一种溶解糖屏障试纸条及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明属于各种病原体快速试纸检测领域，涉及一种溶解糖屏障试纸条 及其制备方法和使用方法。

背景技术

侧流层析试纸作为一种即时检测技术，已被广泛应用于疾病诊断、环境 监测和食品安全的检测领域。可以实现不同目标物的检测，如：早早孕试纸、 血糖试纸、HIV试纸、幽门螺旋杆菌试纸、亚硝酸盐检测试纸、重金属铅汞 检测试纸等。但是，侧流层析试纸的检测灵敏度低限制了其进一步发展。

至今，已有许多学者通过不同方法减慢流速提升侧流层析试纸的检测灵 敏度。例如：蜡屏障的方法、海绵方法、PDMS与纸混合方法、水凝胶与纸 混合法等。但是，这些方法只延长了已标记纳米金与目标物的反应时间，或 者是已标记纳米金与目标物结合后的复合物与捕获物的反应时间，它们只侧 重研究一个方面，没有全面的考虑同时延长两个方面的反应时间提升侧流层 析试纸检测灵敏度，使得检测灵敏度提高有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种溶解糖屏障试纸条及其制备方法和使用方法， 该方法解决了现有通过减慢流速增强试纸灵敏度方法中存在的只侧重研究一 个方面(已标记纳米金与目标物的反应时间，或者是已标记纳米金与目标物 结合后的复合物与捕获物的反应时间)的问题。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种溶解糖屏障试纸条，所述试纸条自一端至另一端依次包括吸水纸、 硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫，硝酸纤维素膜表面设置有质控线探针形成 的质控线和检测线探针形成的检测线，结合垫上设置有检测探针标记的纳米 金；质控线和检测线之间的硝酸纤维素膜表面上及检测线与结合垫之间的硝 酸纤维素膜表面上均设置有蔗糖屏障。

优选的，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫中的相邻两者之间部 分重叠。

进一步的，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫中的相邻两者之间 互相重叠2～4mm。

所述的溶解糖屏障试纸条的制备方法，包括：

S1：将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫依次连接制备得到空 白试纸条；

S2：在空白试纸条的硝酸纤维素膜上添加质控线探针和检测线探针， 分别得到质控线和检测线，在质控线和检测线之间的硝酸纤维素膜表面上及 检测线与结合垫之间的硝酸纤维素膜表面上分别添加蔗糖溶液，在结合垫上 添加检测探针标记的纳米金溶液，制备得到溶解糖屏障试纸条。

优选的，S1中，空白试纸条具体制备过程为：将吸水纸、硝酸纤维素 膜、结合垫、样品垫按顺序黏贴在背胶板上，得到空白试纸条。

所述的溶解糖屏障试纸条的使用方法，将待测样品添加在溶解糖屏障试 纸条的样品垫上，当待测样品从样品垫层析至吸水纸后，观察检测结果，质 控线和检测线均显色，说明是阳性结果；质控线显色、检测线不显色，说明 是阴性结果；质控线和检测线均不显色，说明溶解糖屏障试纸条失效。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明试纸条通过在结合垫与检测线和检测线与质控线之间分别设置溶 解性糖屏障，通过糖的再溶解过程，减慢待测液体流动的速度，增加检测过 程中目标物与已标记纳米金和目标物与纳米金结合复合物与捕获分子之间的 反应时间，实现延长反应时间的目的，增加了已修饰纳米金与待测液体和捕 获分子之间的反应数量，从而增强了试纸条检测灵敏度。

本发明在常规试纸条的基础上，添加了溶解性糖屏障，制备简单、快速、 保存稳定，适用于多种目标物的检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中常规试纸条和溶解糖屏障试纸条核酸样本灵敏 度检测结果示意图，A为常规试纸条核酸检测结果，B为溶解糖屏障试纸条 核酸检测结果。其中，试纸条1-11依次对应目标物浓度为100nM、50nM、 25nM、10nM、5nM、2.5nM、1nM、0.5nM、0.25nM、0.1nM及阴性样本。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明 的解释而不是限定。

本发明所述溶解糖屏障试纸条制备方法和使用方法，具体步骤如下：

步骤1：制备蔗糖溶液；

步骤2：制备空白试纸条；

步骤3：在步骤2制备的空白试纸条硝酸纤维素膜表面添加质控线探针、 检测线探针和检测探针标记的纳米金，制备常规试纸条；

步骤4：在步骤2制备的空白试纸条上分别添加蔗糖溶液、质控线探针、 检测线探针和检测探针标记的纳米金，制备具有溶解糖屏障的试纸条；

步骤5：检测步骤3和步骤4制作的常规试纸条和溶解糖屏障试纸条， 比较其灵敏度的差异。

步骤1的具体过程为：称取80g～100g蔗糖溶解在100ml的超纯水中配 制成蔗糖饱和溶液，将蔗糖饱和溶液稀释成质量浓度为10％～60％的蔗糖溶 液。

步骤2的具体过程为：将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫按顺 序粘贴在背胶板上(其中任意两者之间相互重叠2～4mm)，之后用切割机将 其切成3～5mm宽的空白试纸条。

步骤3的具体过程为：在步骤2制备的空白试纸条的硝酸纤维素膜表面 添加质控线探针和检测线探针及检测探针标记的纳米金，制备常规试纸条， 25～37℃放置2～4h，烘干，常温保存备用。

步骤4的具体过程为：在步骤2制备的空白试纸条的硝酸纤维素膜表面 位于结合垫与检测线之间和检测线与质控线之间的位置处分别添加0.5～2.5 μ.蔗糖溶液。之后，取5-10μ-修饰有检测探针的纳米金溶液添加在结合垫 上，取浓度为5μ浓度为测探针的的质控线探针和检测线探针各0.5-1.0检 测分别滴加于硝酸纤维素膜表面质控线和检测线处，制成溶解糖屏障试纸条， 25～37℃放置2～4h，烘干，常温保存备用。

步骤5的具体过程为：分别取步骤3和步骤4制备的常规试纸条和溶解 糖屏障试纸条，用移液器取60-90μ0不同浓度的阳性样本和阴性样本分别 添加在常规试纸条和溶解糖屏障试纸条的样品垫上，15～20min后，液体从 样品垫完全层析至吸水纸，观察检测结果，质控线和检测线均显色，说明是 阳性结果；质控线显色、检测线不显色说明是阴性结果；质控线和检测线均 不显色，说明试纸条失效；同时，比较相同样品浓度条件下常规试纸条和溶 解糖屏障试纸条检测线显色强弱情况，分析灵敏度增强情况。

实施例1：核酸检测

一种溶解糖屏障增强试纸检测灵敏度的方法，包括以下步骤：

步骤1，制备蔗糖溶液；

称取80g蔗糖溶解在100mL的超纯水溶液中配制成蔗糖饱和溶液，将 饱和溶液稀释成质量浓度为10％的蔗糖溶液，室温保存备用。

步骤2，制备空白试纸条；

将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫按顺序黏贴在背胶板上(其 中任意两者之间相互重叠2mm)，之后用切割机将其切成3mm宽的空白试 纸。

步骤3，在步骤2制备的空白试纸条硝酸纤维素膜表面添加质控线探针、 检测线探针和检测探针标记的纳米金，制备常规试纸条；质控线探针、检测 线探针、检测探针及目标物的核酸序列如表1所示。

取0.5μL浓度为25μM的质控线探针和检测线探针分别滴加在空白试纸 的硝酸纤维素膜表面的质控线和检测线处，取7μL已修饰有检测探针的纳 米金溶液滴加于空白试纸结合垫上，37℃烘干4h，室温保存备用。

表1核酸序列

步骤4，在步骤2制备的空白试纸条硝酸纤维素表面分别添加蔗糖溶液、 质控线探针、检测线探针和检测探针标记的纳米金溶液，制备具有溶解糖屏 障的试纸条；

取0.5μL浓度为25μM的质控线探针和检测线探针分别滴加在空白试纸 的硝酸纤维素膜表面的质控线和检测线处，取2.5μL10％的蔗糖溶液滴加于 空白试纸结合垫与检测线之间的硝酸纤维素膜表面，取1μL10％的蔗糖溶液 滴加于空白试纸检测线与质控线之间的硝酸纤维素膜表面，取7μL已修饰 有检测探针的纳米金溶液滴加于空白试纸结合垫上，37℃烘干4h，室温保 存备用。

步骤5，检测步骤3和步骤4制作的常规试纸条和溶解糖屏障试纸条， 比较其灵敏度的差异。

取制备好的常规试纸条和溶解糖屏障试纸条，将75μL不同浓度的样本 (100nM、50nM、25nM、10nM、5nM、2.5nM、1nM、0.5nM、0.25nM、 0.1nM和阴性样本)分别滴加在常规试纸条和溶解糖屏障试纸条的样品垫上。 检测15min中后，观察各试纸条质控线和检测线的显色结果，如图1所示。 常规试纸条检测结果如图A所示，其检测限为2.5nM；溶解糖屏障试纸条 检测结果如图B所示，其检测限为0.5nM，比常规试纸条提高了5倍。上述 结果表明，此方法提高了试纸检测灵敏度。

实施例2：核酸检测

一种溶解糖屏障增强试纸检测灵敏度的方法，包括以下步骤：

步骤1：制备蔗糖溶液；

称取80g蔗糖溶解在100mL的超纯水溶液中配制成蔗糖饱和溶液，将 饱和溶液稀释成质量浓度为10％的蔗糖溶液，室温保存备用。

步骤2：制备空白试纸条；

将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫按顺序粘贴在背胶板上(其 中任意两者之间相互重叠2mm)，之后用切割机将其切成3mm宽的空白试 纸条。

步骤3：在步骤2制备的空白试纸条硝酸纤维素膜表面添加质控线探针、 检测线探针和检测探针标记的纳米金，制备常规试纸条；质控线探针、检测 线探针、检测探针及目标物的核酸序列如表2所示。

取0.5μL浓度为25μM的对照探针和捕获探针分别滴加在空白试纸的硝 酸纤维素膜表面，取7μL已修饰有检测探针的纳米金溶液滴加于空白试纸 结合垫上，37℃烘干4h，室温保存备用。

表2核酸序列

步骤4：在步骤2制备的空白试纸条硝酸纤维素表面分别添加蔗糖溶液、 质控线探针、检测线探针和检测探针标记的纳米金，制备具有溶解糖屏障的 试纸条；

取0.5μL浓度为25μM的质控线探针和检测线探针分别滴加在空白试纸 的硝酸纤维素膜表面，取2.5μL10％的蔗糖溶液滴加于空白试纸结合垫与检 测线之间的硝酸纤维素膜表面，取1μL10％的蔗糖溶液滴加于空白试纸检测 线与质控线之间的硝酸纤维素膜表面，取7μL已修饰有检测探针的纳米金 溶液滴加于空白试纸结合垫上，37℃烘干4h，室温保存备用。

步骤5：检测步骤3和步骤4制作的常规试纸条和溶解糖屏障试纸条， 比较其灵敏度的差异。

取制备好的常规试纸条和溶解糖屏障试纸条，将75μL不同浓度的样本 (100nM、50nM、25nM、10nM、5nM、2.5nM、1nM、0.5nM、0.25nM、 0.1nM和阴性样本)分别滴加在常规试纸条和溶解糖屏障试纸条的样品垫上。 检测15min中后，观察试纸质控线和检测线的显色结果。常规试纸条检测 结果检测限为2.5nM；溶解糖屏障试纸条检测结果检测限为0.5nM，比常规 试纸条提高了5倍。上述结果表明，此方法提高了试纸检测灵敏度。