一种小孢癣菌分离培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，涉及一种小孢癣菌分离培养基的制备方法和科研及临床的应用。

背景技术

小孢癣菌是子囊菌门下的一属，与毛癣菌属、表皮癣菌属同为小孢癣菌，容易在皮肤及毛发造成皮肤感染。但其不同于毛癣菌及表皮癣菌，小孢癣菌不会感染指甲。小孢癣菌的致病因子与表皮癣菌相似，不同的是其感染来源可能来自动物，近年来从猫、狗等宠物身上分离出的菌种多半都属于小孢癣菌属。小孢癣菌对毛发有高度感染力，为造成头癣的主要病原菌。时下国内外研究较热，目前国内市场上没有小孢癣菌的分离培养基。

目前，需要一款针对小孢癣菌具有较好的，专一性的分离培养基。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小孢癣菌分离培养基及其制备方法。本发明方法中的分离培养基，是一次性预灌装无菌产品，使用方便、快捷、高效。将分离培养基应用于医院的临床研究中，能够缩短成果转化时间，加快新产品研发。

为了实现本发明的目的，采用以下技术方案：

一种小孢癣菌分离培养基，其特征在于：包括基础培养组分和添加剂；基础营养组分包括动物组织胃蛋白酶水解物、蛋白胨、葡萄糖、苯酚红、琼脂、柠檬酸和碳酸钠；所述添加剂包括抗生素和放线菌酮。

所述蛋白胨包括胰酪胨和大豆蛋白胨。

所述抗生素为氯霉素和硫酸庆大霉素。

每升所述小孢癣菌分离培养基含有0.8-1.6g 所述动物组织胃蛋白酶水解物、0.8-1.6g 所述胰酪胨、6-8g 所述大豆蛋白胨、16-18g 所述葡萄糖、0.1-0.2g 所述苯酚红、16-18g 所述琼脂；并以所述柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9；还包括0.06-0.08g 所述氯霉素、0.09-0.11g所述硫酸庆大霉素和0-1g 所述放线菌酮。

小孢癣菌分离培养基在微生物分离培养中的应用。

所述微生物为小孢癣菌。

一种小孢癣菌分离培养基的制备方法，其特征在于：称取0.8-1.6g 所述动物组织胃蛋白酶水解物、0.8-1.6g 所述胰酪胨、6-8g 所述大豆蛋白胨、16-18g 所述葡萄糖、0.1-0.2g 所述苯酚红、16-18g 所述琼脂；溶解于去离子水中，并以所述柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，定容至1000 mL；高温至118-125℃、高压至100-108kPa灭菌13-17分钟，冷却至40-60℃，加入0.06-0.08g 所述氯霉素、0.09-0.11g所述硫酸庆大霉素和0-1g 所述放线菌酮混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得所述小孢癣菌分离培养基。

所述一次性无菌培养皿采用65*15 mm 一次性无菌培养皿。

所述培养温度为20-25℃。

所述培养时间为72-168h。

一种小孢癣菌的分离培养方法，利用上述的制备方法，制得分离培养基，将待分离的样本接种于分离培养基，得到小孢癣菌样本培养基，培养该样本培养基。

与现有技术相比，本发明的优点为：本发明提供了一种新型的分离培养基配方。通过简单的加工工艺，制得一次性预灌装产品，避免了自配培养基所带来的污染风险和繁琐程序。使用方便、快捷，极大地缩短了研究周期，提高了研发效率；将制得的培养基用于分离微生物，通过简单的培养步骤，能够准确的分离出目的菌种，具有较好的分离效果。

附图说明

图1（a）为本发明实施例1的培养基；（b）为对照组培养基。图2（a）为本发明实施例2的培养基；（b）为对照组培养基。图3（a）为本发明实施例3的培养基；（b）为对照组培养基。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下将结合实施例对本发明的实施方案进行详细的描述。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用仪器或试剂未注明生产厂商者，均为市售常规产品。

动物组织胃蛋白酶水解物、胰酪胨和大豆蛋白胨作为氮源，提供微生物生长所需的氮源；葡萄糖作为碳源，为微生物生长所需的碳源；苯酚红作为指示剂；柠檬酸和碳酸钠可以较好的调节培养基pH；琼脂作为凝固剂，是固体培养基的基本组分；氯霉素和硫酸庆大霉素作为抗生素，可以有效的抑制细菌的生长；放线菌酮作为选择性抑真菌剂，可以有效的抑制非小孢癣菌的所有其它真菌的生长。

放线菌酮通过干扰蛋白质合成过程中的易位步骤而阻碍转译过程而达到杀真菌作用。本品对生物体外真核细胞的蛋白质合成均有抑制作用。

一种小孢癣菌分离的培养基和培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方如下：

0.8-1.6g动物组织胃蛋白酶水解物、0.8-1.6g胰酪胨、6-8g大豆蛋白胨、16-18g葡萄糖、0.1-0.2g苯酚红、16-18g琼脂；并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，添加剂为0.06-0.08g氯霉素、0.09-0.11g硫酸庆大霉素和0-1g放线菌酮，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取0.8-1.6g动物组织胃蛋白酶水解物、0.8-1.6g胰酪胨、6-8g大豆蛋白胨、16-18g葡萄糖、0.1-0.2g苯酚红、16-18g琼脂；溶解于去离子水中，并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，定容至1000 mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入0.06-0.08g氯霉素、0.09-0.11g硫酸庆大霉素和0-1g放线菌酮混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得小孢癣菌分离培养基。

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将从病宠患处采集的真菌样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到20-25℃的培养箱中，培育72- 168小时。

实施例1

本实施例提供一种分离培养基的配方。

一种小孢癣菌分离的培养基和培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方如下：

1.25g动物组织胃蛋白酶水解物、1.25g胰酪胨、7.45g大豆蛋白胨、17.45g葡萄糖、0.15g苯酚红、17.45g琼脂；并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，添加剂为 0.07g氯霉素、0.1g硫酸庆大霉素和0.25g放线菌酮，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取1.25g动物组织胃蛋白酶水解物、1.25g胰酪胨、7.45g大豆蛋白胨、17.45g葡萄糖、0.15g苯酚红、17.45g琼脂；溶解于去离子水中，并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，定容至1000 mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入0.07g氯霉素、0.1g硫酸庆大霉素和0.25g放线菌酮混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得小孢癣菌分离培养基

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将从病宠患处采集的真菌样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到20-25℃的培养箱中，培育72-168小时。

3、设置对照

以沙氏葡萄糖琼脂培养基作为对照，在超净工作台无菌条件下，将从病宠患处采集的真菌样本接种到对照培养基上。将接种好的对照培养基放到20-25℃的培养箱中，培育72-168小时。

以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

结果见表1

表1本发明与对照组对小孢癣菌的分离效果的比较

从表1可以看出，本发明配制的培养基小孢癣菌生长良好，其它真菌以及所有细菌均不生长。对照组培养结果可以看出，小孢癣菌生长状态不好，而且有其它真菌生长。图1（a）为本发明的培养基，小孢癣菌生长使培养基颜色变红，菌落单一。图1（b）为对照组培养基，小孢癣菌生长但周围杂菌环绕，不利于小孢癣菌的分离与培养。

本实施例1为本发明的最佳实施例。

实施例2

本实施例提供一种分离培养基的配方。

一种小孢癣菌分离的培养基和培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方如下：

0.8g动物组织胃蛋白酶水解物、0.8g胰酪胨、6.0g大豆蛋白胨、16.45g葡萄糖、0.1g苯酚红、16.45g琼脂；并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，添加剂为 0.06g氯霉素、0.09g硫酸庆大霉素和0.05g放线菌酮，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取0.8g动物组织胃蛋白酶水解物、0.8g胰酪胨、6.0g大豆蛋白胨、16.45g葡萄糖、0.1g苯酚红、16.45g琼脂；溶解于去离子水中，并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，定容至1000 mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入0.06g氯霉素、0.09g硫酸庆大霉素和0.05g放线菌酮混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得小孢癣菌分离培养基

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将从病宠患处采集的真菌样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到20-25℃的培养箱中，培育72- 168小时。

3、设置对照

以沙氏葡萄糖琼脂培养基作为对照，在超净工作台无菌条件下，将从病宠患处采集的真菌样本接种到对照培养基上。将接种好的对照培养基放到20-25℃的培养箱中，培育72- 168小时。

以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

结果见表2

表2本发明与对照组对小孢癣菌的分离效果的比较

从表2可以看出，本发明配制的培养基小孢癣菌生长较好，其它真菌以及所有细菌均不生长。对照组培养结果可以看出，小孢癣菌生长状态不好，而且有其它真菌生长。图2（a）为本发明的培养基，小孢癣菌生长使培养基颜色变淡红色。图2（b）为对照组培养基，小孢癣菌生长但周围杂菌环绕，不利于小孢癣菌的分离与培养。由上述结果可以看出，实施例2培养效果比实施例1略差，但仍明显优于对照组，可以起到一定的分离小孢癣菌的效果。

实施例3

本实施例提供一种分离培养基的配方。

一种小孢癣菌分离的培养基和培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方如下：

1.6g动物组织胃蛋白酶水解物、1.6g胰酪胨、8.0g大豆蛋白胨、18.0g葡萄糖、0.2g苯酚红、18.0g琼脂；并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，添加剂为 0.08g氯霉素、0.11g硫酸庆大霉素和1.0g放线菌酮，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取1.6g动物组织胃蛋白酶水解物、1.6g胰酪胨、8.0g大豆蛋白胨、18.0g葡萄糖、0.2g苯酚红、18.0g琼脂；溶解于去离子水中，并以柠檬酸和碳酸钠调整pH为5.3-5.9，定容至1000 mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入0.08g氯霉素、0.11g硫酸庆大霉素和1.0g放线菌酮混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得小孢癣菌分离培养基

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将从病宠患处采集的真菌样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到20-25℃的培养箱中，培育72- 168小时。

3、设置对照

以沙氏葡萄糖琼脂培养基作为对照，在超净工作台无菌条件下，将从病宠患处采集的真菌样本接种到对照培养基上。将接种好的对照培养基放到20-25℃的培养箱中，培育72- 168小时。

以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

结果见表3

表3本发明与对照组对小孢癣菌的分离效果的比较

从表3可以看出，本发明配制的培养基小孢癣菌生长较好，其它真菌以及所有细菌均不生长。对照组培养结果可以看出，小孢癣菌生长状态不好，而且有其它真菌生长。图3（a）为本发明的培养基，小孢癣菌生长使培养基颜色变浅红色。图3（b）为对照组培养基，小孢癣菌生长但周围杂菌环绕，不利于小孢癣菌的分离与培养。由上述结果可以看出，实施例3培养效果比实施例1略差，但仍明显优于对照组，可以起到一定的分离小孢癣菌的效果。

综上所述，本发明实施例提供的分离培养基，通过添加氯霉素和硫酸庆大霉素抑制细菌的生长，并通过添加放线菌酮抑制其它真菌的生长，从而得到分离小孢癣菌效果较好的培养基。该培养基具有较高的实用性和推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。