同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒。

背景技术

视黄醇结合蛋白(RBP)是肝脏合成的一种小分子量的脂质运载蛋白，其分子量为21KD，其在体内承担着将视黄醇由肝细胞运输至机体组织和细胞的作用，血清RBP运输视黄醇的方式是与前白蛋白(PA)和视黄醇结合形成大分子复合物，此复合物不能通过肾小球的滤过膜滤从而存在于人体血液中；当复合物到达靶细胞后，视黄醇被靶细胞吸收，RBP解离成小分子量的游离态而进入血清，且能够肾小球滤过，进入到肾小管中被上皮细胞吸收转化成氨基酸供机体再利用，另外有极小部分RBP未被吸收而直接随尿液排出体外。

在临床上，血清RBP和尿液RBP的水平可作为机体的肝、肾损伤以及糖尿病等其他综合征的有效检测指标。RBP在肝脏中合成，若肝脏合成功能受损，血清RBP的浓度便会随之降低，且其下降程度与肝脏受损情况高度相关，肝脏损伤越严重，降低程度越大，肝硬化时更低。由于RBP的半衰期较短，反应变化灵敏，更适于作为早期肝功能损伤的指标。

视黄醇结合蛋白在肾脏中进行代谢，所以尿液RBP水平对肾病的早期诊断具有十分重要的意义。一些疾病(比如糖尿病、高血压等)导致机体的肾小球功能受损，肾小球滤过受到阻碍，使RBP在血液中积累导致血清RBP含量升高；另外，某些肾脏疾病(比如病毒感染)会导致机体肾小管的重吸收功能受损伤，体液内的RBP进入到肾脏后不能被重吸收，全部随尿液排出体外，导致尿RBP含量升高。

除肝脏和肾脏疾病外，RBP还与其他疾病有着密切联系。有研究表明，当胰岛素抵抗力増强会导致血液RBP的浓度升高，从而导致机体肥胖；另外，血清RBP还可反应机体的营养状况，可作为机体早期和亚临床型营养缺乏检测的敏感性指标。

目前临床针对视黄醇结合蛋白的诊断方法主要有酶联免疫法、免疫透射比浊法、放射免疫分析法、免疫电泳法、胶乳增强免疫比浊法等。

酶联免疫法就是利用抗体与酶的结合，通过酶标二抗的显色情况进行检测。该法作为免疫学中常用的检测方法具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便，实用性强的优点，但其抗干扰能力不强，容易受样本中干扰因素的影响的缺点使其的应用具有一定的局限性。

免疫放射分析法是将放射核素标记的抗体和抗原或半抗原结合，形成抗原抗体复合物，其放射性和所加抗原量正相关，通过检测其放射性来确定抗原浓度。此法比较检测速度块和操作简便，且灵敏度高、特异性好，但容易出现交叉反应、假阳性反应等，影响检测结果。

免疫电泳是指利用血清或尿液中蛋白质所带电荷的不同和分子量大小的差异来对不同蛋白进行分离的技术，琼脂糖为载体，利用免疫学理论，将琼脂区带电泳与双向扩散相结合产生特异性的沉淀线、弧或峰的一种方法。此法灵敏度髙，但是操作复杂，在大批量的临床标本的检测中不适用。

免疫透射比浊法原理是可溶性抗原与相应的抗体发生特异性结合，形成不溶性的免疫复合物，当一定波长的光线通过抗原抗体复合物时，其浊度将发生变化，通过测量其吸光度值可测定相应抗原的浓度。此方法准确性高、操作简单，在临床医学诊断中得到广泛的应用。

相比于免疫电泳法的操作复杂、不适用于临床自动化分析，酶联免疫法只能用于定性或半定量分析，放射免疫分析法存在放射污染和安全性等问题，免疫透射比浊法因其操作简便、准确度高、试剂稳定性好、抗干扰能力强、检测成本低等优点成为最值得推广的一种临床自动化检测方法。

在免疫比浊法基础上建立了一种灵敏度更高的检测方法，那就是胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是将特异性抗原或抗体包被在胶乳微球表面上，当检测样品中含有对应的抗体或抗原时，两者发生特异性免疫反应后，免疫胶乳微球出现团聚，使样品的浊度增大。与免疫比浊法检测原理相同，根据样品溶液中待测成分的含量与样品的浊度呈正比，通过检测溶液的浊度，即可计算出样品中待测蛋白的含量。该方法可运用全自动生化仪对免疫反应后的溶液直接检测，操作简单、检测快速。

市面上的RBP试剂盒大部分使用单粒径的微球来制备试剂2，但是此种方式很难同时满足高线性和低值的高灵敏度。有一些同样采用了大小球联用的发明中大小球分别连接不同的抗体，因为抗体不同，所以特异性会有差异，且采用分开偶联的工艺，生产过程较复杂。因此，提供一种可同时测定人血清和尿液视黄醇结合蛋白含量的试剂盒具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合，包括试剂一和试剂二；

其中，试剂一包括葡聚糖硫酸钠；

试剂二包括标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒；所述乳胶颗粒由抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与乳胶微球偶联制得；

所述乳胶微球包括第一胶乳微球和第二胶乳微球；所述第一胶乳微球的粒径为80nm；所述第二胶乳微球的粒径为200nm。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一胶乳微球与所述第二胶乳微球的重量比为1:3。

在本发明的一些具体实施方案中，所述标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒的制备方法包括：

步骤1、微球活化：取粒径为80nm的第一胶乳微球和粒径为200nm的第二胶乳微球以1：3的重量比进行混合，经10mM pH值5的MES缓冲液稀释至浓度为2％(w/w)，以120ml/L的体积比加入浓度为0.5mg/ml的EDC，于20～30℃震荡活化30min，制得微球体系；

步骤2、稀释抗体：将抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体和酪蛋白加入至50mmolPH7.0 MOPS缓冲液中，所述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体、酪蛋白与所述MOPS缓冲液按照2：1：45的重量比混合均匀，制得稀释后的抗体；

步骤3、抗体-微球偶联：将步骤2制得的所述稀释后的抗体匀速6ml/min加入至步骤1制得的所述微球体系中，反应18小时；

步骤4、超声：超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；

步骤5、离心：于15000rpm离心15min，收集沉淀；

步骤6、超声分散：超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；所述沉淀分散于存储液中，制得标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒溶液；

所述存储液的组分包括：

在本发明的一些具体实施方案中，所述标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒溶液中标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒的浓度为0.4％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂一中所述葡聚糖硫酸钠的分子量为1500～50000，浓度为0.1～2％(w/v)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂一还包括50～100mM MOPS缓冲液，0.1％～1％(w/w)BSA，1％～5％NaCl，0.1％～1％Tween，0.5％～5％EDTA，所述试剂一的pH值为5.0～8.0。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂一与所述试剂二的体积比为3:1。

基于上述研究，本发明还提供了所述的试剂组合在制备同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂盒中的应用。

本发明还提供了同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂盒，包括所述的试剂组合以及可接受的助剂或载体。

本发明还提供了基于所述的试剂组合或所述的试剂盒的非疾病诊断目的的检测方法，采用终点测定法，反应方向为上升；主副波长为604/NONE，读点为18-19/31-33，样本量与所述试剂组合的体积比为(6～20):200。

市面上的RBP试剂盒大部分使用单粒径的微球来制备试剂2，但是此种方式很难同时满足高线性和低值的高灵敏度。所以本发明采用大小两种粒径的微球来制备胶乳试剂，来达到高线性和优异的低值灵敏度。

有一些同样采用了大小球联用的发明中大小球分别连接不同的抗体，因为抗体不同，所以特异性会有差异，且采用分开偶联的工艺，生产过程较复杂。针对此问题，本发明的大小球偶联的抗体为同一种抗体，同时进行偶联，工艺简单。

试剂二的制备过程中将抗体和酪蛋白一起加入微球中能够使抗体更均匀的与微球上的活化基团连接，同时酪蛋白还能封闭微球上多余的活化基团，提高试剂稳定性。

通常试剂一对试剂的线性同样具有较大的影响，本发明通过向试剂一中添加一种葡聚糖钠盐来提高试剂的线性和抗干扰性能。

由于RBP在测尿液样本时容易出现基质效应而影响测值准确性，本发明通过向试剂一中添加EDTA来螯合尿液样本中的金属离子来消除基质效应。

市面上的试剂虽然有的能够血尿同测，但是要使用不同的参数，本实验血尿使用同一参数，可在同一通道进行检测。

本发明提供的试剂盒通过大、小微球联用的方法制备试剂来保证试剂能够同时满足测定人血清和尿液时均具有优异的线性和精密度；尿液和血液使用同一个参数，简化检测操作，提高效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例1提供的试剂盒的定标曲线；

图2示未加葡聚糖硫酸钠的试剂盒对线性的影响；

图3示添加葡聚糖硫酸钠的试剂盒对线性的影响；

图4示本发明实施例1提供的试剂盒检测血清样本的线性曲线；

图5示对照试剂检测血清样本的线性曲线；

图6示本发明实施例1提供的试剂盒与对照试剂检测血清样本的相关性分析结果；

图7示本发明实施例1提供的试剂盒与对照试剂检测尿液样本的相关性分析结果；

图8示去离子水稀释的样本的基质效应；

图9示尿液稀释的样本的基质效应。

具体实施方式

本发明公开了同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

RBP检测试剂盒的制备：

试剂1：含50～100mM MOPS缓冲液，0.1％～1％BSA，1％～5％NaCl，0.1％～1％Tween，0.5％～5％EDTA，0.1～2％葡聚糖硫酸钠(分子量为1500～50000)，pH值5.0～8.0。

试剂2：

标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的的胶乳颗粒的制备：1.微球活化：将粒径为80nm的小胶乳微球和粒径为200nm的大胶乳微球以1：(2～4)的比例进行混合，后用10mM PH＝5的MES缓冲液稀释至浓度为2％，之后加入EDC(0.5mg/ml)室温下震荡活化30min；2.稀释抗体：将抗体和酪蛋白以2：1的比例加入至50mmPH(6.0～8.0)MOPS缓冲液中，混合均匀；3.抗体-微球偶联：将稀释好的抗体匀速加入至微球体系中进行反应；4.超声：偶联反应(15～30℃之间，200～400转速之间)18小时后将反应体系进行超声使通过物理吸附至微球上的抗体脱落；5.离心：离心条件为离心条件为15000rpm，15min，去上清，6.超声分散：离心后的沉淀悬浮于存储液中，超声波分散使得终浓度为0.4％。

RBP的检测参数：

测定仪器：东芝FX8

表1

(备注：检测尿液样本使用标准样本量；检测血清样本使用复查1或者复查2样本量；例如：20μl样本加120μl稀释液混匀后取12μl，后加入反应体系进行反应。)

表中数据的说明，例如复查1组：取20ul样本加120ul稀释液混匀后取12ul,后加入反应体系进行反应。

本发明的有益效果包括但不限于：

本发明中，先将大小球进行混合后再进行偶联，工艺简单，试剂二离心前先进行超声可有效去除物理偶联的抗体，提高试剂稳定性。

本发明中，所述试剂二中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例。

本发明中，所述试剂二中葡聚糖硫酸钠含量和分子量。

本发明中，血清和尿液使用同一参数。

本发明提供的同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。

本发明所述对照试剂为国内优秀厂家的RBP试剂盒，对照试剂的组成成分：R1：主要成分为磷酸盐缓冲溶液，R2：主要为磷酸盐缓冲溶液和胶乳包被抗人视黄醇结合蛋白抗体。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1RBP检测试剂盒的制备

试剂1：含50mM MOPS缓冲液，1％BSA，5％NaCl，1％Tween，5％EDTA，2％葡聚糖硫酸钠(分子量为1500)，PH5.0。

试剂2：

标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的的胶乳颗粒的制备：1.微球活化：将粒径为80nm的小胶乳微球和粒径为200nm的大胶乳微球以1：2的比例进行混合，后用10mM PH＝5的MES缓冲液稀释至浓度为2％(重量比)，之后以200mg/每升R2加入EDC(0.5mg/ml)室温(25±5℃)下震荡活化30min；2.稀释抗体：将抗体和酪蛋白以2：1的比例加入至50mmPH6.0MOPS缓冲液中(抗体：酪蛋白：缓冲液的重量比为2：1：45)，混合均匀；3.抗体-微球偶联：将稀释好的抗体匀速(6ml/min)加入至微球体系中进行反应；4.超声：偶联反应(25±5℃下搅拌)18小时后将反应体系进行超声(超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；)使通过物理吸附至微球上的抗体脱落；5.离心：离心条件为离心条件为15000rpm，15min，去上清，6.超声分散：离心后的沉淀悬浮于存储液中，超声波分散(超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；)使得终浓度为0.4％。

实施例2 RBP检测试剂盒的制备

试剂1：含100mM MOPS缓冲液，0.1％BSA，1％NaCl,，0.1％Tween,0.5％EDTA，0.1％葡聚糖硫酸钠(分子量为50000)，PH8.0。

试剂2：

标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的的胶乳颗粒的制备：1.微球活化：将粒径为80nm的小胶乳微球和粒径为200nm的大胶乳微球以1：3的比例进行混合，后用10mM PH＝5的MES缓冲液稀释至浓度为2％(重量比)，之后以200mg/每升R2加入EDC(0.5mg/ml)室温(25±5℃)下震荡活化30min；2.稀释抗体：将抗体和酪蛋白以2：1的比例加入至50mmPH7.0MOPS缓冲液中(抗体：酪蛋白：缓冲液的重量比为2：1：45)，混合均匀；3.抗体-微球偶联：将稀释好的抗体匀速(6ml/min)加入至微球体系中进行反应；4.超声：偶联反应(25±5℃下搅拌)18小时后将反应体系进行超声(超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；)使通过物理吸附至微球上的抗体脱落；5.离心：离心条件为离心条件为15000rpm，15min，去上清，6.超声分散：离心后的沉淀悬浮于存储液中，超声波分散(超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；)使得终浓度为0.4％。

实施例3 RBP检测试剂盒的制备

试剂1：含75mM MOPS缓冲液，0.5％BSA，3％NaCl,0.5％Tween,2.5％EDTA，1％葡聚糖硫酸钠(分子量为25000)，PH7.0。

试剂2：

标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的的胶乳颗粒的制备：1.微球活化：将粒径为80nm的小胶乳微球和粒径为200nm的大胶乳微球以1：4的比例进行混合，后用10mM PH＝5的MES缓冲液稀释至浓度为2％(重量比)，之后以200mg/每升R2加入EDC(0.5mg/ml)室温(25±5℃)下震荡活化30min；2.稀释抗体：将抗体和酪蛋白以2：1的比例加入至50mmPH8.0MOPS缓冲液中(抗体：酪蛋白：缓冲液的重量比为2：1：45)，混合均匀；3.抗体-微球偶联：将稀释好的抗体匀速(6ml/min)加入至微球体系中进行反应；4.超声：偶联反应(25±5℃下搅拌)18小时后将反应体系进行超声(超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；)使通过物理吸附至微球上的抗体脱落；5.离心：离心条件为离心条件为15000rpm，15min，去上清，6.超声分散：离心后的沉淀悬浮于存储液中，超声波分散(超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；)使得终浓度为0.4％。

实施例4检测方法

RBP的检测参数：

测定仪器：东芝FX8

表2

(备注：检测尿液样本使用标准样本量；检测血清样本使用复查1或者复查2样本量)

效果例1

本发明提供的试剂盒的定标曲线如图1所示。

效果例2硫酸葡聚糖对试剂抗干扰性能的影响：

例如要配制含2g/L血红蛋白的血清样本，就先配制一个20g/L的血红蛋白水溶液，然后180ul的血清中加入20ul的血红蛋白水溶液就是2g/L的血清样本，以此类推，空白血清就是180ul的血清加入20ul的水。

参照表1中参数设置进行检测即可，样本量使用复查1样本量

表3

由表3数据可知，本发明提供的试剂盒中添加葡聚糖硫酸钠对抗乳糜的干扰有明显作用。

效果例3硫酸葡聚糖对试剂线性的影响：

此实验主要是为了验证R1中加入葡聚糖硫酸酯对试剂线性有改善，分别是不添加葡聚糖的R1和添加葡聚糖的R1分别搭配相同的R2，检测线性，线性样本的稀释是用水倍比稀释，1/2就是指一半般血清一半水，1/4就是指一份血清，三份水，以此类推。

参照表1中参数设置进行检测即可，样本量使用复查1样本量

如图2～图3、表4～表5所示：

表4

表5

上述结果表明：葡聚糖硫酸钠对线性的提高具有明显作用。

效果例4试剂盒检测血清样本性能实验

(1)线性

RBP高值血清样本用去离子水按照1，3/4，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，0的比例进行倍比稀释，每个浓度按照实施例4的测定方法和条件，重复测定3次，计算均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见表6、图4～5。

参照表1中参数设置进行检测即可，样本量使用复查1样本量

根据理论值与检测值计算线性偏差，结果表明本发明试剂盒对血清样本RBP的检测上限可达到170mg/L。

表6

(2)相关性分析：

按照实施例4的测定方法和条件，本发明提供的试剂盒与对照试剂盒同时检测20例血清样本，结果如表7、图6所示：

表7

效果例5试剂盒检测尿液样本性能实验

(1)灵敏度实验

选取一份高值尿液样本进行倍比稀释，配制出不同浓度(0.125，0.25，0.5，1mg/L)的样本，每个样本按照实施例4的测定方法和条件，重复测定10次，计算均值和标准差，结果见表8。

参照表1中参数设置进行检测即可，样本量使用标准样本量

从表8中可见，本发明试剂盒的对尿液RBP的检测灵敏度为0.125mg/L。

表8

(2)相关性分析

按照实施例4的测定方法和条件，本发明提供的试剂盒与对照试剂盒同时检测20例尿液样本，结果如图7、表9所示：

表9

(3)基质效应

用去离子水和低值尿液样本同时倍比稀释一个高值尿液样本，用对照试剂和本发明试剂盒分别同时检测(按照实施例4的测定方法和条件)。其中，图8示去离子水稀释的样本，图9示尿液稀释的样本。本发明测试两种方法稀释的样本均有良好的线性，说明测尿液样本无基质效应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。