一种发酵中药免疫增强剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种发酵中药免疫增强剂及其制备方法和应用。

背景技术

羔羊断奶会有多种应激反应，此阶段内断奶羔羊常表现为免疫力低下，易感染多种病原，临床上普遍使用抗生素进行预防。然而抗生素在杀灭病原菌的同时，也会导致药物残留、使细菌产生耐药性、动物肠道菌群失调等问题，严重影响畜牧业的健康发展和危害公共卫生安全。越来越多的国家禁止把抗生素类产品作为动物促生长剂，我国也先后颁布了一系列法律法规禁止促生长用抗生素在饲料中的使用。因此，研发新型的既能增强动物抵抗力又具有促进生长作用的抗生素替代品已经迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种发酵中药免疫增强剂及其制备方法和应用。本发明提供的发酵中药免疫增强剂能够显著提高机体免疫力，替代抗生素的使用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种发酵中药免疫增强剂，所述发酵中药免疫增强剂由板蓝根和黄芪进行水提后发酵得到。

优选的，所述发酵的发酵菌包括枯草芽孢杆菌。

本发明提供了上述技术方案所述的中药免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：将板蓝根和黄芪进行水提，获得水提物，将所述水提物与LB基础培养基混合，得到发酵培养基；将发酵菌接种到所述发酵培养基中进行发酵，得到发酵中药免疫增强剂。

优选的，所述水提包括以下步骤：将黄芪和板蓝根加水浸泡、煎煮，过滤取滤液进行浓缩，得到水提物。

优选的，所述黄芪和板蓝根的质量比为(1～5)：1；所述黄芪和板蓝根的总质量与每次加水的体积比为1g：(3～20)mL；所述浸泡的时间为20～60min；所述煎煮的温度为90～100℃，所述煎煮的时间为30～60min；所述煎煮的次数为1～3次。

优选的，所述水提物与LB基础培养基的体积比为1：(1～5)。

优选的，所述LB基础培养基包括以下质量浓度的组分：蛋白胨1～10g/L，酵母浸粉10～30g/L，葡萄糖10～50g/L，MnSO

优选的，所述发酵菌的接种量为1％～10％。

优选的，所述发酵的温度为30～40℃，所述发酵的时间为24～48h。

本发明提供了上述技术方案所述的发酵中药免疫增强剂或上述技术方案所述的制备方法得到的中药免疫增强剂在畜牧养殖中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种发酵中药免疫增强剂，所述发酵中药免疫增强剂由板蓝根和黄芪进行水提后发酵得到。本发明将板蓝根和黄芪进行水提并发酵，发酵后的中药不仅提高了药效，显著提高了机体免疫力和十二指肠内菌群的丰富度和多样性，缓解了绵羊断奶期的各种应激反应，而且具有残留低、毒副作用低的优势，可用于替代抗生素的使用。实施例的结果表明：本发明提供的发酵中药免疫增强剂显著提高了多糖含量，将本发明的发酵中药免疫增强剂饲喂断奶绵羊后，显著提高了绵羊免疫力，促进绵羊生长，显著缓解了断奶绵羊的应激反应。

附图说明

图1为实施例5中葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种发酵中药免疫增强剂，所述发酵中药免疫增强剂由板蓝根和黄芪进行水提和发酵得到。在本发明中，对板蓝根和黄芪的来源没有特殊要求，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述板蓝根和黄芪优选板分别为蓝根饮片和黄芪饮片，板蓝根饮片和黄芪饮片采用普通市售产品即可。在本发明中，所述发酵的发酵菌优选包括枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌优选为河南农业大学牧医工程学院微生物实验室分离鉴定保存的编号为Y5的枯草芽孢杆菌，该菌为现有菌株，参考文献为：张红英等.芽孢杆菌抗菌活性和纤维素酶活性的测定，中国微生态学杂志，2009年9月第21卷第9期。本发明所述枯草芽孢杆菌具有良好的合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可以提高瘤胃上皮细胞β-防御素的表达水平，提高机体抗病能力。本发明将板蓝根和黄芪进行水提并发酵，发酵后的中药不仅提高了药效，显著提高了机体免疫力，缓解了绵羊断奶期的各种应激反应；板蓝根和黄芪经过发酵后，还具有高疗效、低残留、低毒副作用优势，可用于替代抗生素的使用。

本发明提供了上述技术方案所述的发酵中药免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：将板蓝根和黄芪进行水提，获得水提物，将所述水提物与LB基础培养基混合，得到发酵培养基；将发酵菌接种到所述发酵培养基中进行发酵，得到发酵中药免疫增强剂。

本发明将板蓝根和黄芪进行水提，获得水提物。在本发明中，所述水提优选包括以下步骤：将黄芪和板蓝根加水浸泡、煎煮，过滤取滤液进行浓缩，得到水提物。在本发明中，所述黄芪和板蓝根的质量比优选为(1～5)：1，进一步优选为1：2；在本发明中，所述黄芪和板蓝根的总质量与每次加水的体积比优选为1g：(3～20)mL，进一步优选为1g：5mL。在本发明中，所述浸泡的时间优选为20～60min，进一步优选为30min，浸泡可以将中药中的有效成分充分溶出，提高中药利用率。在本发明中，所述煎煮的温度优选为90～100℃，进一步优选为100℃；在本发明中，所述煎煮的时间优选为30～60min，进一步优选为40min；在本发明中，所述煎煮的次数优选为1～3次，进一步优选为3次。本发明选择特定的提取条件，使板蓝根和黄芪中的有效物质充分溶出，提高药材利用率。煎煮后，本发明优选将煎煮后过滤得到的滤液进行浓缩，得到水提物。在本发明中，所述浓缩的方法优选旋转蒸发仪浓缩，所述浓缩后的药液的生药浓度优选为1g/mL，浓缩后本发明优选对浓缩后的药液进行高压灭菌，得到所述水提物。

得到水提物后，本发明将所述水提物与LB基础培养基混合，得到发酵培养基本。在本发明中，所述水提物与LB基础培养基的体积比优选为1：(1～5)，进一步优选为1:3。在本发明中，所述LB基础培养基优选包括以下质量浓度的组分：蛋白胨1～10g/L，酵母浸粉10～30g/L，葡萄糖10～50g/L，MnSO

得到发酵培养基后，本发明将发酵菌接种到所述发酵培养基中进行发酵，得到发酵中药免疫增强剂。在本发明中，所述发酵菌的接种量优选为1％～10％，进一步优选为5％，接种后，发酵培养基中所述发酵菌的活菌数优选达到3*10

本发明提供的发酵中药免疫增强剂的制备方法工艺简单，发酵过程易于控制，制备得到的发酵中药免疫增强剂具有高疗效、低残留、低毒副作用的优势。

本发明提供了上述技术方案所述的发酵中药免疫增强剂或上述技术方案所述的制备方法得到的发酵中药免疫增强剂在畜牧养殖中的应用。在本发明中，所述发酵中药免疫增强剂优选以拌料的方式加入基础饲料中进行饲喂。在本发明中，所述发酵中药免疫增强剂的用量优选为2～8g/只/d。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种发酵中药免疫增强剂及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种发酵中药免疫增强剂，制备方法如下：

1)板蓝根和黄芪水提液制备

用天平精确称量黄芪饮片1000g和板蓝根饮片1000g；将黄芪和板蓝根混合，加水进行浸泡，其中黄芪和板蓝根的总质量与水的体积比为1g/5mL，浸泡30min后，在100℃下煎煮40min，用纱布过滤药液，药渣再加入与浸泡过程等体积的蒸馏水继续煎煮40min，反复煎煮3次；将3次煎煮经纱布过滤后所得药液，放入旋转蒸发仪中，将药液浓缩成含生药1g/mL，高压灭菌后得到板蓝根和黄芪水提液。

2)发酵

取板蓝根和黄芪水提液250mL，然后加入750mL LB基础培养基中，得到发酵培养基。其中LB基础培养基由以下组分组成：蛋白胨：5g/L，酵母浸粉：30g/L，葡萄糖：20g/L，MnSO4·7H2O：2g/L，pH：7.2。得到发酵培养基后，将枯草芽孢杆菌(河南农业大学牧医工程学院微生物实验室分离鉴定保存)接种到发酵培养基中，发酵菌接种量为5％(体积比)，接种后，发酵培养基中发酵菌的活菌数为3*10

实施例2

一种发酵中药免疫增强剂，制备方法同实施例1，不同之处在于：发酵温度为30℃，发酵时间为48h。

实施例3

一种发酵中药免疫增强剂，制备方法同实施例1，不同之处在于：发酵温度为37℃，发酵时间为24h。

实施例4

一种发酵中药免疫增强剂，制备方法同实施例1，不同之处在于：发酵温度为30℃，发酵时间为48h。

对比例1

一种发酵中药免疫增强剂，制备方法同实施例1，不同之处在于：发酵时不添加LB培养基。

实施例5

发酵前后板蓝根和黄芪发酵液中多糖含量的变化

考察实施例1～4和对比例1发酵前后板蓝根和黄芪发酵液中多糖含量的变化，考察发酵对多糖含量的影响。

检测方法：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标品10mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含葡萄糖标品0.1mg的标准溶液。称取蒽酮(纯度99.99％)0.2g加100mL的浓硫酸置棕色试剂瓶放冰箱备用。分别精密吸取0.1mg/mL的标准溶液0mL、0.1mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL于10mL具塞试管中，再分别加蒸馏水补至2mL，编号。然后分别加配好的蒽酮试剂6mL，摇匀，于沸水浴中加热15min，取出，迅速置冰水中冷却至室温，以蒽酮试剂为空白，于波长620nm处测吸光度，多次重复得回归方程，葡萄糖标准曲线见图1。

取发酵前后水提液各3mL离心4000r/min，离心10min后取上清液1mL加无水乙醇4mL，放置2～3h，再次离心；沉淀用95％乙醇洗涤2次，每次5mL，加热蒸馏水2mL使沉淀溶解，并定容至100mL，摇匀，再取0.5mL溶液置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀即得供试品溶液。将待测样放入光度计测量吸光度，多次重复后带入回归方程得出多糖含量。

表1发酵前后发酵液中多糖含量

由表1的结果可知，实施例1～实施例4发酵后的发酵液比发酵前的多糖含量显著增高，可见，发酵具有提高发酵液中多糖含量的作用，进而提高动物免疫力。对比例1中发酵前后多糖含量变化不大，可能是由于发酵液中没有添加LB培养基的原因，使枯草芽孢杆菌无法增殖，无法达到发酵的效果。

实施例6

对绵羊生长性能的影响

试验时间：2019年11～12月份；

试验地点：登封市三木绿源畜牧养殖基地；

绵羊种类：40日龄湖羊；

挑选18只绵羊，随机分为3组，分别为对照组、发酵组和未发酵组，对照组只饲喂基础饲料，正常采水；发酵组饲喂实施例1发酵后的中药增强剂和基础饲料，中药增强剂的饲喂量为6g/只/d，于每日拌料饲喂；未发酵组饲喂实施例1发酵前的中药增强剂和基础饲料，中药增强剂的饲喂量为6g/只/d，于每日拌料饲喂，饲喂28d。每天记录各组绵羊采食量及重量，考察本发明中药增强剂对绵羊生长性能的影响，结果见表2。

表2本发明发酵中药增强剂对绵羊生长性能的影响

注：**表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)，*表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。

由表2可知，发酵组的平均日增重极显著高于对照组，也显著高于药物未发酵组，料重比发酵组最低，本发明提供的发酵中药免疫增强剂能够显著提高绵阳的生长性能。

实施例7

对绵羊免疫功能的影响

试验时间：2019年11～12月份；

试验地点：登封市三木绿源畜牧养殖基地；

绵羊种类：40日龄湖羊；

挑选18只绵羊，随机分为3组，分别为对照组、发酵组和未发酵组，对照组只饲喂基础饲料，正常采水；发酵组饲喂实施例5发酵后的中药免疫增强剂和基础饲料，中药免疫增强剂的饲喂量为6g/只/d，于每日拌料饲喂；未发酵组饲喂实施例1发酵前的中药免疫增强剂和基础饲料，中药免疫增强剂的饲喂量为6g/只/d，于每日拌料饲喂。按上述试验方案饲喂28d，每周各组随机挑选5只绵羊静脉采血，测定绵羊血清中免疫相关指标(ELISA试剂盒，Shanghai FANKEL Industrial Co.Ltd公司，品牌：Fankew)。检测结果见表3。

表3本发明中药免疫增强剂对绵羊免疫功能的影响

注：*表示与空白对照组和未发酵组相比差异显著(P<0.05)；--未检测。

由表3的结果可知，7d、14d、21d、28d的绵羊，发酵组比空白对照和未发酵组的免疫球蛋白和白细胞介素增长明显，说明本发明制备的发酵中药可增强绵羊机体的免疫力。

实施例8

对绵羊肠道菌群的影响

试验时间：2019年11～12月份；

试验地点：登封市三木绿源畜牧养殖基地；

绵羊种类：40日龄湖羊；

挑选18只绵羊，随机分为3组，分别为对照组、发酵组和未发酵组，对照组只饲喂基础饲料，正常采水；发酵组饲喂实施例1发酵后的中药免疫增强剂和基础饲料，中药免疫增强剂的饲喂量为6g/只/d，于每日拌料饲喂；未发酵组饲喂实施例1发酵前的中药免疫增强剂和基础饲料，中药免疫增强剂的饲喂量为6g/只/d，于每日拌料饲喂。按上述试验方案饲喂28d，试验结束后剖杀收集十二指肠、空肠、回肠肠段，将收集的各肠段内容物采用Illumina高通量测序技术对绵羊肠道菌群微生物的DNA序列进行测定(派森诺生物科技有限公司代测)，全面分析肠道微生物群落的多样性和丰度。检测结果见表4.

表4.饲喂发酵中药对绵羊十二指肠内容物ɑ多样性的影响

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)

经过OTU聚类以及物种注释测得本试验中所有样本中共包含36个细菌门，100个细菌纲，190个细菌目，315个细菌科，597个细菌属。

系列统计学分析指数可以评估样品中细菌群落的物种丰富度和多样性，其中a-多样性反映了单个样品内部物种的多样性，包括物种观察指数(Observedspeciesindex)、超1指数Chao 1 index)、艾斯指数(Ace index)、香农指数(Shannon index)和辛普森指数(Simpsonindex)。其中，物种观察指数和Chao 1指数反映样品中群落的丰富度(Speciesrichness)，香农指数以及辛普森指数反映群落的多样性。本试验主要通过Chao 1指数和香农指数来评估微生物群落的丰富度和多样性。经dunn’test作为两两比较的事后检验(表4)表明，发酵组的Chao 1指数和香农指数显著高于空白对照组(P＜0.05)，说明枯草芽孢杆菌发酵板芪提取物对绵羊的十二指肠内菌群的丰富度和多样性有显著的影响。空肠和回肠内菌群丰富度与多样性无显著差异(数据未显示)。

由上述实施例的结果可知，本发明提供的发酵中药免疫增强剂显著提高了多糖含量，将本发明提供的发酵中药免疫增强剂饲喂断奶绵羊后，显著提高了绵羊免疫力，显著提高了十二指肠内菌群的丰富度和多样性，促进了断奶绵羊的生长。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。