喜树碱类-聚己内酯偶联前药、制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物合成技术领域，具体是涉及一种喜树碱类-聚己内酯偶联前药、制剂及其制备方法与应用。

背景技术

7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)是一种喜树碱类抗肿瘤活性分子，具有广谱的抗肿瘤活性，其通过与DNA、拓扑异构酶I结合形成三元复合物，从而高效阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞的增殖。但是极差的水溶性(<2μg/mL)和较低的口服生物利用度，使其临床转化异常困难。伊立替康(Irinotecan,CPT-11)作为一种SN38的水溶性前药，自1996年经美国FDA批准上市后，已被用于结直肠癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌等多种恶性肿瘤的治疗，但其过低的酶解效率得药效大大受限。CPT-11在体内仅能通过羧酸酯酶2酶解为活性成分SN38，而酶解产率仅为2-8％，使得其活性仅为SN38的千分之一到百分之一。此外，众多临床实例表明CPT-11具有较严重的胃肠道副作用，导致患者发生药物腹泻。基于SN38的水溶性小分子前药CPT-11在临床应用中的限制和纳米载药系统在改善药效与副作用上的潜力，开发新型SN38聚合物前药并通过纳米技术实现全身给药，有望延长药物的体内循环时间，通过避免酶解限速步骤而极大改善其体内转化率，并通过被动靶向肿瘤效应而降低药物对正常组织的暴露，最终提高药效并降低体内毒副作用。

发明内容

本发明提供了一种喜树碱类-聚己内酯偶联前药、制备方法、制剂及其应用。

一种喜树碱类-聚己内酯偶联前药，包括如下式所示化合物中的一种或多种：

R

R

R

R来自于能够引发己内酯开环聚合的引发剂；

n＝2～300；

m＝1～20。

作为进一步优选，所述n为2～100；m为1～10。

作为优选，包括如下式所示化合物中的一种或多种：

本发明将无毒且具有很好的生物相容性和生物可降解性的聚己内酯链(PCL)分别与7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)或喜树碱(CPT)的羟基共价偶联，得到7-乙基-10-羟基喜树碱-聚己内酯偶联前药和喜树碱-聚己内酯前药，再将合成得到的喜树碱类-聚己内酯偶联前药与助剂共溶形成纳米粒，具有较好的抗肿瘤活性。

作为优选，所述R为C1～C10烷氧基，苯基取代C1～C10烷氧基、其中的C1～C10烷基中一个或多个C原子可以被O取代。作为进一步优选，所述R为苯取代丁氧基、苯取代丙氧基、苯取代乙氧基、羟基乙氧基、取代羟基乙氧基等。作为更进一步优选，所述R为苯取代丁氧基或取代羟基乙氧基，取代基优选为乙氧基、羟基乙氧基或者羟基乙氧乙基等。

本发明提供了一种喜树碱类-聚己内酯偶联前药的制备方法，包括：式(I-1)所述的化合物与式(I-2)所示的化合物进行缩合反应，得到所述的喜树碱类-聚己内酯偶联前药；

其中：

R

R

R来自于能够引发己内酯开环聚合的引发剂；

n＝2～300；

m＝1～20；

所述式(I-2)所示的化合物可以替换为对应的酰氯或者酸酐。

作为优选，所述式(I-1)所示的化合物选自7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)或喜树碱(CPT)等。

本发明反应时，R

作为优选，反应时可选择的加入催化剂或/和缩合剂，所述催化剂或/和缩合剂为酯化反应常用的催化剂或者缩合剂等。

本发明提供了一种上述喜树碱类-聚己内酯偶联前药的制备方法，包括：缩合剂和催化剂作用下，7-乙基-10-羟基喜树碱与聚己内酯发生酯化反应，得到所述的7-乙基-10-羟基喜树碱-聚己内酯偶联前药；喜树碱与聚己内酯发生酯化反应，得到所述的喜树碱类-聚己内酯偶联前药。

所述聚己内酯结构式如下：

一种喜树碱类-聚己内酯偶联前药制剂，其特征在于，包含上述任一项所述的喜树碱类-聚己内酯偶联前药。

作为优选，一种喜树碱类-聚己内酯偶联前药制剂，包括所述的7-乙基-10-羟基喜树碱-聚己内酯偶联前药或喜树碱类-聚己内酯偶联前药和助剂。

作为优选，所述制剂中还包括助剂。

作为优选，所述助剂可为聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(PEG-PLGA)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、卵磷脂(Egg-PC)、胆固醇(Cholesterol)、细胞膜(cell membrane)、吐温(Tween)、司盘(Span)、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG)中的一种或多种。

作为优选，所述喜树碱类-聚己内酯偶联前药制剂为平均粒径均在10-500nm的纳米颗粒。

一种喜树碱类-聚己内酯偶联前药制剂的制备方法，包括：将喜树碱类-聚己内酯偶联前药与助剂溶于有机溶剂并混合均匀，匀速滴入水相后除去有机溶剂，得到均匀分散的纳米粒。

作为优选，一种所述喜树碱类-聚己内酯偶联前药制剂的制备方法，包括：将7-乙基-10-羟基喜树碱-聚己内酯偶联前药或喜树碱类-聚己内酯偶联前药与助剂溶于有机溶剂并混合均匀，匀速滴入水相后除去有机溶剂，得到均匀分散的纳米粒。

制备过程中，可选择分别将7-乙基-10-羟基喜树碱-聚己内酯偶联前药或喜树碱类-聚己内酯偶联前药和助剂分别溶解在一定体积的有机溶剂中，然后再将两个有机溶剂溶液混合均匀，最后将混合均匀的溶液加入到水相中。

一种上述任一项所述喜树碱类-聚己内酯偶联前药制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供了以上喜树碱类-聚己内酯前药纳米粒的粒径分布图以及扫描电镜图，其平均粒径均在10-500nm范围内。

本发明还提供了喜树碱类-聚己内酯纳米粒在37℃、含有0.4％吐温80的磷酸缓冲液中的释放实验。实验结果表明，7-乙基-10-羟基喜树碱-聚己内酯前药纳米粒中7-乙基-10-羟基喜树碱释放缓慢，且聚己内酯链越长，其释放速率越慢。

本发明制备得到的喜树碱类前药纳米粒缓慢释放药物分子，可以延长体内循环周期。纳米粒粒径较小，易通过肿瘤部位的EPR效应，在肿瘤部位积累，降低对正常组织的损伤，更好地发挥抗肿瘤效果。

本发明还提供了喜树碱类前药纳米粒的细胞毒性实验、药代动力学实验、动物副作用及动物药效实验。细胞毒性实验结果进一步表明喜树碱类前药纳米粒药物虽然释放缓慢但其仍然显示出和游离活性分子相当的药效。药代动力学实验表明，相比临床广泛使用的伊立替康(CPT-11)，喜树碱类前药纳米粒显著延长了药物在血液内的循环时间，并表现出聚己内酯链越长，体内循环时间越长的特性。动物副作用实验结果表明，喜树碱类前药纳米粒药物几乎不引起便血副作用，而临床广泛使用的伊立替康组的小鼠表现出明显的便血毒副作用，这说明了喜树碱类前药纳米粒显著降低了游离活性分子的胃肠道毒性。裸鼠肿瘤实验进一步评价了喜树碱类前药纳米粒的药效，结果表明，与生理盐水对照组相比，喜树碱类前药纳米粒组的肿瘤缩小了2.9～23.7倍；相比临床广泛使用的伊立替康，喜树碱类前药纳米粒组的肿瘤缩小了1.9～15.9倍，并表现出聚己内酯链越长，抗肿瘤效果越卓越的特性。

本发明在喜树碱或7-乙基-10-羟基喜树碱的羟基位点偶联不同分子量的聚己内酯链(PCL)，得到喜树碱类系列前药。将喜树碱类系列前药与助剂共溶于有机试剂中，滴入纯化水后除去有机试剂形成直径约10-500nm的纳米粒。纳米粒具有被动靶向作用，可以通过肿瘤部位的EPR效应更好地滞留在肿瘤部位，从而发挥药效。同时，喜树碱类前药纳米粒具有缓释的特性，可以缓慢释放出活性分子，延长了药物的体内循环周期，降低了药物对正常组织的暴露，降低了毒副作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)将多种不同分子量的聚己内酯与喜树碱或7-乙基-10-羟基喜树碱共价偶联，可以调控其在体内的释放速率，防止活性分子因暴释而析出，延长其在体内的循环时间。

(2)聚己内酯是一种无毒、生物降解性优越、生物相容性良好且免疫原性低的聚合物，可在体内降解后通过肾脏完全排出体外。同时，聚己内酯已被美国FDA批准用于临床，具有很好的临床应用前景。

(3)喜树碱类前药纳米粒能够通过EPR效应被动靶向肿瘤部位，从而大大增加药物在肿瘤部位的积蓄，并通过降低其对正常组织的暴露，改善毒副作用。

附图说明

图1为实施例1mPCL

图2为实施例2mPCL

图3为实施例3mPCL

图4为实施例4mPCL

图5为实施例5mPCL

图6为实施例6mPCL

图7为实施例7mPCL

图8为实施例8mPCL

图9为实施例9mPCL

图10为实施例10mPCL

图11为实施例11pPCL

图12为实施例12pPCL

图13为实施例13pPCL

图14-17为实施例2-5mPCL

图18-21为实施例14-17mPCL

图22-24为实施例14-16mPCL

图25为实施例14-16mPCL

图26为实施例14-16mPCL

图27为实施例14-16mPCL

图28-29为实施例14-16mPCL

图30-31为实施例14-16mPCL

具体实施方式

以下具体实施方式用来进一步说明本发明。

mPCL

第一步：mPCL

向三乙二醇单甲醚(0.931g，1.0eqv.)和ε-己内酯(9.069g，14.0eqv.)无水甲苯(50ml)溶液中添加催化量的Sn(Oct)

第二步：mPCL

向端羟基低聚物14(8.021g，1.0eqv.)和琥珀酸酐(2.279g，5.0eqv.)的无水DCM(30ml)溶液中添加无水吡啶(1.440g，4.0eqv.)。将混合物加热回流反应五天，随后用5％柠檬酸、饱和NaHCO

实施例中采用的mPCL

实施例1mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，200.0mg，0.5097mmol)、mPCL

实施例2mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，300.0mg，0.7645mmol)、mPoCL

产物2的

实施例3mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，350.0mg，0.8919mmol)、mPCL

产物3的

实施例4mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，250.0mg，0.6371mmol)、mPCL

产物4的

实施例5mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，200.0mg，0.5097mmol)、mPCL

产物5的

实施例6mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，200.0mg，0.5097mmol)、mPCL

实施例7mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，220.0mg，0.5607mmol)、mPCL

实施例8mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，200.0mg，0.5097mmol)、mPCL

实施例9mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，250.0mg，0.6371mmol)、mPCL

实施例10mPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入喜树碱(CPT，221.9mg，0.6371mmol)、mPCL

实施例11pPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，250.0mg，0.6371mmol)、pPCL

实施例12pPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，250.0mg，0.6371mmol)、pPCL

实施例13pPCL

在装有球形冷凝管的100mL圆底烧瓶中依次加入喜树碱(CPT，221.9mg，0.6371mmol)、pPCL

实施例14基于PEG-PCL材料的前药2纳米粒的制备

将mPCL

实施例15基于PEG-PCL材料的前药3纳米粒的制备

将mPCL

实施例16基于PEG-PCL材料的前药4纳米粒的制备

将mPCL

实施例17基于PEG-PCL材料的前药5纳米粒的制备

将mPCL

实施例19基于PEG-PLA材料的前药4纳米粒的制备

将mPCL

实施例20基于DEPE-PEG

将mPCL

实施例21基于脂质体载体的前药4纳米粒的制备

将mPCL

实施例21基于聚乙二醇(PEG)的前药4纳米粒的制备

将mPCL

实施例22基于PEG-PCL材料的前药2-4纳米粒的体外释放

将实施例14-16中制备的纳米药物3mL分别置于分子量为7000kDa的透析袋中，置于外界20mL pH为7.4的磷酸缓冲液中，在温度为37℃，转速为150r/min的环境中，分别在2h，4h，8h，12h，24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h取出外界磷酸缓冲液，通过紫外分光光度计检测，从而得到3个纳米药物的相应的体外释放情况。由图25可知，聚己内酯分子量越高，释放越缓慢。

实施例23基于PEG-PCL材料的前药2-4纳米粒的体外细胞毒性实验本发明通过MTT法考察游离型伊立替康(CPT-11)、7-基-10-羟基喜树碱(SN38)和实施例实施例14-16中制备的纳米药物对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明对HCT-116、HT-29和CT-26细胞进行了体外细胞毒性实验，实验结果如图26和表1所示。表1结果表明，相比于临床中广泛使用的CPT-11，实施例14-16中制备的纳米药物的细胞毒性提高幅度极大，并且其细胞毒性相较free SN38没有明显的下降，说明了前药纳米粒保持了优越的体外细胞毒性。

表1.药物作用72小时后细胞成活率的测定IC

注：括号()中的数值表示相对于CPT-11的数值倍数。

实施例24基于PEG-PCL材料的前药2-4纳米粒的药代动力学性质

本发明将SD大鼠(每只约200g)作为实验对象，评价free CPT-11、mPCL

实施例25基于PEG-PCL材料的前药2-4纳米粒的体内毒性实验

本发明将ICR小白鼠(每只约25g)作为实验对象，评价free CPT-11、free CPT-11、mPCL

实施例26基于PEG-PCL材料的前药2-4纳米粒的抑肿瘤效果实验

本发明采用HCT-116人结肠癌异种移植裸鼠模型对实施例14-16中制备的纳米药物进行抑瘤效果评价。当裸鼠皮下肿瘤体积达到300mm