一个方面，亲本与SEQ ID NO:15的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:15的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
亲本优选地包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:15的成熟多肽或由其组成。
在另一个实施例中，亲本是SEQ ID NO:15的成熟多肽的等位基因变体。
可以使用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针以便根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或物种的菌株的亲本的DNA。具体而言，这样的探针可以用于按照标准DNA印迹程序，与感兴趣的属或物种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离在其中的相应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是应当具有至少14个、例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸长度。优选地，核酸探针具有至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸长度、至少300个核苷酸长度、至少400个核苷酸长度、至少500个核苷酸长度、至少600个核苷酸长度、至少700个核苷酸长度、至少800个核苷酸长度或至少900个核苷酸长度。可以使用DNA探针和RNA探针两者。典型地这些探针被标记用于检测相应的基因(例如用
可以筛选从这类其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码亲本的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术分离来自这类其他生物的基因组DNA或其他DNA。可以将来自这些文库的DNA或分离DNA转移至并且固定在用于在DNA印迹中的硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸在低至极高严格性条件下与标记的核苷酸探针杂交，所述核苷酸探针与编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15的多核苷酸或其子序列相应。可以使用例如X射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段检测与该探针杂交的分子。
在一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15的多肽的多核苷酸或其片段。
对于至少100个核苷酸长度的长探针，极低至极高严格性条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA中，以及对于极低和低严格性在25％甲酰胺中，对于中等和中等-高严格性在35％甲酰胺中，或对于高和极高严格性在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2X SSC、0.2％SDS在45℃(极低严格性)、在50℃(低严格性)、在55℃(中等严格性)、在60℃(中等-高严格性)、在65℃(高严格性)、或在70℃(极高严格性)将载体材料洗涤三次，各自持续15分钟。
对于大约15个核苷酸至大约70个核苷酸长度的短探针，严格性条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据Bolton和McCarthy(1962，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的T
可以从任何属的微生物获得亲本。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的细胞产生的。在一个方面，亲本分泌至细胞外。
亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)α-淀粉酶、梭菌属(Clostridium)α-淀粉酶、肠球菌属(Enterococcus)α-淀粉酶、土芽孢杆菌属(Geobacillus)α-淀粉酶、乳杆菌属(Lactobacillus)α-淀粉酶、乳球菌属(Lactococcus)α-淀粉酶、海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)α-淀粉酶、葡萄球菌属(Staphylococcus)α-淀粉酶、链球菌属(Streptococcus)α-淀粉酶或链霉菌属(Streptomyces)α-淀粉酶，或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)α-淀粉酶、大肠杆菌α-淀粉酶、黄杆菌属(Flavobacterium)α-淀粉酶、梭杆菌属(Fusobacterium)α-淀粉酶、螺杆菌属(Helicobacter)α-淀粉酶、泥杆菌属(Ilyobacter)α-淀粉酶、奈瑟球菌属(Neisseria)α-淀粉酶、假单胞菌属(Pseudomonas)α-淀粉酶、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)α-淀粉酶。
在一个方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)α-淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)α-淀粉酶、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)α-淀粉酶、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)α-淀粉酶、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)α-淀粉酶、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)α-淀粉酶、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)α-淀粉酶、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)α-淀粉酶、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)α-淀粉酶。
在另一个方面，亲本是马链球菌(Streptococcus equi)α-淀粉酶、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)α-淀粉酶、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)α-淀粉酶。
在另一个方面，亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)α-淀粉酶、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)α-淀粉酶、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)α-淀粉酶、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)α-淀粉酶或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)α-淀粉酶。
亲本可以是真菌α-淀粉酶。例如，亲本可以是酵母α-淀粉酶，如假丝酵母属(Candida)α-淀粉酶、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-淀粉酶、毕赤酵母属(Pichia)α-淀粉酶、酵母属(Saccharomyces)α-淀粉酶、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)α-淀粉酶或子囊菌酵母属(Yarrowia)α-淀粉酶。例如，亲本可以是丝状真菌α-淀粉酶如枝顶孢霉属(Acremonium)α-淀粉酶、伞菌属(Agaricus)α-淀粉酶、链格孢属(Alternaria)α-淀粉酶、曲霉属(Aspergillus)α-淀粉酶、金担子菌属(Aureobasidium)α-淀粉酶、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)α-淀粉酶、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)α-淀粉酶、毛喙壳属(Chaetomidium)α-淀粉酶、金孢属(Chrysosporium)α-淀粉酶、麦角菌属(Claviceps)α-淀粉酶、旋孢腔菌属(Cochliobolus)α-淀粉酶、鬼伞属(Coprinopsis)α-淀粉酶、乳白蚁属(Coptotermes)α-淀粉酶、棒囊壳属(Corynascus)α-淀粉酶、隐丛赤壳属(Cryphonectria)α-淀粉酶、隐球酵母属(Cryptococcus)α-淀粉酶、壳色单隔孢属(Diplodia)α-淀粉酶、黑耳属(Exidia)α-淀粉酶、绒黑粉类酵母(Filibasidium)α-淀粉酶、镰刀菌属(Fusarium)α-淀粉酶、赤霉属(Gibberella)α-淀粉酶、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)α-淀粉酶、腐质霉属(Humicola)α-淀粉酶、耙齿菌属(Irpex)α-淀粉酶、香菇属(Lentinula)α-淀粉酶、小球腔菌属(Leptospaeria)α-淀粉酶、巨座壳属(Magnaporthe)α-淀粉酶、Melanocarpusα-淀粉酶、亚灰树花菌属(Meripilus)α-淀粉酶、毛霉属(Mucor)α-淀粉酶、毁丝霉属(Myceliophthora)α-淀粉酶、新美鞭菌属(Neocallimastix)α-淀粉酶、脉孢菌属(Neurospora)α-淀粉酶、拟青霉属(Paecilomyces)α-淀粉酶、青霉属(Penicillium)α-淀粉酶、平革菌属(Phanerochaete)α-淀粉酶、梨囊鞭菌属(Piromyces)α-淀粉酶、Poitrasiaα-淀粉酶、假黑盘菌属(Pseudoplectania)α-淀粉酶、假披发虫属(Pseudotrichonympha)α-淀粉酶、根毛霉属(Rhizomucor)α-淀粉酶、裂褶菌属(Schizophyllum)α-淀粉酶、柱霉属(Scytalidium)α-淀粉酶、蓝状菌属(Talaromyces)α-淀粉酶、嗜热子囊菌(Thermoascus)α-淀粉酶、梭孢壳属(Thielavia)α-淀粉酶、弯颈霉属(Tolypocladium)α-淀粉酶、木霉属(Trichoderma)α-淀粉酶、毛盘菌属(Trichophaea)α-淀粉酶、轮枝孢属(Verticillium)α-淀粉酶、小包脚菇属(Volvariella)α-淀粉酶或炭角菌属(Xylaria)α-淀粉酶。
在另一个方面，亲本是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)α-淀粉酶、酿酒酵母α-淀粉酶、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)α-淀粉酶、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)α-淀粉酶、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)α-淀粉酶、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)α-淀粉酶或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)α-淀粉酶。
在另一个方面，亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)α-淀粉酶、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉α-淀粉酶、臭曲霉(Aspergillus foetidus)α-淀粉酶、烟曲霉α-淀粉酶、日本曲霉(Aspergillus japonicus)α-淀粉酶、构巢曲霉α-淀粉酶、黑曲霉α-淀粉酶、米曲霉α-淀粉酶、Chrysosporium inopsα-淀粉酶、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)α-淀粉酶、勒克瑙金孢(Chrysosporium lucknowense)α-淀粉酶、粪状金孢(Chrysosporium merdarium)α-淀粉酶、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)α-淀粉酶、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)α-淀粉酶、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)α-淀粉酶、Chrysosporium zonatumα-淀粉酶、杆孢状镰刀菌(Fusarium bactridioides)α-淀粉酶、禾谷镰刀菌(Fusarium cerealis)α-淀粉酶、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)α-淀粉酶、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)α-淀粉酶、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)α-淀粉酶、禾赤镰刀菌(Fusarium graminum)α-淀粉酶、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)α-淀粉酶、合欢木镰刀菌(Fusariumnegundi)α-淀粉酶、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、网状镰刀菌(Fusariumreticulatum)α-淀粉酶、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)α-淀粉酶、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)α-淀粉酶、肤色镰刀菌(Fusarium sarcochroum)α-淀粉酶、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)α-淀粉酶、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)α-淀粉酶、簇囊镰刀菌(Fusarium torulosum)α-淀粉酶、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)α-淀粉酶、Fusarium venenatumα-淀粉酶、灰腐质霉(Humicolagrisea)α-淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)α-淀粉酶、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)α-淀粉酶、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)α-淀粉酶、米黑毛霉(Mucor miehei)α-淀粉酶、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)α-淀粉酶、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)α-淀粉酶、绳状青霉(Penicillium funiculosum)α-淀粉酶、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)α-淀粉酶、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)α-淀粉酶、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)α-淀粉酶、Thielaviaalbomycesα-淀粉酶、Thielavia albopilosaα-淀粉酶、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)α-淀粉酶、Thielavia fimetiα-淀粉酶、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)α-淀粉酶、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)α-淀粉酶、Thielaviaperuvianaα-淀粉酶、毛梭孢壳(Thielavia setosa)α-淀粉酶、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)α-淀粉酶、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)α-淀粉酶、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)α-淀粉酶、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)α-淀粉酶、康氏木霉(Trichoderma koningii)α-淀粉酶、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)α-淀粉酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)α-淀粉酶或绿色木霉(Trichoderma viride)α-淀粉酶。
在另一个方面，亲本是芽孢杆菌α-淀粉酶，例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的α-淀粉酶。
应当理解的是，对于前述物种，本发明包括完全和不完全状态，及其他分类学等同物，例如无性型，无论通过它们知道的物种名称是什么。本领域技术人员将容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株在许多培养物保藏中心中对于公众是容易接近的，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS(和北部地区研究中心农业研究局专利培养物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern RegionalResearch Center，NRRL)。
可以使用上述探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水，等等)直接获得DNA样品。直接从天然栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品衍生编码亲本的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见，例如桑布鲁克(Sambrook)等人，1989，上文)。
亲本可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N末端或C末端处融合。
该亲本还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中一种多肽在另一种多肽的N末端或C末端处融合。通过将编码一种多肽的多核苷酸与编码另一种多肽的多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合蛋白，其中以翻译后方式产生融合物(库珀(Cooper)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994,科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以进一步包含在两种多肽之间的切割位点。在分泌融合蛋白之后，切割该位点，释放出两种多肽。切割位点的实例包括但不限于马丁(Martin)等人，2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000,生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997,应用与环境微生物技术(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995,生物技术(Biotechnology)13:498-503；和康特拉斯(Contreras)等人，1991,生物技术(Biotechnology)9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986,生物化学(Biochemistry)25:505-512；Collins-Racie等人，1995,生物技术(Biotechnology)13:982-987；卡特(Carter)等人，1989,蛋白质：结构、功能、和遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003,药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48中披露的位点。
变体的制备
可以使用本领域已知的任何诱变方法，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。
定点诱变是其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定的位点处产生一个或多个(几个)突变的一项技术。
定点诱变可以通过PCR在体外完成，所述PCR涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见，例如谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；和巴顿(Barton)等人，1990,核酸研究(NucleicAcids Res.)18:7349-4966。
定点诱变也可以通过本领域已知的方法在体外内实现。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人，2001,自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；凯伦(Kren)等人，1998,自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡里萨诺(Calissano)和曼奇诺(Macino)，1996,真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变方法。存在许多可获得的可以用来制备变体的商业试剂盒。
合成基因构建使得必需体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。可以利用许多技术，如由田(Tian)等人，(2004，自然(Nature)432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术和其中在光可编程的微流芯片上合成和装配寡核苷酸的相似技术进行基因合成。
可以做出单个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如Reidhaar-Olson和索尔(Sauer),1988，科学，241:53-57；鲍威(Bowie)和索尔,1989,美国科学院院刊，86:2152-2156；WO 95/17413或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼(Lowman)等人，1991,生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986,基因(Gene)46:145；Ner等人，1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999,自然生物技术17:893-896)。使用本领域的标准方法可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子并且将其快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过将合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变和/或改组的多个方面组合而完成半合成基因构建。半合成基因构建由利用与PCR技术组合而合成的多核苷酸片段的的方法代表。基因的限定区域可以因此从头合成，而可以使用位点特异性诱变引物扩增其他区域，同时另外的其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。随后可以进行多核苷酸子序列穿梭。
变体
可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定亲本中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989,科学(Science)244:1081-1085)。在后一种技术中，将单个丙氨酸突变在分子中的每个残基处引入，并且对所产生的突变体分子测试α-淀粉酶活性以鉴定对该分子活性至关重要的氨基酸残基。还见希尔顿(Hilton)等人，1996,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可以通过结构的物理分析测定α-淀粉酶的活性部位或其他生物学相互作用，如通过这类技术如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记法，连同推定的接触位点氨基酸突变所确定的。参见，例如德·沃斯(deVos)等人，1992,科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；Wlodaver等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBSLett.)309:59-64。也可以从与多肽的一致性的分析推断必需氨基酸的身份，其中所述多肽与亲本相关。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明任何变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含与一个或多个(几个)控制序列可操作地连接的编码本发明变体的多核苷酸，其中所述控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与所述控制序列相容的条件下的表达。
可以按多种方式操作多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前操作多核苷酸可能是令人希望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子序列，所述启动子序列由宿主细胞识别用于表达多核苷酸。启动子序列含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。
指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的适合启动子的实例是从解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪地芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因获得的启动子(维拉-科马罗夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波儿(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。
其他启动子在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980,科学美国人(ScientificAmerican)，242:74-94的“Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白质)”中、以及由桑布鲁克(Sambrook)等人(1989，上文)描述。
指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适合启动子的实例是从构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(修饰的启动子包括编码曲霉内的中性α-淀粉酶的基因，其中非翻译前导序列已经由来自编码曲霉中的磷酸丙糖异构酶的基因中的非翻译前导序列替换；非限制性实例包括修饰的启动子，所述启动子包括编码黑曲霉内的中性α-淀粉酶的基因，其中非翻译前导序列已经由来自编码构巢曲霉或米曲霉中的磷酸丙糖异构酶的基因中的非翻译前导序列替换)；及其突变、截短和杂合启动子。
在酵母宿主中，从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得有用启动子。酵母宿主细胞的其他有用启动子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992,酵母(Yeast)8:423-488描述。
控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的适合的转录终止子序列。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3'末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
从构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子。
从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得用于酵母宿主细胞的优选终止子。酵母宿主细胞的其他有用终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，上文描述。
控制序列也可以是适合的前导序列，所述前导序列是对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导序列与编码变体的多核苷酸的5'末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列。
从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得用于酵母宿主细胞的适合的前导序列。
控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，一种与编码变体的序列的3'末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列。
从构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列。
用于酵母宿主细胞的有用多聚腺苷酸化序列由郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995,分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990描述。
控制序列也可以是编码信号肽的信号肽编码区，其中所述信号肽与变体的N末端连接并且指导变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'末端可以内在地含有在翻译阅读框中与编码变体的编码区的区段天然连接的信号肽编码区。可替代地，编码序列的5'末端可以含有相对于编码序列为外来的信号肽编码区。在编码序列不天然地含有信号肽编码区的情况下，可能需要外来信号肽编码区。可替代地，外来信号肽编码区可以单纯地替代天然信号肽编码区以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导已表达变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由西莫宁(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993,微生物评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由罗曼诺斯(Romanos)等人(1992，上文)描述。
控制序列也可以是编码位于变体N末端处的前肽的前肽编码区。所产生的多肽称作酶原或多肽原(或在某些情况下酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过前肽的催化或自催化裂解而从多肽原转化成活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子的基因获得前肽编码区。
在信号肽和前肽区两者都在变体的N末端存在的情况下，将前肽区紧邻变体的N末端定位并且将信号肽区紧邻前肽区的N末端定位。
也可能令人希望的是添加调节序列，所述调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节变体的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包括调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核体系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核体系中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和因重金属而扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明多核苷酸、启动子和转录与翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包含一个或多个(几个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或置换编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以合宜地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。典型地，载体的选择将取决于载体与向其中待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为其复制不依赖于染色体复制的染色体外实体而存在的载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当被导入宿主细胞中时，所述载体整合入基因组中并且随已经整合入该载体的染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞的基因组的总DNA的两种或更多种载体或质粒、或者转座子。
载体优选地含有允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(几个)选择标记。选择标记是一种基因，其产物提供杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、原养型至营养缺陷型，等等。
细菌选择标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的适合标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(鸟氨酸-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸酯合酶)、以及其等同物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。
载体优选地含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。
可替代地，载体可以含有另外的核苷酸序列，所述核苷酸序列用于指导在染色体中的精确位置处通过同源重组整合至宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与相应的靶序列具有高度一致性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。在另一方面，载体可以通过非同源重组整合至宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点、以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991,基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987,核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加变体的产生。可以通过将至少一个另外拷贝的序列整合至宿主细胞基因组中或随该多核苷酸一起包含可扩增选择标记基因而获得多核苷酸的拷贝数的增加，其中可以通过在适当的选择剂存在下培养所述细胞来选择含有已扩增拷贝的选择标记基因并因而含有另外的拷贝的多核苷酸的细胞。
用来连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如桑布鲁克等人，1989，上文)以获得基本上纯的变体。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含与指导本发明变体产生的一个或多个(几个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，从而该构建体或载体被维持为染色体整合体或被维持为如稍早描述的自我复制染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖因复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、坚强芽孢杆菌细胞、灿烂芽孢杆菌细胞、迟缓芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞也可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于马链球菌细胞、化脓性链球菌细胞、乳房链球菌细胞、和马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌细胞、阿维链霉菌细胞、天蓝色链霉菌细胞、灰色链霉菌细胞、和浅青紫链霉菌细胞。
可以例如通过原生质体转化(参见，例如昌(Chang)和科恩(Cohen)，1979,现代分子生物学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、通过使用感受态细胞(参见，例如杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961,细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、通过电穿孔(参见，例如Shigekawa和Dower,1988,生物技术(Biotechniques)6:742-751)或通过接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:5271-5278)实现向芽孢杆菌细胞中引入DNA。可以例如通过原生质体转化(参见，例如哈那汗(Hanahan)，1983,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如Dower等人，1988,核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145))实现向大肠杆菌细胞中引入DNA。可以例如通过原生质体转化和电穿孔(参见，例如贡(Gong)等人，2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)、通过接合(参见，例如马卓德(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)或通过转导(参见，例如伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)实现向链霉菌细胞中引入DNA。
可以例如通过电穿孔(参见，例如崔(Choi)等人，2006,微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或通过结合(参见，例如皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)实现向假单胞菌细胞中引入DNA。
可以例如通过天然感受态(参见，例如斐瑞(Perry)和仓光(Kuramitsu)，感染免疫学(Infect.Immun.)32:1295-1297)、通过原生质体转化(参见，例如卡特(Catt)和Jollick,1991,微生物(Microbios)68:189-207)、通过电穿孔(参见，例如巴克利(Buckley)等人，1999,应用与环境微生物学65:3800-3804)或通过接合(参见，例如Clewell，1981,微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现向链球菌细胞中引入DNA。然而，可以使用本领域已知的向宿主细胞中引入DNA的任何方法。
宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人定义，引自：Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995,国际CAB，大学出版社(University Press)，剑桥(Cambridge)，英国)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子酵母和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)的酵母(芽孢纲(Blastomycetes))。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，F.A.,帕斯莫尔(Passmore)，S.M.和达文波特(Davenport)，R.R.编著，应用细菌学学会专题论文集系列9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)所描述那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或子囊菌酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂子囊菌酵母细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类的所有丝状形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定义)。丝状真菌通常以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖组成的菌丝体壁为特征。营养生长是菌丝伸长并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽并且碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属细胞、曲霉属细胞、金担子菌属细胞、烟管菌属(Bjerkandera)细胞、拟蜡菌属细胞、金孢属细胞、鬼伞属细胞、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属细胞、绒黑粉类酵母细胞、镰刀菌属细胞、腐质霉属细胞、巨座壳属细胞、毛霉属细胞、毁丝霉属细胞、新美鞭菌属细胞、脉孢菌属细胞、拟青霉属细胞、青霉属细胞、平革菌属细胞、射脉菌属(Phlebia)细胞、梨囊鞭菌属细胞、侧耳属细胞、裂褶菌属细胞、蓝状菌属细胞、嗜热子囊菌细胞、梭孢壳属细胞、弯颈霉属细胞、栓菌属(Trametes)细胞或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉细胞、臭曲霉细胞、烟曲霉细胞、日本曲霉细胞、构巢曲霉细胞、黑曲霉细胞、米曲霉细胞、烟管菌(Bjerkandera adusta)细胞、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)细胞、Ceriporiopsis caregiea细胞、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)细胞、Ceriporiopsis pannocinta细胞、Ceriporiopsisrivulosa细胞、浅红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)细胞、弯孢拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)细胞、Chrysosporium inops细胞、嗜角质金孢子菌细胞、勒克瑙金孢细胞、粪状金孢细胞、毛金孢细胞、昆士兰金孢细胞、热带金孢子菌细胞、Chrysosporium zonatum细胞、灰盖鬼伞细胞、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)细胞、杆孢状镰刀菌细胞、Fusariumcerealis细胞、克地镰刀菌细胞、黄色镰刀菌细胞、禾谷镰刀菌、禾赤镰刀菌细胞、异孢镰刀菌细胞、合欢木镰刀菌细胞、尖孢镰刀菌细胞、网状镰刀菌细胞、粉红镰刀菌细胞、接骨木镰刀菌细胞、肤色镰刀菌细胞、拟枝孢镰刀菌细胞、硫色镰刀菌细胞、簇囊镰刀菌细胞、拟丝孢镰刀菌细胞、Fusarium venenatum细胞、特异腐质霉细胞、柔毛腐质霉细胞、米黑毛霉细胞、嗜热毁丝霉细胞、粗糙脉孢菌细胞、产紫青霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、辐射射脉菌(Phlebia radiata)细胞、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)细胞、土生梭孢壳细胞、长绒毛栓菌(Trametes villosa)细胞、变色栓菌(Trametes versicolor)细胞、哈茨木霉细胞、康氏木霉细胞、长枝木霉细胞、里氏木霉细胞或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和埃尔顿(Yelton)等人，1984,美国国家科学院院刊81:1470-1474中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法在马拉迪耶(Malardier)等人，1989,基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787中描述。可以使用以下文献中描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，引自阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编者，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Methodsin Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社公司(Academic Press,Inc.)，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；和Hinnen等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
产生的方法
本发明还涉及产生变体的方法，所述方法包括：(a)将本发明的宿主细胞在适合于表达该变体的条件下培养；并且(b)回收该变体。使用本领域已知的方法，在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源和无机盐的适合营养培养基中进行培养。适合的培养基从商业供应商可获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体分泌至营养培养基中，则可以直接从培养基回收该变体。如果未分泌变体，可以从细胞裂解液将其回收。
可以使用本领域已知的对变体特异的方法检测变体。这些检测方法可以包括利用特异性抗体、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法可以用来测定变体的活性。
可以通过本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过常规程序从营养培养基回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域已知的多种方法纯化变体，所述方法包括但不限于色谱(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，编者J.-C.Janson和Lars Ryden,VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的变体。
在替代性方面，不回收变体，而是使用表达变体的本发明宿主细胞作为变体的来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明变体的组合物。
优选地，组合物富集这种变体。术语“富集”意指组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如具有1.1的富集因子。
该组合物可以包含变体作为主要酶促组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。另外的酶可以例如由属于以下属的微生物产生：曲霉属，例如，棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰刀菌属，例如，杆孢状镰刀菌、Fusarium cerealis、克地镰刀菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰刀菌、异孢镰刀菌、合欢木镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、粉红镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰刀菌、硫色镰刀菌、Fusarium toruloseum、拟丝孢镰刀菌或Fusarium venenatum；腐质霉属，例如，特异腐质霉或柔毛腐质霉；或木霉属(Trichoderma)，例如，哈茨木霉、康氏木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
可以根据本领域已知的方法制备组合物，并且它可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明涉及包含与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明酶的洗涤剂组合物。
另外的组分的选择处于本领域技术人员能力范围内并且包含常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括考虑待清洁的织物的类型、脏污类型和/或程度、在进行清洁时的温度、和洗涤剂产物的配方。虽然下文提到的组分由根据具体功能性的普通标题分类，但是这不应当解释为限制，因为如技术人员将理解的，组分可以包括另外的功能性。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，本发明的多肽可以按下述量添加至洗涤剂组合物，所述量对应于每升洗涤液0.001-100mg蛋白质，如0.01-100mg蛋白质，优选地0.005-50mg蛋白质，更优选地0.01-25mg蛋白质，甚至更优选地0.05-10mg蛋白质，最优选地0.05-5mg蛋白质，并且甚至最优选地0.01-1mg蛋白质。
可以使用常规稳定剂，例如，多元醇，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯或苯硼酸衍生物如4-甲酰苯硼酸将本发明洗涤剂组合物的酶稳定化，并且该组合物可以例如如WO 92/19709和WO92/19708中所述那样配制。
本发明的多肽也可以与WO 97/07202中披露的洗涤剂制剂结合，所述文献特此通过引用的方式结合。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性和/或两性离子型或其混合物。在一个特定实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。典型地，表面活性剂按重量计以从大约0.1％至60％，如大约1％至大约40％、或大约3％至大约20％、或大约3％至大约10％的水平存在。
表面活性剂是基于所希望的清洁应用来选择的并且包括本领域已知的任何常规表面活性剂。可以利用本领域已知的用于物洗涤剂中的任何表面活性剂。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从大约1％至大约40％，如从大约5％至大约30％，包含从大约5％至大约15％或从大约20％至大约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)如十二烷基硫酸钠(SDS)、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，还称作醇乙氧基化硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲烷基磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)，包括磺酸甲酯(MES)，烷基-或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基-琥珀酸的二酯及单酯或皂、和它们的组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从大约0％至大约40％的阳离子表面活性剂.阳离子表面活性剂的非限制性实例包烷基二甲基乙醇胺季胺盐(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂基氯化铵(DSDMAC)和烷基苄基二甲胺盐和它们的组合、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从大约0.2％至大约40％，例如从大约0.5％至大约30％、尤其是从大约1％至大约20％、从大约3％至大约10％、如从大约3％至大约5％或从大约8％至大约12％的非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(PFA)、烷氧基化脂肪酸烷基酯，如乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬苯酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺GA，或脂肪酸葡糖酰胺FAGA)，以及在商标名SPAN和TWEEN下可获得的产品，和它们的组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从大约0％至大约40％的半极性表面活性剂。
半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)如烷基二甲基胺氧化物、N-(椰油酰烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛脂-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和乙氧基化脂肪酸烷醇酰胺、和它们的组合。
当包括于其中时，洗涤剂通常将含有按重量计从约大0％至大约40％的两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱和磺基甜菜碱及它们的组合。
水溶助长剂
水溶助长剂是在水溶液中增溶疏水性化合物(或相反地，在非极性环境中增溶极性物质)的化合物。典型地，水溶助长剂具有亲水特征和疏水特征(所谓如从表面活性剂已知的两性特性)；然而，水溶助长剂的分子结构通常不促进自发性自我聚集，见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007),Current Opinion in Colloid&Interface Science 12:121-128的综述。水溶助长剂不显示临界浓度，其中在所述临界浓度之上发生自我聚集，如对形成胶束、层状或其他良好定义的中间相的表面活性剂和脂类所发现的那样。相反，许多水溶助长剂显示连续型聚集过程，其中聚集物的尺寸随浓度增加而增长。然而，许多水溶助长剂改变系统的相行为、稳定性和胶体特性，所述系统含有极性和非极性特征的物质，包括水、油、表面活性剂和聚合物的混合物。经典地跨多种产业(制药、个人护理、食品至技术应用)使用水溶助长剂。在不引起所不希望的现象如相分离或高粘度的情况下，水溶助长剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓缩的表面活性剂制剂(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)。
洗涤剂可以含有按重量计0-5％，如大约0.5％至大约5％或大约3％至大约5％的水溶助长剂。可以利用本领域已知的用于衣物洗涤剂中的任何水溶助长剂。水溶助长剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、异丙苯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠、和它们的组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以含有按重量计大约0-65％，如大约10％至大约40％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂，或其混合物。在洗碗洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别地50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的络合剂。可以利用本领域已知的用于衣物或洗碗洗涤剂或用于工业或机构清洁的洗涤剂中的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐如碳酸钠、可溶性硅酸盐如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2',2”-次氮基三乙醇(TEA)和羧甲基菊粉(CMI)、和它们的组合。
洗涤剂组合物也可以含有按重量计0-50％，如大约10％至大约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以包含单独或与助洗剂组合的共助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。其他非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂如氨基羧化物、氨基多羧化物和膦酸酯，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2”-次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、亚乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、亚乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、胺三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂在例如WO 09/102854、US 5977053中描述。结壳抑制剂如膦酸酯。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-20％，如大约0％至大约10％的漂白系统。可以利用本领域已知的用于衣物+餐具洗涤+I&I洗涤剂中的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预制过酸包括但不限于过氧羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚氨酸和盐、过氧单硫酸和盐，例如臭氧(R)，以及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，所述漂白系统可以例如包含与形成过酸的漂白活化剂组合的无机盐，包括过硼酸盐的碱金属盐如钠盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。漂白活化剂在此意指与过氧漂白剂如过氧化氢反应以形成过酸的化合物。如此形成的过酸构成活化的漂白剂。在此待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯酰胺类、酰亚胺类或酐类的那些，适合的例子是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸钠、二过氧十二烷酸、4-(十二烷酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)和/或WO 98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的特定家族披露在EP 624154中并且特别优选的是该家族是乙酰基柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酯如Triacin具有在环境上友好的优点，因为它最终降解成柠檬酸和醇。另外，在储存之后，乙酰基柠檬酸三乙酯和三醋精在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是有效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物添加剂提供良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜型的过酸过氧酸。漂白系统也可以包含过酸如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统也可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由具有下式的有机催化剂组成：
(iii)及它们的混合物；其中R
其他示例性漂白系统例如在WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO2007/087259、WO 2007/087242中描述。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0-10％，如0.5-5％、2-5％、0.5-2％或0.2-1％的聚合物。
可以利用本领域已知的用于衣物、餐具洗涤和I&I洗涤剂中的任何聚合物。
聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂发挥作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制和/或油脂清洁特性。
示例性抗再沉积聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化聚(乙烯亚胺)和聚羧酸酯如PAA、PAA/PMA以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。示例性纤维保护聚合物包括疏水改性的CMC(HM-CMC)和硅酮类。示例性污垢释放聚合物包括对酞酸和低聚乙二醇的共聚物。示例性染料转移抑制聚合物包括PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)和聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)。其他示例性聚合物披露在例如WO 2006/130575中。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物也可以包含织物调色剂如染料或颜料，其中当配制在洗涤剂组合物中时，所述调色剂可以在织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液接触时沉积到所述织物上，因此通过可见光的吸收/反射，改变所述织物的色调。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，织物调色剂改变表面的色调，因为它们吸收可见光光谱的至少一部分。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土缀合物，并且也可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的的小分子染料，该组由落入以下颜色指数(C.I.)分类的染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如，如在WO2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中所述(特此通过引用的方式结合)。洗涤剂组合物优选地包含从大约0.00003wt％至大约0.2wt％、从大约0.00008wt％至大约0.05wt％或甚至从大约0.0001wt％至大约0.04wt％的织物调色剂。组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当组合物处于单位剂量小袋形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂也在例如WO 2007/087257、WO 2007/087243中披露。
(另外的)酶
洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种[另外的]酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如，漆酶)和/或过氧化物酶。
通常，选择的酶的特性应当与所选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶成分或非酶成分的相容性，等等)并且所述酶应当以有效量存在。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。
其他实例是纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK 98/00299中描述的那些。
可商购的纤维素酶包括Celluzyme
胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和在WO89/06270与WO94/25583中描述的镰刀菌属蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，尤其在以下一个或多个位置具有置换的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的可商购的蛋白酶包括Alcalase
脂肪酶：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(Humicola)(同义词：嗜热丝孢菌属(Thermomyces))的脂肪酶，例如，来自如EP 258 068和EP 305 216中所述的疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)或来自如WO 96/13580中所述的特异腐质霉(H.insolens)的脂肪酶，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzer)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株SD 705(WO95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993),生物化学与生物物理学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)。
其他实例是脂肪酶变体，如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂肪酶变体。
优选的可商购的脂肪酶酶包括Lipolase
有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，尤其是在以下一个或多个位置具有置换的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。
可商购的淀粉酶是Stainzyme
可商购的过氧物酶包括Guardzyme
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂(即，单独的添加剂或组合的添加剂)可以配制为例如颗粒、液体、浆料，等等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒，尤其无尘颗粒、液体，尤其是稳定化的液体或浆料。
无尘颗粒剂例如可以如在US 4,106,991和4,661,452中所披露的那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔重量1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适合于流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。可以根据建立的方法，例如通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸将液体酶制剂稳定化。可以根据EP 238,216中披露的方法制备受保护的酶。
辅助材料
也可以利用本领域已知的用于衣物、餐具洗涤或I&I洗涤剂中的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括单独的或组合的防蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、防皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂/崩解试剂、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂，包括粘土、填料/加工助剂、荧光增白剂/光亮剂、泡沫促进剂、泡沫(肥皂泡沫)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂和芯吸剂。可以利用本领域已知的用于衣物、餐具洗涤或I&I洗涤剂中的任何成分。这类成分的选择完全处于本领域技术人员能力范围内。
洗涤剂产品的配制
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何合宜的形式，例如，棒、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、常规或压型粉末、颗粒、糊剂、凝胶或常规、压型或浓缩液体。
洗涤剂制剂形式：层(相同或不同相)、小袋、用于机器配量单元的多种形式。可以将小袋配置为单一隔室或多隔室。可以是适合于容纳组合物的任何形式、形状和材料，例如不允许在接触水之前从小袋中释放组合物。小袋由包围内体积的水溶性膜制成。所述内体积可以分成小袋的隔室。优选的膜是聚合材料，优选地被成型为膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物是选择的聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物和羟丙甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少大约60％。优选的平均分子量典型地将是大约20,000至大约150,000。膜也可以是掺混组合物，所述掺混组合物包含可水解降解性和水溶性聚合物掺混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(在贸易参考M8630下已知，如以Chris Craft In.Prod.Of Gary,Ind.,US出售的)，外加增塑剂如甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及它们的混合物。小袋可以包含由水溶性膜分隔的固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或部分组分。液体组分的隔室可以在组成上不同于含有固体的隔室。参考文献：(US 2009/0011970A1)。
洗涤剂成分可以在水溶性小袋中或在片剂的不同层中由隔室彼此物理分隔。因而可以避免在组分之间的不利的储存相互作用。各个隔室的不同溶出曲线也可以引起所选择组分在洗涤溶液中的延迟溶出。
颗粒状洗涤剂制剂
颗粒状洗涤剂可以如WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO07/001262、US6472364、WO 04/074419或WO 09/102854中所述配制。其他有用的洗涤剂制剂在以下文献中描述：WO 09/124162、WO 09/124163、WO09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO 09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO 09/021813、WO 09/030632和WO 09/015951。
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO2011005813、WO 2010135238、WO2010120863、WO 2010108002、WO2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO2010014395、WO 2010044905，
WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO2010018043、WO 2010003783、WO2010003792，
WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO 2010000636。
用途
本发明是还涉及用于使用其组合物的方法。
衣物/纺织品/织物(家庭衣物洗涤、工业衣物洗涤)
硬质表面清洁(ADW、轿车洗涤、工业表面)
本发明的洗涤剂组合物可以例如配制为手工或机器用衣物洗涤剂组合物，包括适合于预处理受污织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家庭硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物或配制用于手工或机器用餐具洗涤操作。
洗涤剂组合物可以进一步配制为单位剂量形式或为肥皂棒或洗衣棒，
在一个具体方面，本发明提供了包含如在此所述的本发明多肽的洗涤剂添加剂。在另一个方面，本发明提供了一种适合在35℃或低于35℃的温度进行清洁的洗涤剂。
方法
使用AMSA的α-淀粉酶的洗涤性能
为了评定α-淀粉酶变体在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以进行洗涤实验。使用自动机械应力测定法(AMSA)测试酶。采用AMSA试验，可以检验大量的小体积酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA平板具有用于试验溶液的许多狭槽和抵住全部狭槽开口牢固挤压待洗涤的纺织品样品的盖。在洗涤时间期间，将平板、试验溶液、纺织品和盖剧烈振摇以便使试验溶液与纺织品接触并以常规、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是在第23-24页的段落“具体方法实施例”。
制备一种试验溶液，所述试验溶液包含水(15°dH)、0.8g/l洗涤剂(例如，如下文描述的模型洗涤剂A)或50mM HCO
添加带有淀粉污渍的织物(例如，来自试验材料中心BV的CS-28，邮箱120，3133KT，Vlaardingen，荷兰)并且将它们在20℃洗涤30分钟，或可替代地在15°洗涤20分钟、或可替代地在15°洗涤45分钟或可替代地在15°或40℃洗涤20分钟，如在实例中详细说明的那样。在流动自来水下彻底漂洗并在黑暗中干燥之后，随后将带有污渍的织物的光强度或反射值测量为洗涤性能的量度。含有0mg酶蛋白/L的试验用作空白以获得δ减弱值(ΔREM)。可替代地，将洗涤性能与亲本α-淀粉酶的洗涤性能比较，将亲本α-淀粉酶的性能结果赋予值100并且将变体的结果与这个值比较。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。
AMSA洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下实施。
通过向测试系统添加CaCl
将*模型X混合，不含AEO。将AEO单独添加至洗液。
接近在12°dH水中的洗涤pH(Ca:Mg:HCO
通过向测试系统添加CaCl
将洗涤性能测量为洗涤过的纺织品的色彩亮度。亮度也可以表述为用白光照明时从样品反射的光的强度。当样品被玷污时，反射光的强度低于干净样品的反射光强度。因此反射光的强度光可以用来度量洗涤性能。
用专业平板扫描仪(flatbed scanner)进行颜色测量(Kodak iQsmart,Kodak)，所述扫描仪用来捕获洗涤纺织品的图像。
为了提取来自扫描图像的光强度的值，来自图像的24比特像素值被换算成红色、绿色和蓝色(RGB)的值。
通过将这些RGB值作为向量加在一起并且随后乘以所得向量的长度来计算强度值(Int)：
纺织品样品CS-28(棉花上的米淀粉)从试验材料中心BV(邮箱120,3133KT，Vlaardingen，荷兰)获得。
使用烧杯的洗涤性能试验
这个测定法是上开门(top loaded)式洗衣机的一个小规模模型并且用来评价淀粉酶的洗涤性能。
使用250mL烧杯和以每分钟80次的频率提供振荡式转动运动(每个方向180°)的桨式搅拌器，烧杯洗涤性能试验包括以下步骤：提供含有50mM NaHCO
带循环的水浴(5℃)；玻璃烧杯(250mL)；每只100mL洗涤液容量的烧杯一根转动臂；试验样品：来自荷兰弗拉尔丁恩(Vlaardingen)试验材料中心BV的CS-28(棉花上的米淀粉)和来自瑞士圣加仑(St.Gallen)EMPA试验材料AG的EMPA 162(棉花/聚酯上的米淀粉)，将样品切割成5x 5cm。
洗涤溶液：50mM NaHCO
淀粉酶母液：1mg酶蛋白/mL-A溶液为0.1％(w/v)Triton X-100和超纯水(MilliQ水)中的0.1mM CaCl
将洗涤性能表述为δ减弱值(ΔRem)。使用Macbeth Color Eye 7000反射式分光光度计，以极小卵形孔即0.7cm
使用微型洗涤机器人的α-淀粉酶的洗涤性能：
微型洗涤机器人是洗衣机的一个小规模模型并且用来评价淀粉酶的洗涤性能。
向100mL烧杯添加60mL加热至15℃或40℃的洗涤溶液。然后添加酶(浓度：0.00；0.015；0.05；0.25；0.50；1.00mg酶蛋白/L)。将架上的纺织品(CS-28；棉花上的米淀粉)淹没于含有某种酶浓度的洗涤溶液内并洗涤20分钟。在洗涤之后，将架上的纺织品在干燥柜中在不加热的情况下干燥。在460nm处通过使用ZEISS MCS 521VIS分光光度计测量纺织品的减弱(R)。通过从用淀粉酶洗涤的纺织品的减弱值减去未添加淀粉酶洗涤的纺织品的减弱值(对照)而计算各份纺织品的Δ减弱值。
用于确定α-淀粉酶活性的pNP-G7测定法
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。缩写为4,6-亚乙基(G
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM Hepes(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0)。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM Hepes、87mM NaCl、12.6mM MgCl
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mLG7-pNP底物混合，产生底物工作溶液。使用之前即刻产生这种底物工作溶液。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C
将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过转移20μl稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加80μl底物工作溶液而进行该测定法。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm在5分钟范围内每20秒测量吸收。
时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟吸光度)与在给定系列条件下的在讨论中的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应当被稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
确定与淀粉的结合
测定原理：
将淀粉酶变体在不溶性生米淀粉存在或不存在下在选择的pH值、在选择的时间并且在选择的温度温育，其中所述选择的pH值处于pH 4.0至11.0的范围，这取决于待选择的α-淀粉酶应用的预期pH值；例如对于洗涤剂应用，适当地选择处于碱性区域内的pH，如pH8.0或pH 10.0；所述选择的时间通常在5分钟和1小时之间，优选地在10至30分钟范围内，如10分钟或30分钟；所述选择的温度通常处于0℃至30℃范围内，优选地在4℃。在离心之后，确定上清液中的淀粉酶活性。在米淀粉存在和不存在下孵育的样品的活性的差异是淀粉酶与不溶性淀粉结合的量度。
材料与方法：
米淀粉(西格玛公司(Sigma Inc)，目录号S7260)、Hepes、氯化钙、Triton X-100、甘氨酸、EnzChek Ultra淀粉酶分析试剂盒(生命技术公司(Life Technologies)，目录号E33651)、用于孵育和稀释的96微孔板(Nunc，目录号269620)和用于荧光测量的96孔半区域黑色平板(康宁公司(Corning)，目录号3694)。
分析缓冲液含有50mM Hepes(pH 8.0)，0.1mM CaCl
a)将含有米淀粉(2.5％)或不含米淀粉的100μl缓冲液添加至96微孔板并且在4℃预孵育30分钟。
b)将20μl酶溶液添加至以上孔并且将平板置于混合器上并在4℃以900转/分钟混合30分钟。
c)将平板在4℃以2000转/分钟离心5分钟以便使淀粉沉淀下来，并将上清液小心地移出并在分析缓冲液中稀释至大约1250倍，从而酶蛋白浓度是大约20ng/mL。
d)将25μl稀释的酶样品添加至含有25μl EnzCheck Ultra淀粉酶底物溶液的96孔半区域黑色平板，并将该平板立即置于平板读数仪中用于荧光测量。
e)以激发波长485nm和发射波长512nm在25℃测量荧光强度的变化(ΔF.I.)30分钟。取得0.5分钟至5分钟的时间间隔之间的荧光读数用于计算活性(即)，荧光强度的变化/分钟(ΔF.I./分钟)。
结合％＝(无淀粉时的活性-有淀粉时的活性)/无淀粉时的活性×100
相对于亲本的结合＝对变体的结合/对亲本的结合
实例
实例1：与直链淀粉的结合和洗涤性能的确定
在方法部分中描述了使用测量与淀粉的结合的方法和AMSA洗涤性能试验，分析了许多淀粉酶及其变体与直链淀粉的结合和洗涤性能。
进行了在pH 8.0的结合时间为10分钟的并且在4℃温度的结合分析。使用5％(w/v)直链淀粉(西格玛A0512)来测试结合，并且使用模型洗涤剂A和0.4mg酶蛋白/L洗涤溶液的酶剂量和洗涤温度15℃，如对AMSA洗涤性能试验所述那样进行洗涤性能试验。洗涤时间是45分钟。
结果呈现在下表1中。
根据这些结果，清楚地观察到在与淀粉结合的比率和洗涤性能之间存在反相关。
实例2：与生米淀粉的结合和洗涤性能的确定
原理：
与实例1中所述的原理相同，仅使用5％(w/v)米淀粉(西格玛S7260)的悬液替代直链淀粉。在pH 8.0、以结合时间10分钟并且在4℃温度进行结合分析。
实例3：与支链淀粉的结合的确定
与实例1中所述的原理相同，仅使用5％(w/v)来自玉米的支链淀粉(来自佛鲁卡公司(Fluka))的悬液替代直链淀粉。
实例4：地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:13)的变体
产生具有SEQ ID NO:13的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体。与具有SEQ ID NO:13的亲本α-淀粉酶相比，测试的变体具有更低的淀粉结合和更好的洗涤性能。
在pH 8用5％(w/v)不溶性米淀粉以10分钟的结合时间并且在5℃温度进行了结合分析。
使用在“使用微型洗涤机器人的α-淀粉酶的洗涤性能”下描述的条件，通过使用微洗涤法测试变体的洗涤性能，并且显示与来自地衣芽孢杆菌的亲本α-淀粉酶相比，使用0.5mg/L在40℃的所述变体具有改善的洗涤性能。洗涤时间是20分钟。
洗涤性能＝值(变体-空白)/值(Termamyl-空白)*100
实例5：芽孢杆菌707α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的变体
产生了具有SEQ ID NO:2的α-淀粉酶的另外的变体并且对这些变体测试了底物结合，并且在模型洗涤剂X中使用0.3mg酶蛋白/L在15℃持续20分钟测试AMSA洗涤性能。
在pH 10.0用2.5％(w/v)不溶性米淀粉以10分钟的结合时间并且在4℃温度进行了结合分析。
该洗涤性能是相对于具有SEQ ID NO:2的具有修饰H183*+G184*的亲本α-淀粉酶的洗涤性能而表示的。
实例6：芽孢杆菌707α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的变体
产生具有SEQ ID NO:2到α-淀粉酶的其他变体并对这些变体测试底物结合和低温洗涤性能，并且选择了与具有SEQ ID NO:2的具有修饰H183*+G184*的亲本α-淀粉酶相比具有更低底物结合的变体。在模型洗涤剂X中使用0.3mg酶蛋白/L在15℃持续20分钟进行AMSA洗涤试验。
该洗涤性能是相对于具有SEQ ID NO:2的具有修饰H183*+G184*的亲本α-淀粉酶的洗涤性能而表示的。
实例7：芽孢杆菌707α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的变体
产生了具有SEQ ID NO:2的α-淀粉酶的其他变体并对这些变体测试了底物结合和低温洗涤性能，并且选择了与具有SEQ ID NO:2的具有修饰H183*+G184*的亲本α-淀粉酶相比具有更低底物结合的变体。在模型洗涤剂X中使用0.3mg酶蛋白/L在15℃持续20分钟进行AMSA洗涤试验。
在pH 8.0以10分钟的结合时间并且在4℃温度进行了结合分析。
该洗涤性能是相对于具有SEQ ID NO:2的具有修饰H183*+G184*的亲本α-淀粉酶的洗涤性能而表示的。
在此描述和要求保护的发明在范围上不受在此披露的具体方面限制，因为这些方面旨在说明本发明的若干方面。任何等同方面预期处于本发明的范围之内。实际上，除了在此显示和说明的那些修改之外，本发明的各种修改将因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。这样的修改也预期落入所附权利要求书的范围之内。在发生冲突的情况下，以包括定义在内的本披露为准。
1.用于筛选在低温具有高性能的α-淀粉酶的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定α-淀粉酶与α淀粉酶的固体或固定底物如淀粉的结合；
b)选择与所述底物具有低结合的α-淀粉酶。
2.如项1所述的方法，其中α-淀粉酶在低温具有高洗涤性能。
3.如项1或2所述的方法，其中所述α-淀粉酶比具有SEQ ID NO:8的α-淀粉酶具有小于90％的淀粉结合、优选地小于80％、优选地小于70％、优选地小于65％、优选地小于60％、优选地小于50％的所述结合、优选地小于40％的所述结合、优选地小于30％的所述结合、更优选地小于20％的所述结合和最优选地小于10％的所述结合。
4.用于选择亲本α-淀粉酶的变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过在位于亲本α-淀粉酶的表面处的一个或多个氨基酸中置换、缺失或插入一个或多个氨基酸残基产生变体；
b)检验变体与α-淀粉酶的固体或固定底物如淀粉的结合；
c)选择比亲本α-淀粉酶具有较低底物结合的变体。
5.如项3所述的方法，其中亲本α-淀粉酶选自与SEQ ID NO:1-15之一具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％一致性的淀粉酶。
6.如项4或5所述的方法，其中所述变体比亲本α-淀粉酶具有小于90％的淀粉结合，优选地小于80％、优选地小于70％、优选地小于65％、优选地小于60％、优选地小于50％的所述结合，优选地小于40％的所述结合，优选地小于30％的所述结合，更优选地小于20％的所述结合和最优选地小于10％的所述结合。
7.一种变体多肽，具有α-淀粉酶活性并且与SEQ ID NO:1-15之一具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％序列一致性和最优选地至少99％序列一致性，所述变体通过选自置换、插入和缺失的一种或多种(例如，几种)修饰衍生自亲本α-淀粉酶，其中与专利α-淀粉酶相比，所述变体α-淀粉酶具有较低的固体淀粉结合和较高的低温(例如15℃)洗涤性能。
8.如项7所述的变体α-淀粉酶，其中在分子表面的一个或多个底物结合位点内的氨基酸残基已经被修饰。
9.如项7所述的变体α-淀粉酶，所述变体α-淀粉酶选自：
a)与SEQ ID NO:2具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％序列一致性和最优选地至少99％序列一致性，并且包含位置181+182、或182+183、或183+184的缺失并且进一步包含在与SEQ ID NO:2中W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476和G477相应的任何位置内的一种或两种或更多种修饰的变体α-淀粉酶；
b)与SEQ ID NO:5具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％序列一致性和最优选地至少99％序列一致性，并且包含位置181+182、或182+183、或183+184的缺失并且进一步包含在与SEQ ID NO:5中W140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476和G477相应的任何位置内的一种或两种或更多种修饰的变体α-淀粉酶；
c)与SEQ ID NO:4具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％序列一致性和最优选地至少99％序列一致性，并且包含位置181+182、或182+183、或183+184的缺失并且进一步包含在与SEQ ID NO:4中W140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476和G477相应的任何位置内的一种或两种或更多种修饰的变体α-淀粉酶；
d)与SEQ ID NO:13具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％序列一致性和最优选地至少99％序列一致性，并且包含在与SEQ ID NO:13中W138、W157、W165、E167、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、K315、W342、R437、W467和G475相应的任何位置内的修饰的变体α-淀粉酶；
e)与SEQ ID NO:14具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％序列一致性和最优选地至少99％序列一致性，并且包含位置176+177、或177+178、或178+179的缺失并且进一步包含在与SEQ ID NO:14中W136、W155、W163、E165、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、R315、W342、R437、W467和G475相应的任何位置内的一种或两种或更多种修饰的变体α-淀粉酶；和
f)与SEQ ID NO:15具有至少80％序列一致性、优选地至少85％序列一致性、更优选至少90％序列一致性、更优选至少95％序列一致性、更优选至少97％序列一致性、更优选至少98％序列一致性和最优选地至少99％序列一致性，并且包含位置179+180、或180+181、或181+182的缺失并且进一步包含在与SEQ ID NO:15中W139、W158、W166、E168、W187、E192、F260、F287、G302、G303、W345、W437、W467、G474和G475相应的任何位置内的一种或两种或更多种修饰的变体α-淀粉酶，
其中a-f中的修饰优选地是置换。
10.如项7至9中任一项所述的变体α-淀粉酶，所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少90％序列一致性并且包含在与SEQ ID NO:2中以下位置相应的位置内的修饰：
H183*+G184*+W140F；
H183*+G184*+Q169N；
H183*+G184*+Q169A；
H183*+G184*+W189Y+E190P；
H183*+G184*+N260D；
H183*+G184*+G477E；
H183*+G184*+G477Q；
H183*+G184*+G477K；
H183*+G184*+W189E+E190P；
H183*+G184*+A51I+W140Y；
H183*+G184*+W140Y+W189E；
H183*+G184*+W140Y+N260P；
H183*+G184*+W140Y+W284D；
H183*+G184*+W140Y+G476R；
H183*+G184*+W140Y+G477E；
H183*+G184*+W189E+W439R；
H183*+G184*+W284D+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+W439R+G477E；
H183*+G184*+E194D；
H183*+G184*+W439R+D467K；
H183*+G184*+R320M+W439R；
H183*+G184*+W439R+K485R；
H183*+G184*+Y160S；
H183*+G184*+W189F+E190P；
H183*+G184*+F262A；
H183*+G184*+Y363H；
H183*+G184*+G476E；
H183*+G184*+N260P+W439R；
H183*+G184*+N260P+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+K72S+W140Y；
H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G；
H183*+G184*+E194S；
H183*+G184*+E345D+G477R；
H183*+G184*+K302N+W439R；
H183*+G184*+R320K+W439R
H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E；
H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q；和
H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q。
11.如项10所述的变体α-淀粉酶，所述变体α-淀粉酶由具有选自以下修饰的SEQID NO:2组成：
H183*+G184*+W140F；
H183*+G184*+Q169N；
H183*+G184*+Q169A；
H183*+G184*+W189Y+E190P；
H183*+G184*+N260D；
H183*+G184*+G477E；
H183*+G184*+G477Q；
H183*+G184*+G477K；
H183*+G184*+W189E+E190P；
H183*+G184*+A51I+W140Y；
H183*+G184*+W140Y+W189E；
H183*+G184*+W140Y+N260P；
H183*+G184*+W140Y+W284D；
H183*+G184*+W140Y+G476R；
H183*+G184*+W140Y+G477E；
H183*+G184*+W189E+W439R；
H183*+G184*+W284D+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+W439R+G477E；
H183*+G184*+E194D；
H183*+G184*+W439R+D467K；
H183*+G184*+R320M+W439R；
H183*+G184*+W439R+K485R；
H183*+G184*+Y160S；
H183*+G184*+W189F+E190P；
H183*+G184*+F262A；
H183*+G184*+Y363H；
H183*+G184*+G476E；
H183*+G184*+N260P+W439R；
H183*+G184*+N260P+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+K72S+W140Y；
H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G；
H183*+G184*+E194S；
H183*+G184*+E345D+G477R；
H183*+G184*+K302N+W439R；
H183*+G184*+R320K+W439R
H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E；
H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q；和
H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q。
12.如项7至9中任一项所述的变体α-淀粉酶，所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:14具有至少90％序列一致性并且包含在与SEQ ID NO:14中以下位置相应的位置内的修饰：
E178*+G179*；
E178*+G179*+T36N；
E178*+G179*+W136Y；
E178*+G179*+W155Y；
E178*+G179*+W155F；
E178*+G179*+W163Y；
E178*+G179*+G299E；
E178*+G179*+G299K；
E178*+G179*+G299R；
E178*+G179*+R315M；
E178*+G179*+R315A；
E178*+G179*+R315Q；和
E178*+G179*+W342Y。
13.如项12所述的变体，所述变体由具有选自以下修饰的SEQ ID NO:14组成：
E178*+G179*；
E178*+G179*+T36N；
E178*+G179*+W136Y；
E178*+G179*+W155Y；
E178*+G179*+W155F；
E178*+G179*+W163Y；
E178*+G179*+G299E；
E178*+G179*+G299K；
E178*+G179*+G299R；
E178*+G179*+R315M；
E178*+G179*+R315A；
E178*+G179*+R315Q；和
E178*+G179*+W342Y。
14.如项7所述的变体α-淀粉酶，所述变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:13具有至少90％序列一致性并且包含在与SEQ ID NO:13中的位置K315和/或W467相应的位置内的修饰。
15.如项14所述的变体，所述变体由具有置换K315M的SEQ ID NO:13组成。
16.包含如项7-15中任一项所述的变体α-淀粉酶的洗涤剂组合物。
17.如项7-15中任一项所述的变体α-淀粉酶的用途，用于清洁过程如衣物或硬质表面清洁，包括自动化餐具洗涤。
序列表
<110> 诺维信公司(Novozymes A/S)
<120> 用于筛选α-淀粉酶的方法
<130> 12087-WO-PCT
<160> 15
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌物种
<400> 1
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Arg
485
<210> 2
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌物种
<400> 2
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Lys
485
<210> 3
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌物种
<400> 3
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Lys
485
<210> 4
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌物种
<400> 4
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Lys Gln
485
<210> 5
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌物种
<400> 5
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Lys Gln
485
<210> 6
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌物种
<400> 6
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ala Leu Lys Ser Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Trp Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Ile
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Arg Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Asp Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Met Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Asn
485
<210> 7
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1的变体
<400> 7
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ser Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala Thr Gly
245 250 255
Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala
260 265 270
Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp
275 280 285
Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Asn
290 295 300
Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro
305 310 315 320
Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu
325 330 335
Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn
405 410 415
Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly Gln Val
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala
450 455 460
Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp
465 470 475 480
Val Lys Arg
<210> 8
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:2的变体
<400> 8
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly
245 250 255
Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala
260 265 270
Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp
275 280 285
Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn
290 295 300
Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro
305 310 315 320
Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu
325 330 335
Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys Gln Asn
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn
405 410 415
Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val
435 440 445
Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp
465 470 475 480
Val Asn Lys
<210> 9
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:3的变体
<400> 9
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly
245 250 255
Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala
260 265 270
Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp
275 280 285
Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn
290 295 300
Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro
305 310 315 320
Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu
325 330 335
Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn
405 410 415
Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala
420 425 430
Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val
435 440 445
Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp
465 470 475 480
Val Asn Lys
<210> 10
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:4的变体
<400> 10
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala
260 265 270
Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe Asp
275 280 285
Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr
290 295 300
Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His Pro
305 310 315 320
Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu
325 330 335
Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn
405 410 415
Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Asn Lys Ala Gly Gln Val
435 440 445
Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Lys Gln
<210> 11
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5的变体
<400> 11
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ile Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Ala Ala
260 265 270
Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe Asp
275 280 285
Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr
290 295 300
Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His Pro
305 310 315 320
Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu
325 330 335
Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly Gln Val
435 440 445
Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Lys Gln
<210> 12
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:6的变体
<400> 12
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ala Leu Lys Ser Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Trp Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly
245 250 255
Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Ile Gly Ala
260 265 270
Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp
275 280 285
Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Arg Ser Gly Gly Asn
290 295 300
Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro
305 310 315 320
Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu
325 330 335
Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Leu Thr Leu Thr Arg Asp Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys Gln Asn
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His His Asn Met Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn
405 410 415
Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val
435 440 445
Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp
465 470 475 480
Val Asn Asn
<210> 13
<211> 483
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 13
Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu
20 25 30
Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Arg Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Ser Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ala
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 14
<211> 483
<212> PRT
<213> 解淀粉芽胞杆菌
<400> 14
Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp
20 25 30
Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser
35 40 45
Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu
50 55 60
Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu
65 70 75 80
Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr
85 90 95
Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp
100 105 110
Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg
130 135 140
Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly
145 150 155 160
Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg
165 170 175
Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Lys
<210> 15
<211> 515
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌
<400> 15
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp Pro
515
1
- 用于筛选α-淀粉酶的方法
- 用于筛选α-淀粉酶的方法