OsROC1在水稻育种中的应用

技术领域

本发明属于农作物育种技术领域，具体涉及水稻最外层细胞特异性基因1（

背景技术

近年来，水稻功能基因组研究的快速发展，为我国水稻遗传育种鉴定了大量的有重要利用价值的基因，水稻育种正迈向设计育种的新时代。水稻育种的创新发展为我国口粮安全提供了重要保障，提高单产仍是未来一段时期内我国水稻育种的主攻方向。因此仍要继续重视发掘、克隆和鉴定新的水稻重要农艺性状调控基因，为设计育种提供元件，服务于新时期水稻育种的精准化、数据化和智能化战略需求。

目前，国内外关于同源异型域-亮氨酸拉链蛋白IV家族中的水稻最外层细胞特异性基因亚族的研究并不多，而该亚族基因在水稻中的作用少之又少，本发明对该亚族成员之一OsROC1(Rice outermost cell-specific gene1)的表达及作用进行了研究，初步明确了

发明内容

本发明的目的是提供了

本发明通过构建敲除

AATAAATGCGATTGCATCCGCTCAACACTCGCCCCCCCTCTCGCAATAACTCCTCCTCCCCATCTCCACATTCCTCCCCCAAATCCCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCCCATGGCGATCGGCGTCTGCTTCTAGCTGGAGAGATCTCGCTTCGTTTCGAGCTGTCCACCGGTGGTTTTCTCGCATGCGATATCACACGCTTCTTGGAAGCACATCAGGTAGAACAGGGCAGAGATCAAGGCGGATATATACAGCTAGATCTCATCTTGTTGCTGTCGTCTCTAACACAGGTTTTGATGGGATTTTTGTTTTTCTTTGCAGAGTTCTTGGTGCTGACCTTGCCCTAGATCTGCTTCTGACTGTTGCTGTTACGTGGCGTGCAAGCTAGCTATAGCCATTTCTGTGTGTGTAGCTGTACTGGTGGTGAAGAAGAAGATGCAAGCGAATGGGTGGAGGAGCTAGAGGCTTGGCTGGAGGAAGAAGAAGAAGGGGTTGGTGGTGGCTAGCTAGCTAGGGTGCGTGCTTAATTACCTGGCTTCGTTCATGACGCCGGCGAGGCGCATGCCGCCGGTGATCGGCCGGAACGGCGTGGCGTACGAATCGCCGTCGGCGCAGCTGCCCCTCACCCAGGTACGGTAGTTCTTCAGAGATGAACAAGAACCCACCGTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTGCAGCTTTCTTTTTTTGAAGTAAATTTTGAAAAAAAGTTGGTGTACTTTTTGTTTGCAGCTAGTTACTTTATTAATTTGCTTTTCGTTTTCTTTTTTCTTGTTGCGTTTGACTCTTGTACTATAATTTAATTGGCTGTGCATCTGTTTTTCATTTTGTTTTGGAAACGGTTGCTAGCTGTGAATACGTGCATGCATTAATTGGCGTGCCATTCGAGGATACTGAGTTTACTGGCCAATTGATGAGCTCTTTTATTGGAAATCAGAAGTACTGGTTGGAGATATCATACACAGTACAGAGAAAGAGAAGTTGATCTTTTGTTCATACAACTTCATACATGAACATGAGTCAAGCAAGAACTGAAGAAACCATACATGAATACATAAACAAAGTCTCTTCCCTTAGGTCTCTCTAGGTCTTGATCTCTTAATGTTCTAATGATCTATGTTTTTTTAAAAAGAAAAAATTTAAAGGCAGACAGGCACAACAGGTTAAGGGAAGGATTAGTTCATTTTTAGCATCATACTAAAAAGAAAAATAGCTAGCTATATCCATTTTTGACAATCACGTCTCGAAAATACACTATACTGAGCAGAAGCAAGTCAGCAATTTCCAACTTTGCGGCCGAAGTAACTACTCTATCCTATCCCTTTTAGAAAGAAAAAGAAATGGAAGCATGCAAAATTTCCCCTTTTTTATGAGCGTTTCGTATAAGTTTTTCTTTGGTACATCTTAATTGCTTTCTCATTCGATTATTCCAAATTAATCCTGAGCTAGCTATATATGGAACACATATATCTGATGAGTTGGTCTCCTCTCACAAAATACTCTTAATTAATCTCTCCTGAAATTGCAGGCTGATATGCTGGACAGCCATCATCTGCAGCAAGCACTCCAGCAGCAATACTTCGATCAGATCCCGGTGACGACGACGGCGGCGGCGGACAGCGGCGACAACATGCTGCACGGCCGCGCCGACGCCGGCGGGCTGGTTGACGAGTTCGAGAGCAAGTCGTGCAGCGAGAACGTCGACGGCGCCGGCGACGGCCTCTCCGGCGACGACCAGGACCCCAACCAGCGGCCGCGCAAGAAGCGTTACCACCGCCATACCCAGCACCAGATCCAAGAGATGGAAGCGTAAGATTAATTTATCATTTCATCCCTATGTTTTCAATTCTGAGATAATTTTCTTCTCCCTTGCAAATCTTTGTCAGATTGATTAAATGTTATGAATCCTATTCATCAGTTGATCTTTGTAGATTAAGTAAATGTTTGTGAATTTTGATCAGTTTCTTCAAGGAGTGCCCGCACCCAGACGACAAGCAGCGCAAGGAGCTGAGCAGGGAGCTGGGTCTTGAACCTCTGCAGGTTAAATTCTGGTTTCAGAACAAGCGCACACAGATGAAGGCAAGTATAAAAACTCCTTATAGATATATAGAGTGTTCTTTGGTTATTTAATTTGATGGCTTCAGACTAAAATGATTGGGAATTACTGAAAAATAAAATTTTGGTGCACTAAATTCCAAAATCCAAGACTAGGAAAAAAAAACACGTTGGACACTGGGGAAGGACCCAATATCGAATTTATTAAGAAAGAGGGTCAACCAGCTGCACCATGCCATCAGCGCTACACACAGTCACAAAATCCAAGACTAAGAAACGGATTATTGCAATCCATGTTCTTTTCAGTTCATTCACAATATTATTCAAATAGATTATTTATTCCATGCTTTAAAAAATATGTTTTTCTCAAAACAATTTCTCAAAAATTACTGCCTATTTATTTCTTAAAACATTTAATATAAACCTTATAATTAAGTAGATGTTCCGCGACAATAATCTAAATCAAATAGGGGTGAGTTCTAAATCTAAATCAGCTAATAATTTGATTTTTCATTCTTCATACTAGTACAATAATGAGCAGTTTTCTACTTAATTACTGGAGCATGTATAATATTTATATACTTAAGTTACAGTATCTATATGAATATTTAGATTGAACAACGAAGGTATATAATGTTTATATAACTATCTCCATATATCTTTCATGATACTAAATCTTATAGTATCTTTCAGAATTTATATATTCTAATACAAACTATAGTCATCAAAGTTGTGTTTTCTCTAAACCATATTCCAATGCACTTAATTGTTTGTGACCGGAGTTAATTAGTACTGCTATCAATTTTTGGCCAAAAAAGCAAATTAGGTTGTGCACACACGGATGAAACTAGGCGGTACTACTAAGAAAGGACGATGTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGGTCTTGAATTAAAATGTTTGGATAACACTGAGGAAAAGTTTTCTCAACTTGAAATCAATGCAAGTGTCTAAACCTCACATAACAATTTGCACTGGCTTGCATTAACCAATTTTCCCGAGGACGCGGATGTTGCTCAGCAGCAAGATTGTTTCCTGCACCACCACAGCAGTTAGTGTTTGAATTGAACCTTGTTGTATCTCTTAATGGAACAGACTATATGAAACAACATTGGGACTCACCATTTAGTTTTAGTTTATGGTTAATTACTATGAAGAAATACTCCATTCGTCTTAAAATATTAGTATTAGTAGAATAATGCTAAGTCAAACATTTTCAGCTTTATCTATTAATAGTCAAAAAAAATAAAACAGATCAATCATTGTAAAATTGATGTTACTAGATTTATCATTAAATAAATTATCATAATATATAACTCTTTTTATTTAAAGCATCTTAACTTTATAGATATTATTGGTTAAATGAGCATCTCGAAAATTGTGTTAAAGTTCAAAAATGCTTATATTTTGGAACGGAGAGAGCATGTTATTTCTTTCTTCACTTCTTTTTTTCATTTCTGATTTATTTTATTTCACTTCTCCCTCTGGCCTCTACTCCTGTTATACATGGTAGATATAGTGAAATATATTCCAGCCCAGACGTGTGTGTGTGTATATATATATGCATCTTTTTGTCTATTGAACAGATGGAAAAATATTGTGTTTTCTGTCAGCTACATATATTGATCGATTGACCCTTACAAAACTATAAATATATCAGTAAAATTAATGTTGTAATAGTATATTGACGATATGTAGTGTTGAATTAATTCAGAACCAGCACGAGAGGCACGAGAACGCGCAGCTGCGGGCGGAGAACGACAAGCTGCGCGCGGAGAACATGCGATACAAGGAGGCCCTGAGCAGCGCGTCGTGCCCCAACTGCGGCGGCCCCGCCGCCCTCGGCGAGATGTCCTTCGACGAGCACCACCTCCGCGTCGAGAACGCCCGCCTCCGCGACGAGATCGACCGCATCTCCGGCATCGCCGCCAAGCACGTCGGCAAGCCCCCCATCGTCTCCTTCCCCGTCCTCTCCTCCCCGCTCGCCGTCGCCGCCGCCCGCTCCCCTCTCGACCTCGCCGGCGCCTACGGCGTCGTCACCCCCGGCCTCGACATGTTCGGCGGCGCCGGCGACCTCCTCCGCGGCGTGCACCCGCTCGACGCCGACAAGCCCATGATCGTGGAGCTCGCCGTCGCCGCCATGGACGAGCTCGTCCAGATGGCCCAGCTCGACGAGCCGCTCTGGTCGTCGTCGTCGGAGCCGGCGGCGGCGTTGCTCGATGAGGAGGAGTACGCGCGCATGTTCCCGCGCGGCCTCGGCCCCAAGCAGTACGGCCTCAAGTCGGAGGCGTCCCGCCATGGCGCCGTCGTCATCATGACGCACAGCAACCTCGTCGAGATCCTCATGGATGTGGTCAGTCTCACAATACTCAAACCTACTACTGCTAGTGCTACCTAAATATGCAGTAATTTCAGTTGAATTTCGCTTGAATAATTTTGCTGCAGAATCAATTCGCGACGGTGTTCTCGAGCATCGTGTCGAGAGCGTCCACGCACGAGGTGTTGTCCACAGGCGTGGCAGGCAACTACAATGGTGCACTGCAAGTGGTACGTACACGTCTTCTTCATCCTCATCGACTACTCGATCAACTCCTTAATTAATCTGTTCATGGCACGCCTCCAATTCCATGCTCCATGGATATATTCTGGAATTAATCCACCAGATATATGATGATCTAAACATTATCGGTTGCAGATGTCAATGGAGTTTCAAGTGCCGTCGCCGCTGGTGCCGACGAGGGAGAGCTATTTCGTCAGGTACTGCAAGAACAACTCCGACGGGACATGGGCCGTCGTCGATGTCTCTCTCGACAGCCTCCGCCCCAGCCCTGTCCAGAAATGCCGGCGCAGGCCGTCTGGCTGCCTCATCCAAGAAATGCCCAATGGCTACTCCAAGGTAATTAATTCAATCTCTATATATATATATCTACAATATTAAAGGATAGTACATATTGTTGTTGTTCATATTTTGTCAGCAAAAGTTGAAATGGTTTGATCGTTCATATTCTGTTGGCAAAGTTAATTTGAAATGTATTGGGTTGTTGTGTGTAGGTGACATGGGTGGAGCATGTGGAGGTGGACGACAGCTCGGTGCACAACATCTACAAGCCATTGGTGAACTCCGGCCTCGCATTCGGCGCGAAACGGTGGGTCGGCACGCTGGACCGGCAATGCGAGCGCCTCGCCAGCGCCATGGCCAGCAACATCCCCAATGGCGACCTTGGAGGTACAAGACGAATCAATCAATCAATTAACCACTCCTACGTCCTACTAATTGCAATTATAAGAAGTACAGATAATTGTGACCAATGAAATGCCACATTACAATCATGATTACTGATGATTAGTATAATTTGTGTATGAAATGTTATGTGTTGTGGTGCAGTGATTACAAGCGTGGAGGGGAGGAAGAGCATGTTGAAGCTGGCGGAGAGGATGGTGGCGAGCTTCTGCGGCGGCGTGACGGCGTCGGTGGCGCACCAGTGGACGACGCTGTCGGGCAGCGGGGCGGAGGACGTGCGCGTCATGACGAGGAAGAGCGTCGACGACCCCGGCAGGCCACCGGGCATCGTGCTCAACGCCGCCACCTCCTTCTGGCTCCCCGTCCCTCCCGCCGCCGTCTTCGACTTCCTCCGCGACGAGACCTCTCGCAGCGAGGTGCCCAATTTGCCCCCCATCCCTAGGGAATTTATCCAATTTGCTGACCAAATTTTATACGTGATCAAATTCATTCCTGACGAGTTTGGATTTCCGCAGTGGGACATTCTGTCCAACGGCGGCGCCGTCCAAGAAATGGCTCACATTGCCAACGGCCGTGACCATGGCAACTCTGTCTCGCTTCTTCGTGTCAATGTAAGTGCCAATTAGTTACTACTCATCAAGGCAATAAATAGCATGTAACGGTCGGTAGCGAATTAGTGTCTGGGTAGCGGATTGCAAATAGCAGGCACTAAGTTCCAATAGCATAATTAAGAAAAATAACCATAAATTTAGATTGTATATCAATATTAACATCAAGTTTCACTTAAAGTTTAAAATTTAGACTGCATGTTTAACTACTACTACATTTCATAACATAAATATATAAGATAAAGAAAACATACAATGCTAGGTTATTCTATCCATATGTAAAGAACACTATCTAAACATTATAGCAATTCAACAAAGTCAATAGCAGGCTGCTATACCTTGTAGCGGCATCGGTAGAGGATCACTACTGCTATATTGCAGCCGCTACGAATGCTATTTATTACCTTCTGCTCATGAATCTGATGATTACACTGTTTACACACGATGAAATCGGGTATCATCATTTCTATAAAATTAAGTAATGATGTGTTTATATATGTATGATTTGTCCATGTGTGTAGAGTGCAAATTCAAACCAGAGCAACATGCTGATCCTGCAAGAGAGCTGCACGGACGCGTCGGGCTCCTACGTGGTGTACGCGCCGGTGGACATCGTGGCGATGAACGTGGTGCTCAACGGCGGCGACCCGGACTACGTGGCGCTGCTGCCGTCGGGGTTCGCCATCCTTCCCGACGGGCCGTCGGGGAACGCGCAGGCCGCCGTCGGGGAGAACGGCTCCGGCTCCGGCGGGGGGTCCCTCCTGACGGTGGCGTTCCAGATCCTCGTCGACTCCGTGCCGACGGCGAAGCTCTCGCTGGGCTCCGTCGCGACGGTGAACAGCCTCATCGCCTGCACGGTGGAGCGCATCAAGGCCGCCGTCTGCAGGGACAGCAACCCTCAGTAGTAGCACCGGCTTCAACCAAATATGATCACGAACAATGTTCCAAGGTACATGCTTGCTACGTTTAGTAAAGCGTTGCTGCACGAATCTCAAAGCACCTACTGAAATGTTTTGAATTTGTGTGTGTGTGTTTTTTTGCAGGAGCAGCAAAATTTTGGAGTTTGATTCAGCAGTAGGGAGTCAAGAACGCACCTCAAACTCTCCTTGCCATGTGGTGCCCTTGCTAGTGAAGAATTTGCGAGGAAACCGACGCGTTTGCGAGAAAATTTTCGCGAAGATACATAGTGTCACCACTATGCAAGGGGGGATGGTTCGGGCATTGACTTCCACCTTTTGATTTTCATCAAATGCATCGAAGAGTGGATGCTGCTACCTTGTTGTTTTTCTGAATCTCTATGTTAGGGCTTCTTTTACCATGTTTAAAAAGGGCTATGAAGCCTCATTTTTATCTGTACTGTTGTGATGTGTTGTCTGTTTGTTCAGACTTCAGGTTCCTGTCCCTTAGCTAGGAGTTGAGAATAGAGAGATTCATGTCCCCCCTTTTGGATTTTATCACATTTCCGATGATTTGTAGACTTGTGGTTGTTGCTTGTTGGTCATTACCATTCTTGTCTCAAA

通过T-DNA插入构建的

附图说明

图1为

图2为野生型植株和

图3为

图4为各节间长度及第二节节间细胞形态大小。A为各节间长度；B为第二节节间细胞形态大小。其中，野生型及

具体实施方式

下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1

1．敲除载体的构建和敲除水稻株系的获得

在Oryza sativa cv. Dongjin中构建

植物种植在大田或温室里（14.5小时光照，28℃/9.5小时黑暗，22℃，湿度50%）。种子用含有3%蔗糖的MS培养基（Murashig and Skoog Medium）发芽，种子发芽7天后将幼苗移植到土壤中。

T-DNA插入纯合子突变体植物用以下的引物进行基因型鉴定：

F1：5'-AGGAAGAGCATGTTGAAGCT-3'（SEQ ID NO. 2），

R1：5'-CTACTGAGGGTTGCTGTCCCT-3'（SEQ ID NO. 3）

和5'-AACGCTGATCAATTCCACAG-3' (NGUS1) （SEQ ID NO. 4）。

如图1所示，株系2C-50198中OsROC1被敲除。

2.

提取最上面第二片叶子的中间1.5到2厘米部分的RNA。总RNA提取使用RNAisoPlus（TaKaRa, Shiga, Japan），保证RNA样品260/280的比大于1.8 （NanoDrop 2000;Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA）。cDNA合成采用2μg 总RNA、Moloney murineleukemia virus 逆转录酶（Promega, Madison, WI, USA）、RNasin® RibonucleaseInhibitor（Promega）、oligo (dT)18 引物和dNTP。实时定量PCR检测目的基因表达采用SYBR Green I Prime Q-Master mix （GENETBIO, Daejeon, Republic of Korea）和theRotor-Gene Q（QIAGEN, Hilden, Germany）。所有实验至少取样自四棵不同植株，重复三次以上。基因表达变化根据∆∆Ct方法计算。引物的特异性根据熔点曲线确定，OsUbi5作为内参。

OsUbi5引物序列如下：

F：5'-TGAAGACCCTGACTGGGAAG-3'（SEQ ID NO. 5）

R：5'-CACGGTTCAACAACATCCAG -3'（SEQ ID NO. 6）。

OsROC1的qRT-PCR引物如下：

F2：5'-GGTTCAGGGGGTAATTTGTA-3'（SEQ ID NO. 7）

R2：5'-ATGTGAGCCATTTCTTGGAC-3'（SEQ ID NO. 8）。

如图2所示，与野生型植株相比，

3. RNA干扰载体构建和水稻转化

RNAi载体构建引物如下：

RNAi-F：5'-AGATCCCGGTGACGACGACG-3'（SEQ ID NO. 9）

RNAi-R：5'-CAGCGCGTCGTGCCC GGTACC CC-3'（SEQ ID NO. 10）

划线部分为KpnI酶切位点。

使用Pfu高保真酶进行PCR，产物使用乙醇纯化后，用KpnI消化，载体pGA3720使用SmaI消化，载体pGA3426使用KpnI消化，将三种产物连接后，进行大肠杆菌质粒转化。根据冻融方法将RNAi载体转染到农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中。转基因植物通过农杆菌转化方法培育。

如图3所示，通过RNA干扰技术构建了

4. 石蜡组织切片及染色

为进一步揭示

对温室中每棵植株的最长茎秆的节间进行了测量结果显示野生型与

由以上实验可知，通过T-DNA插入构建的

序列表

<110> 南通大学

<120> OsROC1在水稻育种中的应用

<130> 20210106

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7544

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aataaatgcg attgcatccg ctcaacactc gccccccctc tcgcaataac tcctcctccc 60

catctccaca ttcctccccc aaatcccctc ttcttcttct tcttcttctt cctcctcctc 120

ccatggcgat cggcgtctgc ttctagctgg agagatctcg cttcgtttcg agctgtccac 180

cggtggtttt ctcgcatgcg atatcacacg cttcttggaa gcacatcagg tagaacaggg 240

cagagatcaa ggcggatata tacagctaga tctcatcttg ttgctgtcgt ctctaacaca 300

ggttttgatg ggatttttgt ttttctttgc agagttcttg gtgctgacct tgccctagat 360

ctgcttctga ctgttgctgt tacgtggcgt gcaagctagc tatagccatt tctgtgtgtg 420

tagctgtact ggtggtgaag aagaagatgc aagcgaatgg gtggaggagc tagaggcttg 480

gctggaggaa gaagaagaag gggttggtgg tggctagcta gctagggtgc gtgcttaatt 540

acctggcttc gttcatgacg ccggcgaggc gcatgccgcc ggtgatcggc cggaacggcg 600

tggcgtacga atcgccgtcg gcgcagctgc ccctcaccca ggtacggtag ttcttcagag 660

atgaacaaga acccaccgta tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 720

tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatttgca 780

gctttctttt tttgaagtaa attttgaaaa aaagttggtg tactttttgt ttgcagctag 840

ttactttatt aatttgcttt tcgttttctt ttttcttgtt gcgtttgact cttgtactat 900

aatttaattg gctgtgcatc tgtttttcat tttgttttgg aaacggttgc tagctgtgaa 960

tacgtgcatg cattaattgg cgtgccattc gaggatactg agtttactgg ccaattgatg 1020

agctctttta ttggaaatca gaagtactgg ttggagatat catacacagt acagagaaag 1080

agaagttgat cttttgttca tacaacttca tacatgaaca tgagtcaagc aagaactgaa 1140

gaaaccatac atgaatacat aaacaaagtc tcttccctta ggtctctcta ggtcttgatc 1200

tcttaatgtt ctaatgatct atgttttttt aaaaagaaaa aatttaaagg cagacaggca 1260

caacaggtta agggaaggat tagttcattt ttagcatcat actaaaaaga aaaatagcta 1320

gctatatcca tttttgacaa tcacgtctcg aaaatacact atactgagca gaagcaagtc 1380

agcaatttcc aactttgcgg ccgaagtaac tactctatcc tatccctttt agaaagaaaa 1440

agaaatggaa gcatgcaaaa tttccccttt tttatgagcg tttcgtataa gtttttcttt 1500

ggtacatctt aattgctttc tcattcgatt attccaaatt aatcctgagc tagctatata 1560

tggaacacat atatctgatg agttggtctc ctctcacaaa atactcttaa ttaatctctc 1620

ctgaaattgc aggctgatat gctggacagc catcatctgc agcaagcact ccagcagcaa 1680

tacttcgatc agatcccggt gacgacgacg gcggcggcgg acagcggcga caacatgctg 1740

cacggccgcg ccgacgccgg cgggctggtt gacgagttcg agagcaagtc gtgcagcgag 1800

aacgtcgacg gcgccggcga cggcctctcc ggcgacgacc aggaccccaa ccagcggccg 1860

cgcaagaagc gttaccaccg ccatacccag caccagatcc aagagatgga agcgtaagat 1920

taatttatca tttcatccct atgttttcaa ttctgagata attttcttct cccttgcaaa 1980

tctttgtcag attgattaaa tgttatgaat cctattcatc agttgatctt tgtagattaa 2040

gtaaatgttt gtgaattttg atcagtttct tcaaggagtg cccgcaccca gacgacaagc 2100

agcgcaagga gctgagcagg gagctgggtc ttgaacctct gcaggttaaa ttctggtttc 2160

agaacaagcg cacacagatg aaggcaagta taaaaactcc ttatagatat atagagtgtt 2220

ctttggttat ttaatttgat ggcttcagac taaaatgatt gggaattact gaaaaataaa 2280

attttggtgc actaaattcc aaaatccaag actaggaaaa aaaaacacgt tggacactgg 2340

ggaaggaccc aatatcgaat ttattaagaa agagggtcaa ccagctgcac catgccatca 2400

gcgctacaca cagtcacaaa atccaagact aagaaacgga ttattgcaat ccatgttctt 2460

ttcagttcat tcacaatatt attcaaatag attatttatt ccatgcttta aaaaatatgt 2520

ttttctcaaa acaatttctc aaaaattact gcctatttat ttcttaaaac atttaatata 2580

aaccttataa ttaagtagat gttccgcgac aataatctaa atcaaatagg ggtgagttct 2640

aaatctaaat cagctaataa tttgattttt cattcttcat actagtacaa taatgagcag 2700

ttttctactt aattactgga gcatgtataa tatttatata cttaagttac agtatctata 2760

tgaatattta gattgaacaa cgaaggtata taatgtttat ataactatct ccatatatct 2820

ttcatgatac taaatcttat agtatctttc agaatttata tattctaata caaactatag 2880

tcatcaaagt tgtgttttct ctaaaccata ttccaatgca cttaattgtt tgtgaccgga 2940

gttaattagt actgctatca atttttggcc aaaaaagcaa attaggttgt gcacacacgg 3000

atgaaactag gcggtactac taagaaagga cgatgttttt tttttttggg gggggggggt 3060

cttgaattaa aatgtttgga taacactgag gaaaagtttt ctcaacttga aatcaatgca 3120

agtgtctaaa cctcacataa caatttgcac tggcttgcat taaccaattt tcccgaggac 3180

gcggatgttg ctcagcagca agattgtttc ctgcaccacc acagcagtta gtgtttgaat 3240

tgaaccttgt tgtatctctt aatggaacag actatatgaa acaacattgg gactcaccat 3300

ttagttttag tttatggtta attactatga agaaatactc cattcgtctt aaaatattag 3360

tattagtaga ataatgctaa gtcaaacatt ttcagcttta tctattaata gtcaaaaaaa 3420

ataaaacaga tcaatcattg taaaattgat gttactagat ttatcattaa ataaattatc 3480

ataatatata actcttttta tttaaagcat cttaacttta tagatattat tggttaaatg 3540

agcatctcga aaattgtgtt aaagttcaaa aatgcttata ttttggaacg gagagagcat 3600

gttatttctt tcttcacttc tttttttcat ttctgattta ttttatttca cttctccctc 3660

tggcctctac tcctgttata catggtagat atagtgaaat atattccagc ccagacgtgt 3720

gtgtgtgtat atatatatgc atctttttgt ctattgaaca gatggaaaaa tattgtgttt 3780

tctgtcagct acatatattg atcgattgac ccttacaaaa ctataaatat atcagtaaaa 3840

ttaatgttgt aatagtatat tgacgatatg tagtgttgaa ttaattcaga accagcacga 3900

gaggcacgag aacgcgcagc tgcgggcgga gaacgacaag ctgcgcgcgg agaacatgcg 3960

atacaaggag gccctgagca gcgcgtcgtg ccccaactgc ggcggccccg ccgccctcgg 4020

cgagatgtcc ttcgacgagc accacctccg cgtcgagaac gcccgcctcc gcgacgagat 4080

cgaccgcatc tccggcatcg ccgccaagca cgtcggcaag ccccccatcg tctccttccc 4140

cgtcctctcc tccccgctcg ccgtcgccgc cgcccgctcc cctctcgacc tcgccggcgc 4200

ctacggcgtc gtcacccccg gcctcgacat gttcggcggc gccggcgacc tcctccgcgg 4260

cgtgcacccg ctcgacgccg acaagcccat gatcgtggag ctcgccgtcg ccgccatgga 4320

cgagctcgtc cagatggccc agctcgacga gccgctctgg tcgtcgtcgt cggagccggc 4380

ggcggcgttg ctcgatgagg aggagtacgc gcgcatgttc ccgcgcggcc tcggccccaa 4440

gcagtacggc ctcaagtcgg aggcgtcccg ccatggcgcc gtcgtcatca tgacgcacag 4500

caacctcgtc gagatcctca tggatgtggt cagtctcaca atactcaaac ctactactgc 4560

tagtgctacc taaatatgca gtaatttcag ttgaatttcg cttgaataat tttgctgcag 4620

aatcaattcg cgacggtgtt ctcgagcatc gtgtcgagag cgtccacgca cgaggtgttg 4680

tccacaggcg tggcaggcaa ctacaatggt gcactgcaag tggtacgtac acgtcttctt 4740

catcctcatc gactactcga tcaactcctt aattaatctg ttcatggcac gcctccaatt 4800

ccatgctcca tggatatatt ctggaattaa tccaccagat atatgatgat ctaaacatta 4860

tcggttgcag atgtcaatgg agtttcaagt gccgtcgccg ctggtgccga cgagggagag 4920

ctatttcgtc aggtactgca agaacaactc cgacgggaca tgggccgtcg tcgatgtctc 4980

tctcgacagc ctccgcccca gccctgtcca gaaatgccgg cgcaggccgt ctggctgcct 5040

catccaagaa atgcccaatg gctactccaa ggtaattaat tcaatctcta tatatatata 5100

tctacaatat taaaggatag tacatattgt tgttgttcat attttgtcag caaaagttga 5160

aatggtttga tcgttcatat tctgttggca aagttaattt gaaatgtatt gggttgttgt 5220

gtgtaggtga catgggtgga gcatgtggag gtggacgaca gctcggtgca caacatctac 5280

aagccattgg tgaactccgg cctcgcattc ggcgcgaaac ggtgggtcgg cacgctggac 5340

cggcaatgcg agcgcctcgc cagcgccatg gccagcaaca tccccaatgg cgaccttgga 5400

ggtacaagac gaatcaatca atcaattaac cactcctacg tcctactaat tgcaattata 5460

agaagtacag ataattgtga ccaatgaaat gccacattac aatcatgatt actgatgatt 5520

agtataattt gtgtatgaaa tgttatgtgt tgtggtgcag tgattacaag cgtggagggg 5580

aggaagagca tgttgaagct ggcggagagg atggtggcga gcttctgcgg cggcgtgacg 5640

gcgtcggtgg cgcaccagtg gacgacgctg tcgggcagcg gggcggagga cgtgcgcgtc 5700

atgacgagga agagcgtcga cgaccccggc aggccaccgg gcatcgtgct caacgccgcc 5760

acctccttct ggctccccgt ccctcccgcc gccgtcttcg acttcctccg cgacgagacc 5820

tctcgcagcg aggtgcccaa tttgcccccc atccctaggg aatttatcca atttgctgac 5880

caaattttat acgtgatcaa attcattcct gacgagtttg gatttccgca gtgggacatt 5940

ctgtccaacg gcggcgccgt ccaagaaatg gctcacattg ccaacggccg tgaccatggc 6000

aactctgtct cgcttcttcg tgtcaatgta agtgccaatt agttactact catcaaggca 6060

ataaatagca tgtaacggtc ggtagcgaat tagtgtctgg gtagcggatt gcaaatagca 6120

ggcactaagt tccaatagca taattaagaa aaataaccat aaatttagat tgtatatcaa 6180

tattaacatc aagtttcact taaagtttaa aatttagact gcatgtttaa ctactactac 6240

atttcataac ataaatatat aagataaaga aaacatacaa tgctaggtta ttctatccat 6300

atgtaaagaa cactatctaa acattatagc aattcaacaa agtcaatagc aggctgctat 6360

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