纺织品染色的方法和设备

本发明涉及一种用于纺织品染色的方法和设备，以及涉及在进行该方法所需的所述设备中包含的固定化酶。

发明背景

还原染料是不溶性染料，其需要还原剂以溶解于水中。通常，用还原染料染色包括将染料以其可溶的还原形式施加于纺织品，然后将染料氧化回不溶的形式，这赋予纺织品以颜色。

靛蓝是式I的还原染料：

用一些基团，例如，卤素、烷基、烷氧基、氨基、芳基、芳氧基和羰基在靛蓝的芳环上取代提供了具有除蓝色以外的各种各样的颜色的化合物，它们是所谓的靛蓝衍生物的一部分。

靛蓝和靛蓝衍生物的很大一部分是通过合成产生的。霍伊曼(Heumann)合成(下述方案1)和普夫勒格(Pfleger)合成(下述方案2)是用于工业规模的靛蓝制备的最初的合成路线；这些方法的各种变化形式仍沿用至今。

上述合成路线也用于制备靛蓝衍生物；在这种情况下，化合物II’，II”，III’和III”在与要合成的所需靛蓝衍生物相同的位置上被相同的基团取代。

靛蓝及其衍生物以及其他还原染料的合成也可以通过酶或表达酶的细菌来进行。但是，这种酶促合成没有用于工业过程中。

靛蓝的前体(例如上述方案1和2的化合物II’，II”，III’和III”)可溶于水溶液，而靛蓝则不溶，并且在水溶液中合成后会沉淀出来。因此，如上所述，靛蓝或其衍生物必须被还原(通过用还原剂处理，例如如方案3所示)。

其中化合物I是靛蓝，化合物IV是水溶性和还原形式的靛蓝，称为隐色-靛蓝(或靛白，因为它是无色的)。

因此，使用靛蓝或其衍生物作为染料或通常使用还原染料的工业染色方法包括首先在反应器中通过已知方法在水溶液中合成靛蓝或其衍生物(或还原染料)(例如，上述方案1的合成)。以沉淀形式获得靛蓝或其衍生物(或还原染料)。然后用还原剂处理包含悬浮的靛蓝或其衍生物(或还原染料)的水溶液，以获得包含溶解的隐色靛蓝或其衍生物(或还原的还原染料)的水溶液。然后将包含溶解的隐色靛蓝或其衍生物(或还原的还原染料)的水溶液施加到纺织品上。一旦包含溶解的隐色-靛蓝的溶液润湿了纺织品，就通过隐色-靛蓝或其衍生物(或隐色-还原染料)的氧化获得靛蓝或其衍生物(或还原染料)，并因此将纺织品染色。这种氧化可以例如用空气中的氧气进行。通常，靛蓝染色过程需要几个浸渍和氧化步骤才能达到所需的色泽。

用于还原不溶性还原染料(例如靛蓝或其衍生物)的还原剂是刺激性化学品，即对使用者和/或环境有害的化学品，例如氢氧化钠和连二亚硫酸钠。实际上，在例如将靛蓝或其衍生物用作染料的常规染色过程中使用大量的还原性盐和氢氧化物，因此产生了大量废水，这些废水必须先经过处理再处置掉。此步骤增加了染色过程的成本。

因此，需要一种用还原染料，特别是靛蓝及其衍生物对纺织品进行染色的改进方法，该方法可以降低还原染色和水处理过程的成本。

已知的靛蓝染色方法的另一个问题是纺织品，特别是纤维素，可能因长时间暴露于碱性过程溶液和其中存在的副产物而受到损害。

发明内容

本发明的目的是解决上述问题，并提供一种使用不溶性染料，例如还原染料，特别是使用靛蓝及其衍生物对纺织品进行染色的方法，该方法是安全的，成本有效的并且对环境友好的。

本发明的另一个目的是提供一种使用靛蓝及其衍生物以及不溶性染料如还原染料对纺织品进行染色的方法，该方法相对于使用靛蓝及其衍生物或常规还原染料的常规染色方法而言更具可持续性。

本发明提供了根据权利要求1的方法，达到上述目的以及其他目的，该方法是一种用于对纺织品进行染色的方法，该方法包括酶促合成染料前体，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)使包含至少一种第一染料前体的溶液与至少一种第一固定化酶接触，以将至少一部分所述第一染料前体转化成至少一种第二染料前体，以获得包含所述第二染料前体的溶液；

b)产生包含第二染料前体的溶液流，由此包含所述第二染料前体的溶液从第一固定化酶流向纺织品；

c)使包含第二染料前体的溶液与纺织品接触；和

d)将至少一部分第二染料前体转化成至少一种染料，从而将至少一部分纺织品染色；

其中所述第一固定化酶与纺织品间隔开。

在以下描述中，“纺织品”是指能够被例如靛蓝和/或其衍生物染色的任何纤维，纱线，绳索，织物和/或服装。纺织品材料可以是天然来源的，例如衍生自动物或植物的那些，例如棉、亚麻、丝绸、羊毛等，或可以是合成来源的，或可以是它们的混合物，例如弹性棉织物或服装。此外，所述纱线可以通过任何已知方法制造，并且合适的织物也可以通过任何已知方法制造，例如，编织、针织、钩编、打结和制毡。另外，所述服装可以是任何服装，例如，牛仔裤、衬衫、休闲装等。

在本发明中，“第一染料前体”是指可以通过酶转化为第二染料前体的任何可溶性化合物。在本发明中，“第二染料前体”是指可以通过第一染料前体获得并且可以例如通过二聚作用转化为不溶性染料的任何可溶性化合物。在本发明中，“不溶性染料”是指常规用于染色纺织品的任何水不溶性化合物，例如任何还原染料，诸如靛蓝。因此，根据本发明，第一染料前体，第二染料前体和不溶性染料通过合成途径相互关联，特别是包括第一酶促步骤和第二非酶促步骤的合成途径。例如，根据本发明的所述第一染料前体，所述第二染料前体和所述不溶性染料可以分别是吲哚和/或其衍生物，吲哚酚(indoxyl)和/或其衍生物，以及靛蓝和/或其衍生物，并且是如以下报告的方案4中所示相关的。根据要染色的纺织品在本发明的染色过程结束时必须具有的颜色来选择步骤a)的溶液中必须包含何种第一染料前体，因为纺织品的颜色将由不溶性染料提供，而不溶性染料是从第一染料前体开始获得的。

第一染料前体，第二染料前体和不溶性染料的有利实例分别是吲哚和/或其衍生物，吲哚酚和/或其衍生物，以及靛蓝和/或其衍生物。靛蓝及其衍生物可以从吲哚及其衍生物开始而合成，如以下方案4所示。

其中化合物II是吲哚(第一染料前体)，化合物III是吲哚酚(第二染料前体)，化合物I是靛蓝(染料)。具体地，参考方案4的反应，在吲哚的3位碳上加成羟基得到吲哚酚，当在水溶液中时，吲哚酚二聚为靛蓝。根据本发明，在本发明方法的步骤a)中，通过第一固定化酶将羟基加到吲哚和/或其衍生物上。当第一染料前体是吲哚和/或其衍生物，第二染料前体是吲哚酚和/或其衍生物，并且不溶性染料是靛蓝和/或其衍生物时，本发明的方法导致在不需要经过现有技术的还原步骤的情况下用靛蓝和/或其衍生物对纺织品进行染色，靛蓝和/或其衍生物是纺织品染色中最常用的染料之一。

根据本发明，“吲哚衍生物”、“吲哚酚衍生物”和“靛蓝衍生物”是指被一个或多个取代基取代的相应的吲哚、吲哚酚和靛蓝，例如，在选自吲哚或吲哚酚的4、5、6和7位的任何位置的一个或多个碳上被一个或多个基团取代，以及在选自靛蓝的4、4’、5、5’、6、6’、7和7’位的任何位置的一个或多个碳上被一个或多个基材取代，和/或在吲哚、吲哚酚或靛蓝的氮原子上被基团取代。取代一个或多个碳的一个或多个基团可以是例如但不限于以下基团：卤素基团，烷基(例如C

参考方案5，两种不同的吲哚衍生物是化合物IIa(4-甲氧基吲哚)和IIb(7-氯吲哚)，两种不同的吲哚酚衍生物是化合物IIIa(4-甲氧基吲哚酚)和IIIb(7-氯吲哚酚)，三种不同的靛蓝衍生物是化合物Ia(4,4'-二甲氧基靛蓝或4-甲氧基-2-(4-甲氧基-3-氧代-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)-1,2-二氢-3H-吲哚-3-酮；对称靛蓝衍生物)，Ib(7,7'-二氯靛蓝或7-氯-2-(7-氯-3-氧代-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)-1,2-二氢-3H-吲哚-3-酮；对称靛蓝衍生物)和Ic(7-氯-4'-甲氧基靛蓝或7-氯-2-(4-甲氧基-1,3-二氢)-3-氧代-2H-吲哚-2-亚基)-1,2-二氢-3H-吲哚-3-酮；不对称靛蓝衍生物)。因此，当至少两种吲哚衍生物，或吲哚和至少一种吲哚衍生物与酶接触时，在该方法的步骤d)中可获得多于一种的靛蓝衍生物，从而根据本发明方法实现用多于一种的染料对纺织品进行染色。

根据本发明，“第一固定化酶”是指根据本发明方法的步骤a)能够催化第一染料前体向第二染料前体转化的任何酶。例如，第一固定化酶可以是能够催化吲哚和/或其衍生物转化(即氧化)为吲哚酚和/或其衍生物的固定化酶。

根据本发明，在步骤a)中使任何化合物与酶接触，例如使第一染料前体与固定化酶接触，是指使该化合物酶促转化。该接触可以通过使至少包含这种第一染料前体的溶液流与酶接触而来进行，由此包含在该溶液中的溶解的第一染料前体进而与固定化酶接触并被酶转化为第二染料前体。

根据本发明，使至少包含第二染料前体的溶液与纺织品接触，意味着用该溶液润湿纺织品，从而使纺织品被该溶解有第二染料前体的溶液浸渍。

根据本发明，“固定化的”或“固定化”是指酶的固定化过程。酶的固定化是本领域已知的常规方法，其涉及将此类酶附着到载体上，优选共价附着到载体上，例如附着到环氧活化树脂(例如甲基丙烯酸酯共聚物，如

合适的环氧活化树脂的粒度在100-1100微米的范围内，例如150到300微米，或200到500微米，或250到1000微米，平均孔径在300到1800埃的范围内，例如300到600埃，或1200到1800埃。在本发明的一个方面中，酶的固定化可以以每克湿载体5-75mg(半)纯化酶的范围内的比例进行，更优选以每克湿载体15-25mg(半)纯化酶的范围内的比例进行。

突变酶(例如，遗传修饰的酶)可用于本发明的方法中，例如，以提高催化效率或提供与载体的改善的结合。例如，当用于酶固定化的载体是环氧活化树脂时，可以通过引入六赖氨酸(6xLys)或六组氨酸(6xHis)标签序列(最好在N末端)来修饰酶，以增加其对载体的结合。

根据本发明，“间隔开”是指将第一固定化酶和纺织品间隔开，使得第二染料前体向不溶性染料的转化不会在所述第一固定化酶处和/或附近发生，而是在包含第二染料前体的溶液与纺织品接触之后发生。因此，直接在纺织品上将第二染料前体转化为不溶性染料。因此，根据本发明，纺织品相对于溶液的流动方向位于固定化酶的下游。酶被固定化，因此它们被限制并且不能随溶液的流动而流动。这样的间隔可以例如通过将固定化酶(或酶系统)和纺织品分开在不同的容器或腔室中，或通过将固定化酶(或酶系统)和所述纺织品限制在同一容器或腔室的不同区域中来进行。可以选择溶液的参数，例如流速，温度以及溶液与酶和纺织品的接触时间，以确保第二染料前体向不溶性染料的转化基本上发生在纺织品上，即在至少包含第二染料前体的溶液与纺织品接触之后发生。

因此，根据本发明，基本上防止了第二染料前体在所述第一固定化酶处和/或附近向不溶性染料的转化(即沉淀)。申请人发现，在酶处和/或附近的不溶性染料的沉淀可能导致酶活性的损失；据认为，沉淀的不溶性染料对底物-酶的相互作用有负面影响，从而阻止了底物(即第一染料前体)与固定化酶的进一步接触。

本发明的另一个优点是避免了使用还原剂；因此，本发明的方法是环境友好的，安全的，具有成本效益的和可持续的，因为其不产生含有还原剂的废水。

当该方法在标准染色条件下进行并且第二染料前体是吲哚酚和/或其衍生物时，它们二聚为靛蓝和/或其衍生物是自发的。根据本发明的方法，这种自发二聚作用是在至少包含所述吲哚酚和/或其衍生物的溶液与纺织品接触后发生，所述纺织品与第一固定化酶间隔开。本发明的方法允许使用靛蓝和/或其衍生物的酶促合成以工业规模的方法对纺织品进行染色。

有利地，本发明的方法可以是连续方法。连续方法可包括在步骤a)的上游添加第一染料前体，以使包含该染料前体的溶液与固定化酶连续接触。

根据本发明方法的一个实施方式，在步骤d)之后获得的溶液是排出溶液，其可以包含未反应的第一染料前体，该未反应的第一染料前体在步骤a)中没有被转化为第二染料前体。

根据本发明的方法的一个实施方式，在步骤d)之后将至少一部分排出溶液导回到第一固定化酶以再循环到该方法中。该实施方式允许将存在于排出溶液中的未反应的第一染料前体转化为第二染料前体，然后可以对其进行本发明方法的步骤b)至d)。本实施方式优化了所述第一染料前体的使用，因为其可以完全转化为所述第二染料前体，例如通过重复该方法的步骤，即通过引导溶液流使其与第一固定化酶接触数次。重复该方法的步骤可能会为染色的纺织品提供不同的色泽；因此可以进行该方法，直到获得所需的纺织品色泽为止。而且，该实施方式可以避免处置可能仍包含有用的溶质的排出溶液，所述溶质例如为未反应的第一染料前体，缓冲剂，辅因子等。

此外，可以将第一染料前体添加到在步骤d)之后被导回到固定化酶的排出溶液中。这样可以连续进行本发明的方法。

在下面的段落中，将参考其中不溶性染料是靛蓝，第二染料前体是吲哚酚且第一染料前体是吲哚的实施方法来揭示该方法。本发明的范围不限于这些示例性化合物。根据本发明的一个实施方式，所述第一固定化酶是氧化酶，由此当与氧化酶接触时，吲哚和/或其衍生物被氧化以获得吲哚酚和/或其衍生物。

根据本发明，“氧化酶”是指能够催化其底物氧化的任何酶，例如氧化还原酶(EC1)。合适的氧化还原酶是单加氧酶(EC 1.13)；优选地，其是含黄素单加氧酶(FMO)(EC1.14.13.8)，更优选地，其是微生物含黄素单加氧酶(mFMO)。或者，单加氧酶可以是拜耳-维利格(Baeyer-Villiger)单加氧酶(BVMO)。单加氧酶，尤其是FMO和mFMO，提供了优异的转化率和许多第一染料前体(例如吲哚和/或其许多衍生物)的结合，以及合适的特异性以转化大多数吲哚衍生物，因此对于本发明是有益的。拜耳-维利格单加氧酶(BVMO)与FMO具有高度同源性，因此也对本发明有益。用于本发明的特别优选的氧化酶是来自噬甲基菌种(Methylophaga sp.)，更优选来自SK1菌株的mFMO。这种类型的mFMO在水溶液中溶解性很高并且可以提供高浓度的溶液，因此增加了可以通过这种类型的mFMO合成的第二染料前体113(例如吲哚酚和/或其衍生物)的量。而且，这种类型的mFMO能够将大多数吲哚衍生物转化为相应的吲哚酚衍生物，因为它不仅仅对吲哚或一种特定的吲哚衍生物具有特异性。但是，本发明的范围也包括所述噬甲基菌种mFMO的任何同源物。根据本发明，可以使用遗传修饰的酶，例如遗传修饰的氧化酶，例如，以提高第一染料前体的氧化效率。

根据本发明的一个实施方式，该方法包括还使用第二固定化酶，优选固定化辅因子再生酶。

根据本发明，“第二固定化酶”可以是能够辅助和/或完成由第一固定化酶催化的第一染料前体向第二染料前体的转化的任何酶。特别地，第二固定化酶可以通过使第一固定化酶使用的辅因子再生来辅助这种转化；在这种情况下，第二固定化酶是固定化辅因子再生酶。

根据本发明，“辅因子再生酶”是能够再生(即产生)第一固定化酶使用的辅因子的任何酶，所述第一固定化酶用来催化第一染料前体的转化反应(本发明方法的步骤a))。

因此，第二固定化酶可以从底物开始产生第一固定化酶使用的辅因子，该底物比所述第一固定化酶使用的辅因子便宜。

合适的辅因子再生酶在本领域中是已知的，并且例如是脱氢酶，诸如葡萄糖脱氢酶(GDH)，亚磷酸脱氢酶(PTDH)，甲酸脱氢酶(FDH)，以及它们的突变体。优选地，辅因子再生酶是亚磷酸脱氢酶(PTDH)；合适的PTDH的一个例子在WO 2004/108912 A2中公开。当将氧化酶，尤其是FMO用作所述第一固定化酶时，使用脱氢酶，例如GDH，FDH，尤其是PTDH是有利的。GDH，FDH和PTDH分别从葡萄糖，甲酸盐和亚磷酸盐开始再生这些氧化酶所用的辅因子，它们比所述氧化酶所用的辅因子便宜得多，并且可以广泛购得。根据本发明，可以使用遗传修饰的辅因子再生酶，例如以提高第一染料前体的辅因子再生效率。

优选地，第一和第二酶都被固定以提供酶系统。

根据本发明的一个实施方式，固定化酶系统与纺织品间隔开，并且溶液从酶系统流向纺织品。本发明的方法也避免或至少大大减少了不溶性染料在固定化酶系统处或附近沉淀。

根据本发明的另一个实施方式，第一固定化酶和第二固定化酶作为固定化融合酶提供，因此提供了融合系统。优选地，所述第一固定化酶是氧化酶，更优选是单加氧酶，甚至更优选是微生物含黄素单加氧酶(mFMO)。所述第二酶优选为辅因子再生酶，更优选为脱氢酶，甚至更优选为选自以下的至少一种脱氢酶：葡萄糖脱氢酶(GDH)，亚磷酸脱氢酶(PTDH)和甲酸脱氢酶(FDH)，最优选的是亚磷酸脱氢酶(PTDH)。因此，根据优选的实施方式，所述融合酶是PTDH-mFMO融合酶。

酶的融合是本领域已知的技术。合适的融合酶包括衍生自第一酶的区域和衍生自第二酶的区域，每个区域提供所需的功能特性。

融合酶的固定化可以通过在融合酶的任何区域上的表面暴露基团来进行，例如通过在第一酶区域或第二酶区域或这两个区域上的表面暴露基团来进行。可以根据融合酶的任何区域上的表面暴露基团来选择载体。

突变融合酶可用于本发明的方法。此类突变融合酶被遗传修饰，以例如更有效地固定化或提高催化效率。

在一个实施方式中，第一固定化酶或酶系统位于第一容器或腔室中，纺织品位于第二容器或腔室中。因此，根据该实施方式，步骤a)在至少第一腔室中进行，并且至少部分所述纺织品的染色在至少第二腔室中进行。因此，根据所述实施方式，第一染料前体向第二染料前体的转化(本发明方法的步骤a))在第一腔室中发生，而所述第二染料前体向所述染料的转化在所述第二腔室中发生，该第一腔室与所述第二腔室流体连接。

根据一个实施方式，第一染料前体可以从一种或多种起始化合物开始酶促地制备。例如，可以从色氨酸作为起始化合物酶促地获得吲哚(即示例性的第一染料前体)。

根据一些实施方式，在与第一腔室和第二腔室不同的一个或多个反应器中，由一种或多种起始化合物以酶促方式生产第一染料前体。有利地，根据一些实施方式，这样的反应器可以至少与第一腔室流体连接。

根据一些实施方式，如上所述，在第一腔室中从一种或多种起始化合物开始以酶促方式生产第一染料前体。

如本文所用，术语“起始化合物”是指可以通过一个或多个酶促反应转化为如上所定义的第一染料前体的化合物。这种酶促反应通过一种或多种起始酶来进行。根据一些实施方式，起始酶可以被固定。

根据一些实施方式，可以将起始化合物(例如色氨酸)酶促地转化为其衍生物，例如卤化衍生物。

因此，如本文所用，术语“起始酶”是指可以催化起始化合物(例如色氨酸)向第一染料前体(例如吲哚)转化的一种或多种酶。

下面的方案6代表说明性的反应方案，其中从起始化合物(色氨酸(IV))酶促获得第一染料前体(吲哚(II))：

参考方案6，化合物IV是色氨酸(起始化合物)，化合物II是吲哚(第一染料前体)，化合物III是吲哚酚(第二染料前体)，化合物I是靛蓝(不溶性染料)。根据一些实施方式，色氨酸到吲哚的转化可以通过起始酶如色氨酸酶或其突变体形式(例如具有改善的催化性能的突变体形式)进行，而从第一染料前体到第二染料前体的转化以及从第二染料前体到不溶性染料的转化可以如上所述进行。方案6的反应也可以应用于色氨酸，吲哚，吲哚酚和靛蓝衍生物。

如本文所用，术语“色氨酸衍生物”是指被一个或多个取代基取代的色氨酸，如上文关于吲哚，吲哚酚和靛蓝衍生物所公开的。例如，方案7表示涉及色氨酸衍生物以及相应的吲哚，吲哚酚和靛蓝衍生物的示例性反应。方案7表示起始化合物(色氨酸(IV))转化为卤化衍生物(6-溴色氨酸(IVd))的示例性反应。在这种情况下，需要多于一种起始酶来获得所需的第一染料前体(6-溴吲哚(IId))，即色氨酸卤化酶和色氨酸酶。

参考方案7，化合物IV是色氨酸(起始化合物)，化合物IVd是6-溴色氨酸(起始化合物的卤化衍生物)，化合物IId是6-溴吲哚(第一染料前体)，化合物IIId是6-溴吲哚酚(第二染料前体)，化合物Id是6,6'-二溴靛蓝(也称为泰尔紫(Tyrian purple)；不溶性染料)。如上所述，色氨酸到6-溴色氨酸的转化和6-溴色氨酸到6-溴吲哚的转化可以通过起始酶如相应的色氨酸卤化酶和色氨酸酶进行，而从第一染料前体到第二染料前体的转化以及从第二染料前体到不溶性染料的转化可以如上所述进行。

根据一些实施方式，不溶性染料是通过酶促级联反应步骤(即从起始化合物开始导向第二染料前体的酶促转化)，然后是非酶促反应步骤(即在纺织品上发生的第二染料前体转化为不溶性染料)获得的。

有利地，通过控制本发明方法的参数，可以将第二染料前体直接转化为不溶性染料，到达纺织品上，并且基本上避免了不溶性染料在酶处和/或附近沉淀。

根据一些实施方式，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：在进行步骤a)之前，使包含至少一种起始化合物的溶液与至少一种起始酶接触，以将至少一部分这种起始化合物转化成第一染料前体，以获得包含至少一种所述第一染料前体的溶液。

本发明的又一个目的是根据权利要求11的设备，该设备用于进行对纺织品染色的方法，即，用于对纺织品进行染色的设备，其包括：至少包含第一固定化酶和至少包含染料前体的溶液的第一腔室，至少一个包含纺织品的第二腔室，以及用于产生溶液流的装置。第一腔室与第二腔室流体连接，由此至少包含染料前体的溶液可以从第一腔室流向第二腔室，其中至少一部分染料前体被转化为染料以对至少一部分纺织品进行染色。第二腔室任选地包括出口装置，以从所述第二腔室去除所述溶液。

根据本发明的另一个实施方式，该设备还包括：

-至少与第一腔室流体连接的一个或多个储存器，使得包含染料前体的溶液可以从储存器流到第一腔室；和/或

-与第二腔室的出口装置流体连接的一个或多个收集罐。

可以设置根据本实施方式的储存器以向本发明的设备，特别是包含第一固定化酶的第一腔室提供至少包含第一染料前体，例如第一染料前体的溶液。实际上，所述储存器可以有目的地设置，使得使用者可以容易地将溶液和/或溶质进料到本发明的设备中，这些溶液和/或溶质是通过本发明的设备进行本发明的方法所必需的。因此，可以将例如至少包含所述第一染料前体的溶液添加到所述储存器中，然后可以通过所述储存器与所述第一腔室之间的流体连接将这种溶液进料到包含所述第一固定化酶(以及最终的所述第二酶)的所述第一腔室中。根据本实施方式的收集罐允许收集一旦纺织品被染色后(例如在本发明方法的步骤d)之后)获得的排出溶液。

根据另一个实施方式，本发明的设备还包括产生溶液流的装置。产生溶液流的所述装置，例如一个或多个泵，使得包含在本发明设备中的溶液可以流动。

根据一些实施方式，该设备还可包括与该设备，优选地与第一腔室流体连接的一个或多个反应器。所述一个或多个反应器可包含一种或多种起始酶和包含一种或多种起始化合物的溶液。

根据一些实施方式，可以在第一腔室中包含一种或多种起始酶和包含一种或多种起始化合物的溶液，以酶促产生第一染料前体。

本发明的另一个目的是根据权利要求19的固定化融合酶，即包含载体和固定在所述载体上的至少一种融合酶的固定化融合酶，其中所述融合酶是PTDH-mFMO融合酶。

发现PTDH-mFMO融合酶对于实施本发明的方法(即纺织品的染色)特别有用，特别是当所述染色必须用靛蓝和/或其衍生物进行时特别有用。

本发明的另一个目的是根据权利要求20的用途，即固定化融合酶在纺织品染色方法中的用途，其中所述固定化融合酶是再生酶-氧化酶融合酶，优选是PTDH-mFMO融合酶，即根据本发明先前目的的固定化融合酶。

已经揭示了所述固定化融合酶，特别是所述固定化PTDH-mFMO融合酶，在不溶性染料，特别是靛蓝和/或其衍生物用作染料的染色方法(例如本发明的染色方法)中特别有用。实际上，通过所述固定化融合酶，特别是通过所述固定化PTDH-mFMO融合酶，在第一染料前体，特别是吲哚和/或其衍生物的氧化中提供了良好的反应速率和产率。因此，所述固定化融合酶，特别是所述固定化PTDH-mFMO融合酶，对于合成不溶性染料，特别是靛蓝和/或其衍生物以进行根据本发明的染色方法是最佳的。

本发明的另一个目的是根据权利要求21的方法，即通过酶促合成生产靛蓝或靛蓝衍生物的方法，其包括以下步骤：

a’)在至少一种色氨酸酶的存在下使色氨酸或色氨酸衍生物转化，以获得吲哚或吲哚衍生物；

b’)在至少一种氧化酶的存在下使得在步骤a’)中获得的所述吲哚或所述吲哚衍生物羟基化，以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物；和

c’)将在步骤b’)中获得的所述吲哚酚或所述吲哚酚衍生物转化为靛蓝或靛蓝衍生物。

本发明方法的反应方案在上述方案6中表示。

本发明的方法通过酶促级联反应步骤(步骤a’)和b’))和非酶促步骤(步骤c’))从色氨酸或色氨酸衍生物开始提供靛蓝或靛蓝衍生物的合成。本发明的方法特别有利于以成本有效的方式生产靛蓝和/或靛蓝衍生物，例如泰尔紫。

同样，有利地，本发明的方法允许以工业规模制造靛蓝和/或靛蓝衍生物。

如本文所用，“色氨酸衍生物”是指按照如上关于吲哚和吲哚酚衍生物所定义的基团和位置所取代的色氨酸。

步骤a’)的色氨酸衍生物优选是色氨酸卤化衍生物，其可以通过至少在色氨酸卤化酶和卤素源的存在下对色氨酸进行卤化而获得。该实施方式的反应方案由上述方案7表示(其中卤化衍生物是6-溴衍生物)。

根据一些实施方式，色氨酸可用作酶促产生靛蓝和靛蓝衍生物的起始化合物。有利地，使用色氨酸作为起始化合物可以成本有效地生产靛蓝和/或靛蓝衍生物。

本文所用的“卤化衍生物”是指在5、6、7和8位(对于靛蓝来说也为5’、6’、7’和8’位)的一个或多个碳上被卤素基团，尤其是氟、氯、溴或碘基团取代的任何色氨酸、吲哚、吲哚酚和靛蓝。例如，色氨酸卤化衍生物是6-溴色氨酸(上述方案7的化合物IVd)和7-氯色氨酸，吲哚卤化衍生物是6-溴吲哚(上述方案7的化合物IId)和7-氯吲哚，吲哚酚卤化衍生物是6-溴吲哚酚(上述方案7的化合物IIId)和7-氯吲哚酚，靛蓝卤化衍生物是泰尔紫(6,6'-二溴靛蓝，上述方案7的化合物Id)和7,7'-二氯靛蓝。

根据一些实施方式，在本发明的方法以及本发明的工艺中使用的酶可以是分离的酶，优选为纯化的或半纯化的，由此可以在不使它们在细菌中表达的情况下进行本发明的方法。优选地，所述分离的酶是固定化酶。

本发明的方法可以在一个反应器中进行，从而提供一锅式反应。这在步骤c’)之后提供了作为固体沉淀物的靛蓝或其衍生物，可以将其从反应混合物中分离(例如过滤)。换句话说，当根据一锅反应进行本发明的方法时，可以从反应混合物中分离并纯化得到的靛蓝或其衍生物。

根据一些实施方式，步骤c’)可以在纺织品存在下进行，使得所获得的靛蓝或靛蓝衍生物的至少一部分沉积在纺织品上。

根据一些实施方式，步骤a’)至c’)在水性介质中进行并且产生水性介质流，由此步骤a’)至c’)在不同的反应器中或在一个反应器的不同位置处进行。该实施方式有利于根据其最佳参数，例如温度，pH，酶底物的量等进行各步骤。

根据一些示例性实施方式，本发明的方法可以在两级填充床反应器如

本发明的方法优选在水性介质中进行。这种水性介质优选具有中性或弱碱性的pH，例如7.0至10，优选7.4或8。因此，这种水性介质可以包含缓冲剂，例如磷酸钾缓冲剂。一些色氨酸衍生物，例如6-溴色氨酸，在水性介质中难溶，本发明的方法可以用悬浮在水性介质中的这些色氨酸衍生物进行。

步骤a’)涉及在色氨酸酶存在下使色氨酸或其衍生物上的碳-碳键裂解。这种色氨酸衍生物优选通过进行步骤a’)来合成。

方案8表示步骤a’)的反应步骤：

其中化合物IV是色氨酸，化合物II是吲哚，化合物V是丙酮酸根，TRPase是色氨酸酶。已经观察到色氨酸酶可用于催化色氨酸衍生物向吲哚衍生物的转化，例如6-溴色氨酸向6-溴吲哚的转化。

色氨酸酶(系统命名：L-色氨酸吲哚裂解酶(脱氨基；形成丙酮酸根))是已知的酶，其断开色氨酸的碳-碳键，并释放吲哚。它们可使用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅因子。适用于本发明方法的色氨酸酶是大肠杆菌(Escherichia coli)

可以将PLP任选地添加到步骤a’)的反应混合物中，以提高色氨酸或其衍生物的转化率。

本发明的步骤b’)涉及在氧化酶和O

合适的氧化酶是如上所述的那些，例如，噬甲基菌种菌株SK1和拜耳-维利格单加氧酶的微生物FMO。

氧化酶在反应混合物中需要O

步骤c’)是非酶促的，涉及将吲哚酚或其衍生物氧化和二聚为靛蓝或其衍生物。

根据一些实施方式，本发明方法的步骤c’)可以在至少与所述氧化酶间隔开的纺织品的存在下进行，使得靛蓝或靛蓝衍生物的产生直接发生在纺织品上，从而使所述纺织品的至少一部分被染色。在这种情况下，有利地，基本上避免了靛蓝或其衍生物在酶处和/或酶附近沉淀。

步骤c’)可以在步骤b’)之后自发发生(条件是O

进行步骤c’)所需的O

在一个实施方式中，步骤a’)的色氨酸衍生物是色氨酸卤化衍生物，其通过以下的另一个步骤获得：i)在至少一种色氨酸卤化酶的存在下对色氨酸进行卤化。

色氨酸卤化酶是已知的能够在各个位置催化色氨酸的卤化的酶。色氨酸卤化酶通常是黄素依赖性卤化酶，即它们使用FAD或FADH

根据一些实施方式，色氨酸卤化酶是紫黑链霉菌的菌株SPC6的嗜热色氨酸卤化酶。

例如，嗜热色氨酸卤化酶可以具有以下序列：LNNVVIVGGGTAGWMTASYLKAAFGDRIDITLVESGHIGAVGVGEATFSDIRHFFEFLGLKEKDWMPACNATYKLAVRFENWREKGHYFYHPFEQMRSVNGFPLTDWWLKQGPTDRFDKDCFVMASVIDAGLSPRHQDGTLIDQPFDEGADEMQGLTMSEHQGKTQFPYAYQFEAALLAKYLTKYSVERGVKHIVDDVREVSLDDRGWITGVRTGEHGDLTGDLFIDCTGFRGLLLNQALEEPFISYQDTLPNDSAVALQVPMDMERRGILPCTTATAQDAGWIWTIPLTGRVGTGYVYAKDYLSPEEAERTLREFVGPAAADVEANHIRMRIGRSRNSWVKNCVAIGLSSGFVEPLESTGIFFIHHAIEQLVKNFPAADWNSMHRDLYNSAVSHVMDGVREFLVLHYVAAKRNDTQYWRDTKTRKIPDSLAERIEKWKVQLPDSETVYPYYHGLPPYSYMCILLGMGGIELKPSPALALADGGAAQREFEQIRNKTQRLTEVLPKAYDYFTQ(SEQ.ID NO.1)。

这种类型的色氨酸卤化酶优选催化色氨酸6位的碳上的卤化，由此适合根据本发明的方法产生泰尔紫(6,6’-二溴靛蓝)。

适用于本发明方法的另一种色氨酸卤化酶是色氨酸卤化酶PrnA，优选是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的PrnA，其优选催化色氨酸在其5或7位碳上的卤化。

例如，色氨酸卤化酶(PrnA)可以具有以下序列：MNKPIKNIVIVGGGTAGWMAASYLVRALQQQVNITLIESAAIPRIGVGEATIPSLQKVFFDFLGIPEREWMPQVNGAFKAAIKFVNWRKPPDHSRDDYFYHLFGSVPNCDGVPLTHYWLRKREQGFQQPMEYACYPQPGALDGKLAPCLLDGTRQMSHAWHFDAHLVADFLKRWAVERGVNRVVDEVVEVRLNDRGYISTLLTKEGRTLEGDLFIDCSGMRGLLINQALKEPFIDMSDYLLCDSAVASAVPNDDVREGVEPYTSAIAMNSGWTWKIPMLGRFGSGYVFSSKFTSRDQATADFLNLWGLSDNQSLNQIKFRVGRNKRAWVNNCVSIGLSSCFLEPLESTGIYFIYAALYQLVKHFPDTSFDPRLSDAFNAEIVYMFDDCRDFVQAHYFTTSREDTPFWLANRHELRLSDAIKEKVQRYKAGLPLTTTSFDDSTYYETFDYEFKNFWLNGNYYCIFAGLGMLPDRSLPLLQHRPESIEKAEAMFASIRREAERLRTSLPTNYDYLRSLRNGDAGQSRNQRGPTLAAKEGL(SEQ.ID.NO.2)。

根据一些实施方式，色氨酸卤化酶可以是基因修饰的酶；换句话说，色氨酸卤化酶可以是突变体形式。例如，色氨酸卤化酶可以是紫黑链霉菌的菌株SPC6的色氨酸卤化酶的突变体形式，或者是色氨酸卤化酶PrnA的突变体形式。

由于色氨酸必须在色氨酸卤化酶存在下与卤素反应以转化为靛蓝卤化衍生物，所以本实施方式需要在反应混合物中具有卤素源来实施。根据本发明方法的合适的卤素源可以是卤素盐，即其中阴离子是卤离子的盐。合适的卤素盐可以是镁、银、钠、钾、锂和钙的卤素盐，例如NaCl，KCl，KI，LiCl，CuCl

本实施方式有利地在20℃至60℃，优选25℃至40℃，更优选约30℃的温度下进行30分钟至4小时，优选1小时至3小时，更优选约2小时。

根据一些实施方式，辅因子再生酶可以用于使本发明方法中使用的酶可能需要的辅因子再生。

根据一些实施方式，步骤b’)可以在适合于NADPH辅因子再生的至少一种酶的存在下进行。优选地，适合于NADPH辅因子再生的酶选自下组：如下所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)，亚磷酸脱氢酶(PTDH)和甲酸脱氢酶(FDH)，更优选是如下所述的PTDH，由此提供了FMO-NADPH再生酶系统。有利地，该实施方式提供了一种酶系统，其中通过消耗便宜的辅因子(例如葡萄糖，亚磷酸盐或甲酸盐)来再生昂贵的辅因子(即NADPH)。例如，氧化酶(例如FMO)可以使用NADPH作为辅因子，其可以通过NADPH再生酶，利用便宜的辅因子，例如葡萄糖、亚磷酸盐或甲酸盐来产生。

在另一个实施方式中，在黄素还原酶和NAD(P)H再生酶的存在下进行色氨酸的卤化以获得其卤化衍生物，所述NAD(P)H再生酶优选自下组：葡萄糖脱氢酶(GDH)，亚磷酸脱氢酶(PTDH)和甲酸脱氢酶(FDH)，更优选是PTDH，从而提供了色氨酸卤化酶-黄素还原酶-NAD(P)H再生酶系统。

黄素还原酶(EC 1.5.1.30)是催化以下反应的酶：

核黄素+NADPH+H

NAD(P)H再生酶是产生NADH或NADPH的酶，例如GDH，PTDH和FDH。有利地，该实施方式提供了一种酶系统，其中通过消耗更便宜的辅因子(例如葡萄糖，亚磷酸盐或甲酸盐)来再生昂贵的辅因子(即FAD和NADH或NADPH)，从而改善了本发明方法的工业可行性。例如，色氨酸卤化酶可以使用FAD作为辅因子，其可以通过黄素还原酶产生，该黄素还原酶可以使用NADH或NADPH作为辅因子，其可以通过使用便宜的辅因子(例如葡萄糖，亚磷酸盐和甲酸盐)的NAD(P)H再生酶来生产。

适用于本发明方法的黄素还原酶可以是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的黄素还原酶，特别是枯草芽孢杆菌的菌株WU-S2B的黄素还原酶。

例如，黄素还原酶可以具有以下序列：

MKVLVLAFHPNMEQSVVNRAFADTLKDAPGITLRDLYQEYPDEAIDVEKEQKLCEEHDRIVFQFPLYWYSSPPLLKKWLDHVLLYGWAYGTNGTALRGKEFMVAVSAGAPEEAYQAGGSNHYAISELLRPFQATSNFIGTTYLPPYVFYQAGTAGKSELAEGATQYREHVLKSF(SEQ.ID NO.3)。

本发明方法中使用的任何酶的突变体形式均可用于提高本发明方法的产率和工业可行性。

例如，发现选自W319A、C78I、C78I Y207W和C78I Y207W W319F的FMO突变体可改善FMO对6-溴吲哚的催化活性。此外，NADPH再生酶可以是NADPH生产改进的突变体，例如，WO2004/108912 A2中公开的PTDH。

根据一些实施方式，当酶需要辅因子时，可以将这种酶作为与辅因子再生酶的融合酶来提供。

例如，色氨酸卤化酶和黄素还原酶可以作为融合酶提供，FMO和NADPH再生酶可以作为融合酶提供，优选作为PTDH-FMO提供。根据该实施方式，仅三种单独的酶可用于本发明的方法(当进行任选的步骤i)时)，即色氨酸卤化酶-黄素还原酶融合酶，色氨酸酶和FMO-NADPH再生融合酶。后一种融合酶的NADPH再生部分能够从其便宜的底物即亚磷酸盐开始再生该融合酶的FMO区域和黄素还原酶区域所需的NADPH。

本发明的另一个目的是通过本发明的方法可获得的染色的纺织品。

本发明的另一个目的是当在纺织品存在下进行该方法的步骤c’)时，可通过本发明的方法获得的染色的纺织品。

附图说明

图1是本发明方法的示意图。

图2示意性地显示了本发明方法的另一个实施方式。

图3示意性地示出了该方法的一个实施方式；

图4是设备10的示意图。

图5是设备10的另一示意图。

图6示意性地示出了包括储存器的设备10的实施方式；

图7示意性地示出了包括收集罐的设备10的另一实施方式；

图8示意性地示出了设备10的一个实施方式；和

图9示意性地示出了设备10的另一个实施方式。

发明内容

现在参考附图更详细地公开本发明的目的和实施方式。

本发明的目的是一种对纺织品22进行染色的方法，其包括染料前体的酶促合成，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)使包含至少一种第一染料前体112的溶液与至少一种第一固定化酶12接触，以将至少一部分的所述至少一种第一染料前体112转化成至少一种第二染料前体113，以获得包含所述至少一种第二染料前体113的溶液；

b)产生包含所述至少一种第二染料前体113的所述溶液的流，由此包含所述至少第二染料前体113的所述溶液从所述第一固定化酶12流到所述纺织品；

c)使包含所述至少第二染料前体113的所述溶液与所述纺织品22接触；和

d)使至少一部分的所述第二染料前体113转化为至少一种染料111，从而将至少一部分的所述纺织品22染色；

其中所述至少第一固定化酶12与所述纺织品22间隔开，例如如图1所示。

图1表示本发明方法的示意图，特别示出通过所述第一固定化酶12将所述第一染料前体112转化为所述第二染料前体113，然后至少包含所述第二染料前体113的溶液流到纺织品22(与所述第一固定化酶12间隔开)，最后所述第二染料前体113直接在所述纺织品22上转化为所述不溶性染料111。

更特别地，参考图1，将参考吲哚至靛蓝的路径来公开本发明的方法。该方法由于以下步骤而使纺织品22染色：使包含吲哚染料前体112的溶液流与至少一种第一固定化酶12或酶系统接触(步骤a))，从而由于酶催化将至少一部分吲哚转化为吲哚酚113。此时该溶液包含吲哚酚113。溶液的流动使得包含吲哚酚113的溶液与纺织品22接触；有利地，控制诸如流速之类的参数，以使溶液在合成吲哚酚113之后立即或之后不久到达所述纺织品22。因此可以在所述纺织品22上实现吲哚酚113向靛蓝111的转化，并且实现了所述纺织品22的染色。特别地，当包含吲哚酚113的所述溶液润湿所述纺织品22时，至少一部分所述吲哚酚113直接在所述纺织品22上转化为靛蓝111。

根据本发明，该方法产生了溶液流，该溶液流首先流到酶12(或酶系统)，然后从酶12(或酶系统)流到纺织品22，例如，如图1所示，其中直箭头代表溶液流动的方向。溶液流动的任何方向都是可能的，只要该溶液流首先被供给到所述酶12，然后从所述酶12被供给到所述纺织品22。例如，当第一固定化酶12在所述纺织品22下方时，溶液流动的另一方向可以是从底部到顶部，或者当第一固定化酶12在所述纺织品22上方时，溶液流动的另一方向可以是从顶部到底部，或者当第一固定化酶12和所述纺织品22位于环形腔室的不同区域中时，溶液流动的另一方向可以是环形的，所述环形腔室例如是螺旋管形腔室，例如当第一固定化酶12和所述纺织品22保持在这种螺旋管形腔室内的径向相对的区域中时。

在本发明方法中使用流动可以防止靛蓝111在固定化酶12处和/或附近沉淀，因为至少包含所述第二染料前体113的溶液流到与所述第一固定化酶12间隔开的所述纺织品22，然后发生所述第二染料前体113向所述不溶性染料111的转化。

特别地，当所述第二染料前体113能够自发地转化为所述不溶性染料111时，例如，当所述第二染料前体113是吲哚酚和/或其衍生物而所述不溶性染料111是靛蓝和/或其衍生物时，产生至少包含所述第二染料前体113的溶液流，由此在所述第二染料前体113在固定的氧化酶处和/或附近自发地转化并作为所述不溶性染料111沉淀之前，所述溶液已经流到所述纺织品22。

当所述第二染料前体113不自发转化为所述不溶性染料111时，或者当其不以合适的量自发转化时，可以改变条件，例如pH和/或温度，和/或添加试剂，和/或在纺织品22和所述第二染料前体113所在的位置供应诸如氧气的气体，以促使所述第二染料前体113在纺织品22上转化为所述不溶性染料111。反之亦可，在该方法的步骤a)中也可以控制溶液条件以防止转化，直到溶液到达纺织品。

此外，根据该方法的步骤a)，可以使两种或更多种不同的第一染料前体112与酶12接触，从而获得两种或更多种不同的第二染料前体113。然后，根据该方法的步骤d)，这样的两种或更多种不同的第二染料前体113可以转化，以在纺织品22上获得一种或多种不同的染料111；最后，如果这样的两种或更多种不同的第二染料前体113的步骤d)的转化不是自发发生的，或者如果该转化不以合适的量发生，则可以通过添加其他反应物和/或通过改变包含它们的溶液的参数来实现这种转化。在上述方案5中表示了其中两种或更多种不同的染料前体与酶12接触的说明性实例。当根据本发明的方法使用两种或更多种不同的第一染料前体112时，可能需要两种或更多种不同的酶12；例如，当两种或更多种不同的第一染料前体112需要不同的酶促反应以转化为相应的两种或更多种不同的第二染料前体113时，或者当两种或更多种不同的第一染料前体112不能为相同酶12的底物时。

包含至少一种第一染料前体112的溶液也可以包含其他溶质，并且是在该方法的步骤a)中与第一固定化酶12或酶系统接触的溶液。包含至少一种第二染料前体113的溶液是在步骤a)之后将至少一部分所述第一染料前体112转化为所述第二染料前体113后获得的溶液，并且还可以包含其他溶质，例如一些未反应的第一染料前体112。

如上所述，根据本发明的溶液可以包含其他功能性溶质，例如盐，缓冲剂，辅因子以及氧气和/或过氧化物清除剂(例如过氧化氢酶)。优选地，水溶液中包含的底物的浓度使所述催化酶饱和，使得所述第一固定化酶可以有效地催化所述第一染料前体112向第二染料前体113的转化。当所述第一染料前体112是吲哚，所述第一固定化酶12是mFMO且所述第二固定化酶是PTDH时，根据本发明的示例性溶液可以包含100mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，0.5M NaCl，100μM NADPH，20mM亚磷酸钠和1nM牛肝过氧化氢酶，并用水作为溶剂。

本发明的方法可以间歇或连续地提供纺织品22的染色。为了进行后者，需要例如在步骤a)之前将所述第一染料前体112添加到溶液中，以使包含至少第一染料前体112的溶液与所述第一固定化酶12连续接触，连续地合成第二染料前体113。有利地添加所述第一染料前体112，以使所述第一固定化酶12保持饱和。还可能需要例如在步骤a)之前添加其他溶质，从而以连续方式进行本发明的方法，例如辅因子，缓冲剂和氧气。

根据本发明方法的温度和pH值可以变化，并且可以是不溶性染料的酶促合成中常规使用的温度和pH值。

根据本发明方法的溶液的温度可以例如在20至40，优选25至30的范围内。根据本发明方法的溶液的pH可以例如在7.0-10.0，优选7.5-9.0，甚至更优选7.5-8.5的范围内，最优选为8.0。

在步骤a)中，所述第一固定化酶12与所述包含吲哚112的溶液之间的接触时间可以改变以实现染色的纺织品的不同色泽，并且例如可以通过改变溶液的流速来改变。

溶液中的氧气浓度可能是整个染色过程产率的相关参数，因为氧气会参与第一染料前体向第二染料前体的转化和/或第二染料前体向不溶性染料的转化(例如当第一染料前体是吲哚和/或其衍生物，第二染料前体是吲哚酚和/或其衍生物，且不溶性染料是靛蓝和/或其衍生物时)。因此，溶液中的氧气浓度可以例如基于要合成的不溶性染料的量或要染色的纺织品的量而变化。为了实现例如吲哚和/或其衍生物和吲哚酚和/或其衍生物的最大转化率，溶液有利地用氧气饱和。还有利地监测和控制氧气浓度，并且在需要时可以添加氧气以保持溶液饱和。

本发明方法的其他参数可以根据例如必须染色的纺织品类型和选择哪种染料作为最终染料来选择。

根据本发明方法的一个实施方式，由步骤d)产生的溶液流，即所谓的“排出溶液”，被引导回到容纳固定化酶系统的腔室或区域。排出溶液是在至少一部分的吲哚酚113转化为靛蓝111之后获得的溶液，该靛蓝111固定在所述纺织品22上，并且可以包含未反应的第一染料前体112，例如未反应的吲哚，特别是如果所述第一染料前体112在本发明方法的步骤a)中未与所述酶12完全反应。该实施方式在图2中示出。将包含吲哚的排出溶液连续或分批地、直接或间接地导回到酶系统中，以使剩余的吲哚反应。

优选地，该方法提供将一些第一染料前体112添加到排出溶液中的步骤。有利地添加所述第一染料前体112，以使所述第一固定化酶12保持饱和。这可以提供连续进行的本发明的方法。

在本发明的一个实施方式中，所述第一固定化酶12是如先前所定义的氧化酶。当所述第一染料前体112必须被氧化以转化为所述第二染料前体113时，使用加氧酶是特别有用的，例如当所述第一染料前体112是吲哚和/或其衍生物，所述第二染料前体113是吲哚酚和/或其衍生物，且所述不溶性染料111是靛蓝和/或其衍生物时。

本发明的方法可以进一步提供存在于植物中用于染色的第二固定化酶，优选如先前定义的固定化辅因子再生酶。这提供了一种酶系统，其中第一固定化酶催化第一染料前体111的转化，而固定化辅因子再生酶使第一染料前体111所需的辅因子再生。用于固定所述第二固定化酶的载体可以与用于固定所述第一固定化酶的载体相同或可以不同，具体取决于所述第二酶的表面暴露基团。如果可能，将相同的载体用于固定所述第一酶和第二酶。

所述固定化辅因子再生酶的类型取决于所述第一固定化酶12使用的是哪种辅因子。例如，当第一固定化酶12是含黄素的单加氧酶(FMO)(其使用NADPH作为辅因子)时，固定化辅因子再生酶可以是产生NADPH的至少一种脱氢酶，例如选自下组的脱氢酶：葡萄糖脱氢酶(GDH)，亚磷酸脱氢酶(PTDH)和甲酸脱氢酶(FDH)。PTDH是可从例如斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)获得的可溶性NADPH再生酶，其使用亚磷酸盐作为底物来催化NADPH的产生。FMO(优选mFMO)与PTDH一起使用显示出在许多第二染料前体113，特别是吲哚酚和/或其衍生物的合成中是有效的，因为它提供了良好的氧化速率和NADPH的有效再生。

在本发明的方法和设备中使用的溶液还可以包含所述第二固定化酶的辅因子和/或底物。例如，如果将GDH或PTDH或FDH用作固定化辅因子再生酶，则溶液还可分别包含葡萄糖或亚磷酸盐或甲酸盐(即，分别为GDH，PTDH和FDH的底物)。

与第一酶类似，突变的第二酶(例如，遗传修饰的第二酶)可用于本发明的方法，例如以改善所需辅因子的再生或改善其与载体的结合特性。

在本发明的一个实施方式中，所述第一酶12和所述第二酶被提供为如先前所定义的融合酶。这提供了酶系统。

参考图3，示出了本发明方法的另一个实施方式。该实施方式提供了从一种起始化合物114(例如色氨酸)开始生产第一染料前体112(例如吲哚)。根据本实施方式，本发明的方法中包括另外的步骤，即：使包含至少一种起始化合物114的溶液与至少一种起始酶14接触，以将至少一部分的该起始化合物114转化为第一染料前体112，从而获得包含该第一染料前体112的溶液，使得本发明方法的步骤a)至d)可以如已经参照图1和2公开的那样进行。当第一固定化酶12和起始酶14间隔开时，为了使包含第一染料前体112的溶液(通过转化起始化合物114获得)与酶12接触，可以产生这种溶液的流动，从而该溶液从起始酶14流到第一固定化酶12，例如如图3所示。由于从步骤d)得到的排出溶液还可以包含未反应的起始化合物114，因此将排出溶液循环回到容纳起始酶14的反应器或区域和/或容纳第一固定化酶11的第一腔室或区域是有利的，以优化未反应的起始化合物114和/或第一染料前体112的转化。

在本发明方法的另一个实施方式中，步骤a)在第一腔室11中进行，纺织品22的染色在第二腔室21中进行。将包含第一染料前体112的溶液提供到第一腔室11的内部，由此所述溶液接触包含在所述第一腔室11中的第一酶12，并且第一染料前体112被酶转化为第二染料前体113。然后产生溶液流，此时至少包含所述第二染料前体113的溶液流入包含纺织品22的所述第二腔室21，由此溶液和第二染料前体113可以接触并浸渍所述纺织品22。最后，第二染料前体113直接在纺织品22上转化为染料111。

溶液的流动是通过任何合适的手段产生的，例如泵50或重力(如果第一腔室11位于第二腔室21上方)。

第一腔室11是适合容纳酶12或包括第二固定化酶的酶系统以及水溶液的容器。第一腔室11还可以包括在其中容纳和约束所述第一固定化催化酶12(以及最终的酶系统)的装置，例如一个或多个过滤器。所述第一腔室11可以有利地包括一个或多个装置或传感器，以允许监测溶液的参数，例如pH，溶液温度，氧气浓度，流速等。所述第一腔室11的尺寸，形状和材料可以根据许多因素任意选择，例如要染色的纺织品22的数量以及所述第二腔室21的尺寸和形状。

第二腔室21是适合于至少容纳所述纺织品22和水溶液的容器，并且其中可以发生所述第二染料前体113到所述不溶性染料111的转化。第二腔室21还可包括将所述纺织品22保持在预定位置以允许更快或更完整的染色过程的装置。所述第二腔室21可以有利地包括一个或多个装置或传感器，其允许监测溶液的参数，例如pH，溶液温度，氧气浓度，流速等。所述第二腔室21的尺寸，形状和材料可以根据许多因素进行选择，例如要染色的纺织品的数量以及所述第一腔室11的尺寸和形状。

第一腔室11和第二腔室21可以单独地进行热调节，例如通过夹套装置(例如水夹套)来进行。

在图4中，第一腔室11与第二腔室21流体连接。所述流体连接可以通过流体连接器11a(例如管子或管道)来进行，本领域技术人员可以选择其尺寸，形状和材料以确保第一腔室和第二腔室之间的流体连接，并且它们能够有效地容纳在所述第一腔室11和所述第二腔室21中循环的水溶液，并且有利地对于这些水溶液呈惰性。根据例如要染色的纺织品的量和溶液所需的流速，可以任意地改变所述尺寸，形状和材料。所述流体连接器(例如管子或管道)可有利地包括用于测量诸如流速、温度、溶液pH和氧气浓度之类的参数的探针，以及用于监视本发明过程和例如对溶液取样的观察孔、圆窗和/或门。

本发明的另一个目的是一种用于对纺织品22进行染色的设备10，其包括：第一腔室11，其包含至少一种第一固定化酶12和包含至少一种染料前体的溶液；至少一个第二腔室21，其包含纺织品22；以及产生溶液流的装置50，其中所述第一腔室11与所述第二腔室21流体连接，由此所述包含至少一种染料前体的溶液可以从所述第一腔室11流到所述第二腔室21，在此至少一部分的所述染料前体被转化为染料111，以对所述纺织品22的至少一部分进行染色，例如如图4所示。所述第二腔室21任选地还包括出口装置，以从所述第二腔室21去除所述溶液。

特别地，图4示出了包含所述第一固定化酶12的所述第一腔室11和包含所述纺织品22的所述第二腔室21。直箭头示出了包含至少一种染料前体的溶液从所述第一腔室11流到所述第二腔室21。在所述第二腔室中，至少一部分的所述第二染料前体113被转化为不溶性染料111，以对容纳在所述第二腔室21中的纺织品22的至少一部分进行染色。

图5示出了设备10的实施方式的示意图，其中第二腔室21具有出口装置21a，并且其中出口装置21a与第一腔室11流体连接。这样排出溶液可以从所述第二腔室21中去除，并且随后被进料到所述第一腔室11中(如图5中的直箭头所示)。出口装置21a可以是任何管子或管道，例如如上所述。

为了在使用所述设备10时连续地进行本发明的方法，保持向第一腔室11和第一固定化酶12提供辅因子和底物是有用的，从而使它们可以持续产生第二染料前体113。因此，化合物(例如，辅因子和底物)被添加到所述第一腔室11和/或流回第一腔室11的排出溶液中。图5的设备10相应地具有进行这种添加的装置，并包括连接到第一腔室11的进给装置11b和/或连接到出口装置21a的进给装置21b。

在本发明的设备10的一个实施方式中，还包括产生溶液流的装置50，例如泵，以使包含在本发明设备10中的溶液流动。

当第一固定化酶12不仅仅只对一个底物特异并且因此能够转化不同的第一染料前体112时，仅通过改变供给到装置10的试剂就可以为要染色的纺织品12提供不同的颜色。通过改变第一染料前体112而不改变设备10和/或其中包含的酶12，可以获得不同的染料111；这些染料111适于在第二腔室21中对纺织品22进行染色。例如，当包含在第一腔室11中的酶12是融合酶PTDH-mFMO(其能够使吲哚及其衍生物转化)时，将包含吲哚的溶液进料至设备10提供了蓝色纺织品。如果在相同的染色过程中，包含5-羟基吲哚的溶液代替包含吲哚的溶液并进料至设备10，则获得棕色染料和棕色染色的纺织品。

图6示出了设备10的另一实施方式，其还包括与至少所述第一腔室11流体连接的一个储存器31，使得包含染料前体的溶液可以从所述储存器31流到所述第一腔室11。图7示出了设备10的另一实施方式，其还包括与所述第二腔室21的所述出口装置21a流体连接的一个收集罐41。

储存器31是能够容纳水溶液的任何容器，所述水溶液例如是至少包含所述第一染料前体112(例如吲哚和/或其衍生物)的溶液。储存器31可以是容器，至少包含所述第一染料前体112的溶液从该容器被供入设备10，以进行本发明的染色过程。因此，有利地设置储存器31，使得操作员可以容易地将溶液和/或其中的溶质进料，并且可以相应地选择其形状和尺寸。图6的设备10还包括产生溶液流的装置50，例如泵，以允许溶液从储存器31流到第一腔室11，如图6中的直箭头所示，因此将包含第一染料前体112的溶液进料到第一腔室11中。

图8示出了既包括储存器31又包括收集罐41的设备10。图8的设备可用于进行本发明的染色过程。在储存器31中提供包含至少一种第一染料前体的溶液。然后由泵50产生这种溶液的流，并且溶液从所述储存器31流到第一腔室11。这种溶液与酶12的接触是在所述第一腔室11内获得。此时包含第二染料前体113的溶液从第一腔室11流到第二腔室21，纺织品22位于第二腔室21中。至少一部分所述第二染料前体113被转化为染料111，以在所述第二腔室21中对所述纺织品22的至少一部分进行染色，并且获得了排出溶液。排出溶液通过出口装置21a从第二腔室21中去除，并收集在收集罐41中。收集排出溶液可能是有利的，例如，当必须处理这种排出溶液以去除可能存在的沉淀物(例如不溶性染料111)时；可以在收集罐41中进行这种处理。排出溶液流回到包含在所述第一腔室11中的所述第一固定化酶12中(流过储存器31)，使得溶液中任何未反应的第一化合物112可以与所述第一固定化酶12接触。诸如第一染料前体111和辅因子之类的溶质也可以通过储存器31添加到溶液中。如图8所示的设备10还可以具有其他装置来进行溶质的加料，例如连接到第一腔室11的进料装置11b和/或连接到出口装置21a的进料装置21b(图8中未示出)。

在本发明的设备10中可以存在多于一个储存器31和/或多于一个收集罐41，并且它们可以串联和/或并联设置。

在另一个实施方式中，在本发明的设备10中还包括用于从一种或多种起始化合物114(例如色氨酸)开始生产第一染料前体112(例如吲哚)的反应器51，例如如图9所示。这种反应器51至少包含起始酶14。可以通过进料装置51b将包含起始化合物114的溶液进料到反应器51中，在此使该溶液与起始酶14接触，使起始化合物114转化为第一染料前体112。然后，通过第二泵50b产生所述溶液的流，使包含第一染料前体112的溶液可以流到第一腔室11。一旦包含第一染料前体112的溶液流到第一腔室11，就可以进行本发明方法的步骤a}至d}。图9表示一个实施方式，其中反应器51相对于从第一腔室11流向第二腔室21的溶液的流动平行设置；然而，本发明包括其中一个或多个反应器51相对于所述溶液的流动串联设置，优选设置在第一腔室11的上游的实施方式。

序列表

<110> 尚科纺织企业工业及贸易公司(Sanko Tekstil Isletmeleri San. Ve. Tic.A.S.)

<120> 纺织品染色的方法和设备

<130> 170296S35

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 513

<212> PRT

<213> 紫黑链霉菌(Streptomyces violaceusniger)

<400> 1

Leu Asn Asn Val Val Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Trp Met Thr

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Ala Phe Gly Asp Arg Ile Asp Ile Thr Leu

20 25 30

Val Glu Ser Gly His Ile Gly Ala Val Gly Val Gly Glu Ala Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Ile Arg His Phe Phe Glu Phe Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asp

50 55 60

Trp Met Pro Ala Cys Asn Ala Thr Tyr Lys Leu Ala Val Arg Phe Glu

65 70 75 80

Asn Trp Arg Glu Lys Gly His Tyr Phe Tyr His Pro Phe Glu Gln Met

85 90 95

Arg Ser Val Asn Gly Phe Pro Leu Thr Asp Trp Trp Leu Lys Gln Gly

100 105 110

Pro Thr Asp Arg Phe Asp Lys Asp Cys Phe Val Met Ala Ser Val Ile

115 120 125

Asp Ala Gly Leu Ser Pro Arg His Gln Asp Gly Thr Leu Ile Asp Gln

130 135 140

Pro Phe Asp Glu Gly Ala Asp Glu Met Gln Gly Leu Thr Met Ser Glu

145 150 155 160

His Gln Gly Lys Thr Gln Phe Pro Tyr Ala Tyr Gln Phe Glu Ala Ala

165 170 175

Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Val Glu Arg Gly Val Lys

180 185 190

His Ile Val Asp Asp Val Arg Glu Val Ser Leu Asp Asp Arg Gly Trp

195 200 205

Ile Thr Gly Val Arg Thr Gly Glu His Gly Asp Leu Thr Gly Asp Leu

210 215 220

Phe Ile Asp Cys Thr Gly Phe Arg Gly Leu Leu Leu Asn Gln Ala Leu

225 230 235 240

Glu Glu Pro Phe Ile Ser Tyr Gln Asp Thr Leu Pro Asn Asp Ser Ala

245 250 255

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260 265 270

Cys Thr Thr Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Trp Ile Trp Thr Ile Pro

275 280 285

Leu Thr Gly Arg Val Gly Thr Gly Tyr Val Tyr Ala Lys Asp Tyr Leu

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Ser Pro Glu Glu Ala Glu Arg Thr Leu Arg Glu Phe Val Gly Pro Ala

305 310 315 320

Ala Ala Asp Val Glu Ala Asn His Ile Arg Met Arg Ile Gly Arg Ser

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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485 490 495

Thr Gln Arg Leu Thr Glu Val Leu Pro Lys Ala Tyr Asp Tyr Phe Thr

500 505 510

Gln

<210> 2

<211> 538

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

<400> 2

Met Asn Lys Pro Ile Lys Asn Ile Val Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala

1 5 10 15

Gly Trp Met Ala Ala Ser Tyr Leu Val Arg Ala Leu Gln Gln Gln Val

20 25 30

Asn Ile Thr Leu Ile Glu Ser Ala Ala Ile Pro Arg Ile Gly Val Gly

35 40 45

Glu Ala Thr Ile Pro Ser Leu Gln Lys Val Phe Phe Asp Phe Leu Gly

50 55 60

Ile Pro Glu Arg Glu Trp Met Pro Gln Val Asn Gly Ala Phe Lys Ala

65 70 75 80

Ala Ile Lys Phe Val Asn Trp Arg Lys Pro Pro Asp His Ser Arg Asp

85 90 95

Asp Tyr Phe Tyr His Leu Phe Gly Ser Val Pro Asn Cys Asp Gly Val

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

His Phe Asp Ala His Leu Val Ala Asp Phe Leu Lys Arg Trp Ala Val

165 170 175

Glu Arg Gly Val Asn Arg Val Val Asp Glu Val Val Glu Val Arg Leu

180 185 190

Asn Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Thr Leu Leu Thr Lys Glu Gly Arg Thr

195 200 205

Leu Glu Gly Asp Leu Phe Ile Asp Cys Ser Gly Met Arg Gly Leu Leu

210 215 220

Ile Asn Gln Ala Leu Lys Glu Pro Phe Ile Asp Met Ser Asp Tyr Leu

225 230 235 240

Leu Cys Asp Ser Ala Val Ala Ser Ala Val Pro Asn Asp Asp Val Arg

245 250 255

Glu Gly Val Glu Pro Tyr Thr Ser Ala Ile Ala Met Asn Ser Gly Trp

260 265 270

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275 280 285

Ser Ser Lys Phe Thr Ser Arg Asp Gln Ala Thr Ala Asp Phe Leu Asn

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Leu Trp Gly Leu Ser Asp Asn Gln Ser Leu Asn Gln Ile Lys Phe Arg

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Leu Ser Ser Cys Phe Leu Glu Pro Leu Glu Ser Thr Gly Ile Tyr Phe

340 345 350

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370 375 380

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530 535

<210> 3

<211> 174

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

Met Lys Val Leu Val Leu Ala Phe His Pro Asn Met Glu Gln Ser Val

1 5 10 15

Val Asn Arg Ala Phe Ala Asp Thr Leu Lys Asp Ala Pro Gly Ile Thr

20 25 30

Leu Arg Asp Leu Tyr Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ala Ile Asp Val Glu

35 40 45

Lys Glu Gln Lys Leu Cys Glu Glu His Asp Arg Ile Val Phe Gln Phe

50 55 60

Pro Leu Tyr Trp Tyr Ser Ser Pro Pro Leu Leu Lys Lys Trp Leu Asp

65 70 75 80

His Val Leu Leu Tyr Gly Trp Ala Tyr Gly Thr Asn Gly Thr Ala Leu

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170