一种抗FGF19抗体及其应用

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，涉及一种抗FGF19抗体及其应用。

背景技术

人成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路在细胞增殖、分化和血管生成等多种细胞进程中发挥着重要作用。人成纤维细胞生长因子19（FGF19）是FGF蛋白家族的一员，基因位于11q13.1，分子量约为21 kDa，为分泌型蛋白。FGF19表达于胎儿脑、软骨、视网膜、成人胆囊以及肿瘤细胞中。

研究表明，FGFR4是FGF19的唯一特异性受体。FGF19和FGFR4结合可以抑制细胞凋亡和NF-κβ信号，上调细胞增殖相关基因，从而促进肿瘤细胞的增殖。FGF19的扩增和过表达与恶性肿瘤的发生和发展密切相关，如在肝细胞癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、骨髓瘤等肿瘤组织中，FGF19的表达显著高于正常组织。进一步的研究显示，人肝细胞癌细胞中FGF19通过激活肝细胞表面的FGFR4，从而引起肝细胞增殖和肝细胞癌形成。因此，FGF19是肝细胞癌（HCC）的潜在治疗靶点。

BLU-554是处于临床试验阶段的新型靶向药，作用靶点是FGFR4。针对FGF19-FGFR4信号通路异常的晚期肝细胞癌的I期试验数据显示，BLU-554对66例FGF19免疫组化阳性（TC≥1%，IHC+）患者的总缓解率为17%，而对32例FGF19免疫组化阴性（TC<1%，IHC-）患者的总缓解率为0%，说明FGF19的表达水平可指导FGFR4抑制剂的使用。因此，制备一种高特异性和灵敏度的抗FGF19抗体是临床诊断所必需的。

目前，市场上能够特异性并高灵敏检测FGF19的抗体数量极少，尤其是能够应用于免疫组织化学（IHC）的抗FGF19单克隆抗体。经过对商品化试剂的查新和筛选，市场上针对人FGF19的单克隆抗体中，特异性和灵敏度较好的抗体包括CST的克隆D1N3R（货号83348）、Santa Cruz的克隆H-12（货号sc-390621）和义翘神州的克隆#032（货号12226-R032）。

因此，制备特异性强、灵敏度高、应用范围广的抗FGF19单克隆抗体，具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种抗FGF19抗体及其应用，所述抗FGF19抗体对FGF19具有特异性高亲和力，在制备FGF19检测试剂盒中具有重要的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗FGF19抗体，所述抗FGF19抗体由杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系命名为鼠抗人FGF19单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ19-7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101，保藏编号为CGMCC No. 21492，保藏日期为2021年1月20日。

本发明中，采用SEQ ID NO: 1所示的人源FGF19重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合形成杂交瘤细胞，筛选出灵敏度和特异性最强的杂交瘤细胞系克隆MJ19-7用于制备抗FGF19抗体。

优选地，所述抗FGF19抗体的抗原为人源FGF19蛋白。

优选地，所述人源FGF19蛋白包括SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗FGF19抗体为重链IgG1、轻链κ型鼠源单克隆抗体。

优选地，当所述抗FGF19抗体应用于构建FGF19检测试剂盒时，所述抗FGF19抗体可以修饰有缀合物，所述缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）、Cy3、Cy5等，连接方式包括化学键偶联、静电吸附或亲疏水性吸附。

第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的抗FGF19抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）取经人源FGF19蛋白免疫的小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；

（2）利用制备的杂交瘤细胞免疫小鼠，从小鼠中获得抗FGF19抗体。

第三方面，本发明提供了一种FGF19免疫组织化学检测试剂盒，所述FGF19免疫组织化学检测试剂盒包括第一方面所述的抗FGF19抗体。

优选地，所述FGF19免疫组织化学检测试剂盒还包括免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂或苏木素复染液中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供了一种FGF19免疫印迹检测试剂盒，所述FGF19免疫印迹检测试剂盒包括第一方面所述的抗FGF19抗体。

优选地，所述FGF19免疫印迹检测试剂盒还包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、封闭液或酶标二抗中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明提供了一种FGF19酶联免疫吸附检测试剂盒，所述酶联免疫吸附检测试剂盒包括第一方面所述的抗FGF19抗体包被的酶标板。

优选地，所述酶联免疫吸附检测试剂盒还包括封闭液、酶标二抗、显色液或终止液中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了一种FGF19免疫荧光检测试剂盒，所述FGF19免疫荧光检测试剂盒包括第一方面所述的抗FGF19抗体。

优选地，所述抗FGF19抗体修饰有荧光基团，优选为FITC、Cy3或Cy5中的任意一种。

第七方面，本发明提供了一种FGF19流式细胞术检测试剂盒，所述FGF19流式细胞术检测试剂盒包括第一方面所述的抗FGF19抗体。

第八方面，本发明提供了第一方面所述的抗FGF19抗体、第三方面所述的FGF19免疫组织化学检测试剂盒、第四方面所述的FGF19免疫印迹检测试剂盒、第五方面所述的FGF19酶联免疫吸附检测试剂盒、第六方面所述的FGF19免疫荧光检测试剂盒或第七方面所述的FGF19流式细胞术检测试剂盒在制备FGF19蛋白表达检测产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明将经过人源FGF19重组蛋白免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合形成杂交瘤细胞，制备的抗FGF19单克隆抗体的特异性好，与人源FGF19亲和力强；

（2）本发明基于抗FGF19单克隆抗体的人源FGF19检测试剂盒灵敏度高，相较于市售商品可以准确检测不同临床样本中FGF19蛋白的表达水平，在特异性、灵敏度方面均优于市售商品，具有重要的应用前景。

附图说明

图1为人源FGF19重组蛋白Western Blot验证图，其中，泳道1为阳性对照，泳道2和3为阴性对照，泳道4为人源FGF19重组蛋白，M为蛋白marker；

图2为纯化后的人源FGF19重组蛋白SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为BSA，泳道2为纯化后的人源FGF19重组蛋白，泳道M为蛋白marker；

图3为杂交瘤细胞系克隆MJ19-1至MJ19-32的间接ELISA法检测结果图；

图4为纯化后的克隆MJ19-7单克隆抗体SDS-PAGE电泳验证图，其中，泳道1为BSA，泳道2为纯化后的单克隆抗体，泳道M为蛋白marker；

图5为纯化后的克隆MJ19-7单克隆抗体特异性验证ELISA结果图，其中，商品化单克隆抗体分别为CST的克隆D1N3R（货号83348）、Santa Cruz的克隆H-12（货号sc-390621）、义翘神州的克隆#032（货号12226-R032）；

图6为纯化后的克隆MJ19-7单克隆抗体进行免疫组化实验检测人胆囊组织、正常肝组织和不同FGF19表达水平的肝细胞癌组织的结果图，其中，商品化单克隆抗体分别为CST的克隆D1N3R（货号83348）、Santa Cruz的克隆H-12（货号sc-390621）、义翘神州的克隆#032（货号12226-R032）；

图7为纯化后的克隆MJ19-7单克隆抗体进行免疫印迹实验检测不同表达来源的FGF19蛋白的结果图，其中，泳道1为原核表达的FGF19蛋白，泳道2为真核表达的FGF19蛋白，泳道3真核表达阳性对照，泳道M为蛋白marker。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 人源FGF19抗原的制备

人源FGF19蛋白（O95750）的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，本实施例利用同源重组的方法将FGF19基因与pcDNA3.4连接，构建重组载体pcDNA3.4-FGF19；

SEQ ID NO: 1：

LAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK；

将pcDNA3.4-FGF19瞬时转染293F细胞，培养120 h后收获细胞培养物，进行Western Blot验证。

由图1可知，人源FGF19蛋白成功表达，该重组蛋白的C端带有His标签，大小约为22.3 KD。采用AKTA仪器对重组蛋白进行亲和纯化，并进行SDS-PAGE凝胶电泳，检验蛋白的大小和纯度。结果见图2，纯化后的FGF19蛋白条带位置正确，纯度>95%。

实施例2 抗FGF19杂交瘤的制备

1）免疫

将纯化的人源FGF19重组蛋白腹部皮下免疫4~6周龄的雌性Balb/c小鼠（免疫前眼眶取20 µL血清作为阴性对照）；每只小鼠的首次免疫剂量为50 µg FGF19重组蛋白用生理盐水稀释至200 µL，与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后注射；每14天皮下加强免疫一次，剂量为25 µg FGF19重组蛋白用生理盐水稀释至200 µL，与等体积弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后注射；第3次加强免疫后7天眼眶取血，ELISA检测血清抗体效价，达到要求的小鼠进行冲击免疫，免疫剂量为50 µg FGF19重组蛋白用生理盐水稀释至100 µL，腹腔注射，待3天后进行融合。

2）融合

将新鲜摘下的小鼠脾脏置于细胞筛上碾碎过滤，与SP2/0细胞按3:1的比例混合，1000 rpm室温离心5 min，弃去培养基；将装有细胞沉淀的离心管放入37℃水浴中，边搅动边缓慢加入1 mL聚乙二醇溶液（Sigma，P7181-5X5ML）；水浴中静置1 min后，缓慢加入10 mL无血清DMEM培养基（Hyclone克隆，SH30243.01B），1000 rpm离心5 min，弃上清；根据细胞总数加入一定量的含血清DMEM培养基，并将细胞接种到96孔细胞培养板中，使细胞密度为1×10

3）筛选

待细胞量大约占培养皿底面积1/2时，取细胞培养上清进行间接ELISA法检测，筛选分泌抗FGF19抗体的杂交瘤细胞株，对阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。

间接ELISA法的操作步骤如下：用100 µL含0.5 µg/mL人源FGF19重组蛋白的抗原包被酶标板，以1:5000免疫小鼠血清作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清作为阴性对照，每孔加入100 µL 1:5000 HRP-山羊抗小鼠IgG，测定450 nm OD值，OD450值大于0.5的，判定为可以进行亚克隆的阳性克隆。

4）杂交瘤细胞系的建立

经过3次亚克隆和间接ELISA筛选，共筛选得到32株针对FGF19的、稳定分泌抗FGF19单克隆抗体的杂交瘤细胞系，克隆号为MJ19-1至MJ19-32，间接法ELISA结果如图3所示。结合IHC检测结果，挑选出灵敏度和特异性最强的一株杂交瘤细胞系克隆，命名为鼠抗人FGF19单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ19-7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101，保藏编号为CGMCCNo. 21492，保藏日期2021年1月20日。

实施例3 基于杂交瘤细胞系MJ19-7制备抗FGF19单克隆抗体MJ19-7

1）腹水制备

取对数生长期的MJ19-7杂交瘤细胞用无血清培养基洗涤并重悬，使细胞密度为5×10

2）单克隆抗体亚型鉴定

用100 mM PBS（pH7.4）稀释羊抗鼠IgG（杭州索莱尔博奥生物技术有限公司，SL200101）至1 µg/mL，每孔加入100 µL至酶标板中，4℃包被过夜；倾空液体，用含0.05%Tween-20的PBST清洗5次，每孔加入300 µL封闭液，37℃封闭1 h；倾空液体，用PBST清洗5次，每孔加入100 µL MJ19-7杂交瘤细胞上清，37℃孵育1 h；倾空液体，用PBST清洗5次，每孔加入100 µL用封闭液1:5000稀释的HRP标记山羊抗鼠（κ、λ）抗体或1:5000稀释的HRP标记山羊抗鼠（IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3）抗体，37℃孵育1 h；倾空液体，用PBST清洗5次，每孔加入100 µL底物溶液，室温显色5 min，在450 nm波长下测OD值。结果显示，克隆MJ19-7单克隆抗体为重链IgG1、轻链κ型鼠源单克隆抗体。

3）单克隆抗体的纯化

采用HiTrap rProtein G FF（GE Healthcare，17061802）亲和层析填料及AKTA系统，从腹水中纯化单克隆抗体，并采用SDS-PAGE胶进行鉴定纯度和Nanodrop进行浓度测定。SDS-PAGE结果见图4，纯化后的抗FGF19单克隆抗体MJ19-7条带位置正确，纯度>95%。

实施例4 抗FGF19单克隆抗体MJ19-7的特异性检测

人源FGF19与鼠源FGF15（mFGF15）、人源FGF21、人源FGF23具有较高的同源性，本实施例采用间接ELISA法检测克隆MJ19-7单克隆抗体的特异性，步骤如下：

分别采用100 µL含0.5 µg/mL真核表达的人FGF19重组蛋白、原核表达的人FGF19重组蛋白、小鼠FGF15（mFGF15）、人FGF21、人FGF23的抗原包被酶标板；加入100 µL浓度为1µg/mL纯化后的克隆MJ19-7抗体，以抗体稀释液作为阴性对照，以CST的克隆D1N3R（货号83348）、Santa Cruz的克隆H-12（货号sc-390621）、义翘神州的克隆#032（货号12226-R032）作为阳性对照，加入量与克隆MJ19-7一致；每孔加入100 µL 1:5000 HRP-山羊抗鼠IgG，最后测定450 nm OD值。

结果如图5所示，克隆MJ19-7单克隆抗体能够特异性识别真核FGF19蛋白和原核FGF19蛋白，但是不识别小鼠FGF15（mFGF15）、人FGF21和人FGF23；义翘神州的克隆#032单克隆抗体对人FGF23有交叉识别，特异性较差。在抗体用量相同的情况下，相较于商品化的3个抗体，克隆MJ19-7对FGF19蛋白的识别OD值最高，说明其灵敏度高于商品化的3个抗体。

实施例5 基于抗FGF19单克隆抗体MJ19-7的免疫组化检测

本实施例采用的临床样本人体胆囊组织、正常肝组织和肝细胞癌组织来源于迈杰转化医学研究（苏州）有限公司的组织样本库，样本经过福尔马林固定和石蜡包埋处理，并进行了病理证实，具有患者知情同意书；其中，人胆囊组织为FGF19表达阳性组织，作为阳性对照，正常肝组织为FGF19表达阴性组织，作为阴性对照，肝细胞癌样本1、2、3，分别为FGF19表达强阳性、中阳性及弱阳性组织；

样本经过烤片后，在Leica BOND-MAX（国械备20140277）全自动组化系统上进行免疫组化（IHC）检测，具体程序如表1所示，其中，一抗用量为抗体的最适使用浓度，商品化单克隆抗体分别为CST的克隆D1N3R（货号83348）、Santa Cruz的克隆H-12（货号sc-390621）、义翘神州的克隆#032（货号12226-R032）。

表1

免疫组化结果图6显示，采用克隆MJ19-7单克隆抗体检测人正常胆囊组织FGF19表达呈强阳性，正常肝组织FGF19表达呈阴性，三种不同来源的肝细胞癌组织FGF19表达分别呈强阳性、中阳性和弱阳性，结果符合前期的验证结果；3种商品化抗体中，H-12在正常肝组织上有明显染色，说明其特异性较差；D1N3R在中阳性和弱阳性肝细胞癌组织上未能检出FGF19表达，说明其灵敏度较差；#032在正常肝组织上有明显染色且背景较深，说明其特异性较差。因此，克隆MJ19-7单克隆抗体能够特异性检测FGF19在肝细胞癌组织中的表达，且灵敏度高、特异性强，能有效检测不同组织样本的FGF19表达情况。

实施例6 基于抗FGF19单克隆抗体MJ19-7的免疫印迹检测

将真核表达的FGF19蛋白和原核表达的FGF19蛋白各0.5 µg上样于15% SDS-PAGE胶，并以相同上样量的真核商品化蛋白作为阳性对照；电泳结束后，将SDS-PAGE胶在1×转移液中浸泡10 min，PVDF膜用甲醇处理后100 V转膜60 min；将膜置于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中37℃封闭1 h；加入2 µg/mL纯化后的抗FGF19单克隆抗体MJ19-7，室温孵育60min；加入HRP-山羊抗鼠IgG 1:5000稀释液室温孵育60 min，用ChemiDoc™ MP成像系统曝光。

结果如图7所示，克隆MJ19-7单克隆抗体能够用于免疫印迹实验，检测不同表达来源的FGF19蛋白。

综上所述，本发明构建杂交瘤细胞系制备抗FGF19单克隆抗体，得到的抗FGF19单克隆抗体特异性好、灵敏度高、与人源FGF19亲和力强，在FGF19蛋白检测领域具有潜在的应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 迈杰转化医学研究（苏州）有限公司

<120> 一种抗FGF19抗体及其应用

<130> 20210209

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp

1 5 10 15

Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser

20 25 30

Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg

35 40 45

Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg

50 55 60

Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly

65 70 75 80

Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys

85 90 95

Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser

100 105 110

Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln

115 120 125

Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met

130 135 140

Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu

145 150 155 160

Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe

165 170 175

Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys

180 185 190