化血丹在杀螨杀虫方面的用途及其生物防治药剂与制备方法

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，涉及化血丹在杀螨杀虫方面的用途及其生物防治药剂与制备方法。

背景技术

在粮食储藏过程中，害虫害螨的危害是影响粮食安全最主要的因素。我国每年害虫害螨为害造成的粮食损失占储粮总量的4～6％，折合人民币约325亿元。除造成严重的经济损失外，害虫害螨为害会增加虫蚀粒，降低发芽率，甚至导致粮食发热、霉变，大大降低粮食的商品价值和食用价值。

目前，防治害虫害螨的方法主要包括物理机械防治法和化学防治法。物理机械防治，即利用害虫习性进行防治的习性防治法，是利用物理的方法杀死害虫害螨，或恶化害虫害螨的生活环境，抑制害虫害螨的发生和发展，或采用机械方法将害虫与粮食分开，防止或减轻害虫为害的一种方法。化学防治法就是利用杀虫剂防治储粮中的害虫和害螨的方法。化学防治法最大优点是杀虫效果迅速，彻底，杀虫谱广，处理费用低廉，可以在不移动粮食的情况下进行杀虫处理，省工省力，并且受气候等因素的影响较小。化学防治法的缺点是杀虫剂对人和高等动物都有毒性，会给粮食带来不同程度的污染，并且容易使害虫产生抗药性。即使如此，化学防治法仍是目前杀灭害虫的最经济有效的手段。

由于化学农药本身所具有的弱势和长期不合理的滥用，导致了害虫对化学农药产生抗性，并且在化学农药大量使用的过程中污染了环境，破坏了自然界生态平衡，危害了人体健康，严重影响了我们的生活。因此，植物源农药在环境保护日益重要的今天，受到了世界农药界的关注，并为环境友好型农药的发展提供了广阔的发展空间。植物源农药是从植物中提取出的具有农药活性的物质，活性物质可成为创新农药的有效母体，进一步开发研制为新的农药。植物源农药与化学农药相比，有效成分易被分解成失活物质，无法在害虫体内累积，因此不易对其它有益昆虫或者害虫天敌造成危害，对保护生态环境提供了帮助。

化血丹为菊科橐吾属植物牛蒡叶橐吾，拉丁名Ligularia lapathifolia，多年生草本。根肉质，多数，粗而长，直径约5毫米。茎直立，高达120厘米，上部连同花序被白色蛛丝状柔毛和有节短柔毛或老时脱毛，下面光滑，条棱明显，基部直径0.8-1.5厘米，被枯叶柄纤维包围。丛生叶和茎下部叶具柄，茎中上部叶向上渐小，无柄，鞘状抱茎，叶片卵状长圆形或卵状披针形。伞房状花序开展或近丛生；苞片和小苞片线状钻形，极小；头状花序辐射状，通常6-23，稀较多，舌状花黄色，舌片线状长圆形。瘦果长圆形，花果期7-10月。

目前本领域尚未出现化血丹可用于生物防治领域杀灭害虫的报道。

发明内容

根据本领域的上述需求和空白，本发明提供一种对人和动物安全无毒，对环境友好，且对害虫害螨有效的防治方法及药剂。

本发明要求保护的技术方案如下：

化血丹在杀螨杀虫方面的用途。

所述螨为害螨，所述虫为仓储害虫或农业害虫；

优选地，所述害螨为二斑叶螨；

优选地，所述仓储害虫选自嗜卷书虱；

优选地，所述农业害虫选自西花蓟马。

所述杀螨杀虫的方式为触杀或熏杀。

所述的化血丹在杀螨杀虫方面的用途，其特征在于，采用化血丹精油杀螨杀虫。

化血丹在制备生防药剂方面的用途。

一种生物防治药剂，其特征在于，其活性成分为化血丹精油。

所述生物防治药剂选自杀螨剂、和/或，杀虫剂、和/或，生物农药；

优选地，所述化血丹精油的杀螨杀虫活性成分1,8-桉叶素、(+)-诺蒎酮、柠檬烯、水芹醛。

一种生物防治药剂的制备方法，其特征在于，将化血丹进行水煮萃取而得。

所述水煮法处理8-12h得到油水混合物；

优选地，所述萃取指用正己烷对蒸馏得到的油水混合物进行萃取；

优选地，所述萃取的水浴温度为35-45℃，优选40℃；

优选地，所述蒸馏前将化血丹剪碎、浸泡；

优选地，所述将化血丹切碎浸泡后水煮8-12h，优选10h。

优选地，萃取所得的混合物经干燥后蒸发去除正己烷；

优选地，所述干燥指采用无水硫酸钠干燥；

优选地，所述蒸发指采用旋转蒸发器在40-45℃蒸发。

本发明请求保护化血丹在防治害虫害螨中的用途。

化血丹在制备防治害虫害螨的产品中的用途。

化血丹总挥发油在防治害虫害螨中的用途。

所述化血丹总挥发油以化血丹为原料，采用蒸馏法制备而得。

化血丹总挥发油在防治害虫害螨的药剂中的用途，其特征在于，所述药剂的药效成分为化血丹总挥发油。

所述化血丹总挥发油采用蒸馏法制备而得。

所述水煮法，包括水煮、萃取、脱水、溶剂蒸发步骤。

一种防治害虫害螨的药剂，其特征在于，所述药剂的药效成分为化血丹总挥发油。

一种防治害虫害螨的药剂，其特征在于，所述药剂的药效成分包括化血丹总挥发油。

一种防治害虫害螨的方法,其特征在于：

使化血丹材料中的气味物质散发到待防治储粮空间中、

使化血丹总挥发油在待防治储粮空间中挥发或熏蒸，

在可能出现害虫害螨的场所、粮食上或者储粮容器中喷洒化血丹总挥发油。

可以根据需要制备成各种形式的防治害虫害螨的产品，用于不同规模的害虫害螨的防治。

经进一步研究发现，以化血丹为原料提取的总挥发油防治害虫害螨的效果更好。本发明的研究表明，从化血丹中提取的总挥发油，对害虫害螨具有显著的触杀和熏蒸活性，能够预防和减轻害虫对储粮的危害。化血丹总挥发油作为天然的杀虫活性物质，在使用后其活性消失或被微生物分解，不污染粮食和环境，对人畜安全，可直接应用于害虫害螨的防治；由于化血丹总挥发油是从植物中提取出来的，其有效成分复杂多样，作用于靶标生物时其作用机理各不相同，这样就使得靶标生物很难对其中的各个成分产生抗药性，从而获得持久的防治效果；与化学农药相比，化血丹总挥发油的有效成分在杀灭害虫后易被分解，不会在害虫体内累积，因此不易对其它的有益昆虫或者害虫天敌造成危害，保护了生态环境。

在本发明的一些实施例中，所述化血丹总挥发油采用水煮法制备而得。

在本发明的一些实施例中，所述水煮法，包括水煮、萃取、脱水、溶剂蒸发步骤。

在本发明的一个实施例中，所述化血丹总挥发油通过以下制备方法制备而得：将8kg化血丹切碎后浸泡，充分浸泡后利用水煮法处理8-12h,得到的油水混合物用正己烷进行萃取，萃取所得物用无水硫酸钠脱水后，用旋转蒸发器在40-45℃的水浴锅中减压蒸发浓缩，回收正己烷，所得残留油状液即为化血丹总挥发油。制备方法简易，所需试剂成本低，有利于大量生产，便于大规模的害虫害螨防治。

在本发明的另一些实施例中，用于防治害虫害螨的药剂，其药效成分为化血丹总挥发油。

根据本领域技术人员的技术常识，本发明上述用于防治害虫害螨的药剂也可以加入一些本领域技术人员公知的具有杀灭害虫害螨活性的植物挥发油或其它种类的化学物质。

本发明一种防治害虫害螨的药剂，可用于储粮中嗜卷书虱的防治。室内毒力测定表明，化血丹总挥发油对嗜卷书虱具有显著的杀虫效果。由于化血丹总挥发油是从菊科植物牛蒡叶橐吾中提取出来的挥发油状成分的总和，其有效成分复杂，作用位点多，不易使嗜卷书虱产生抗药性，可以起到长期有效的防治效果。

本发明还提供一种防治害虫害螨的方法。其特征在于：使化血丹材料中的气味物质散发到待防治储粮空间中、使化血丹总挥发油在待防治储粮空间中挥发或熏蒸，和/或在可能出现害虫害螨的场所、粮食上或者储粮容器中喷洒化血丹总挥发油。可根据储粮空间的大小、害虫害螨的繁殖速度及储粮环境温度等实际因素，选用适合的由化血丹制成的防治害虫害螨的产品，采用合适的方法进行害虫害螨的防治。

综上所述，本发明一种防治害虫害螨的药剂，属于植物源杀虫剂，易分解，不污染环境，对人畜安全；其有效成分化血丹总挥发油，对害虫具有多种作用机理，不易使害虫产生抗药性，可长期使用；所述药剂灭虫后失去活性，不会积累在害虫体内，保护了生态环境；其制备方法简单易行，原料成本低，适合大规模生产，可广泛用于害虫害螨的防治。

化血丹总挥发油：本发明中也叫做“化血丹精油”，指采用化血丹为原材料，以本领域常用的用于植物总挥发油提取的常规手段提取到的挥发油混合物，其成分根据本领域技术人员采用的提取工艺的不同会有所差异。

本发明还请求保护化血丹在防治害虫害螨中的应用。

本发明提供了化血丹在防治害虫害螨中的用途，可以根据实际需要，使用多种形式的产品采用各种方法进行害虫害螨的防治。以下描述仅作为举例说明，不能作为对化血丹在防治害虫害螨中的用途的限制。本领域技术人员可根据本发明的技术方案和现有技术知识实施各种可能的应用。

以下举例说明化血丹在防治害虫害螨中的应用：

1、储粮未遭受害虫害螨危害时：可采用固体或半固体剂型的由化血丹制成的药剂，在储粮空间的四个角落和中部位置放置药剂(根据储粮空间的实际大小均匀放置药剂)，使化血丹材料中的气味物质缓慢地散发到待防治储粮空间中，对储粮进行持久的保护。

2、储粮已遭受害虫害螨危害时：可采用液体剂型的由化血丹制成的药剂，根据害虫危害的大小采用自然挥发、人为熏蒸或喷洒的方法，使化血丹总挥发油挥发到整个储粮空间中，迅速杀灭害虫害螨，将危害降至最低程度；待害虫害螨被完全杀灭后，再换成固体或半固体剂型的由化血丹制成的药剂，长期预防害虫的再次危害。

3、储粮环境温度低时：可采用液体剂型的由化血丹制成的药剂，采用自然挥发、人为熏蒸或喷洒的方法，使化血丹总挥发油挥发到储粮空间中，防治害虫害螨。

4、储粮环境温度高时：可采用固体或半固体剂型的由化血丹制成的药剂，均匀分布于储粮空间中，防治害虫害螨。

具体实施方式

下面参考具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅作为解释和说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。

嗜卷书虱：系中国农业大学昆虫系人工饲养，本实验室有保存，申请人声明自申请日起二十年内，可向公众发放用于必要的验证试验。

西花蓟马、二斑叶螨均为申请人实验室人工饲养，

化血丹：购自云药网

化血丹精油：本发明的方法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的浸提。

本发明制备化血丹精油的方法如实验例1。本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。

第1组实施例、化血丹的生物防治新用途

本组实施例提供化血丹在杀螨杀虫方面的用途。

在具体的实施例中，所述螨为害螨，所述虫为仓储害虫或农业害虫；

优选地，所述害螨为二斑叶螨；

优选地，所述仓储害虫选自嗜卷书虱；

优选地，所述农业害虫选自西花蓟马。

在一些实施例中，所述防治指杀灭；

在另一些实施例中，所述杀灭方式为触杀或熏杀。

在进一步的实施例中，采用化血丹精油杀螨杀虫。

第2组实施例、化血丹的生物防治制药用途

本组实施例提供化血丹在制备生物防治药剂方面的用途。

在具体的实施例中，所述生物防治药剂包括但不限于：杀虫剂，杀螨剂。

更具体地，所述生物防治药剂可制成本领域的常规剂型，包括但不限于：粉剂、可湿性粉剂、滴剂、胶悬剂、乳油、喷射剂、气雾剂、毒饵、蚊香、粘捕剂、烟剂、杀虫涂料等等。

第3组实施例、本发明的生物防治药剂

本组实施例提供一种生物防治药剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述生物防治药剂的活性成分为化血丹精油。

在具体的实施例中，所述生物防治药剂的剂型选自杀螨剂或杀虫剂、和/或，生物农药；

优选地，所述化血丹精油的活性成分包括：表1中的下述成分经鉴定为杀虫的活性成分：1,8-桉叶素、(+)-诺蒎酮、柠檬烯、水芹醛。

在进一步的实施例中，所述生物防治药剂还包括本领域常见的杀虫剂领域可接受的辅料，包括但不限于：乳化剂、有机溶剂、填料、湿润剂、稀释剂等。

第4组实施例、本发明生物防治药剂的制备方法

本组实施例提供一种生物防治药剂的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述制备方法包括：将化血丹进行蒸馏、萃取而得。

在具体的实施例中，所述指用水煮法蒸馏8-12h得到油水混合物；

优选地，所述萃取指用正己烷对蒸馏得到的油水混合物进行萃取；

优选地，所述萃取的水浴温度为35-45℃，优选40℃；

优选地，所述水煮前将化血丹切碎并浸泡，这样能尽可能的得到精油；

优选地，水煮处理10小时

优选地，萃取所得的混合物经干燥后蒸发去除正己烷；

优选地，所述干燥指采用无水硫酸钠干燥；

优选地，所述蒸发指采用旋转蒸发器在40-45℃蒸发。

实验例1、化血丹精油的制备方法

本发明中，提供一种化血丹精油的提取方法，但仅用于实现本发明目的的化血丹精油，不限于本方法的提取。

将8kg化血丹植物(云药网购买的干燥植物，未炮制)切碎后，用水煮法蒸馏8-12h，得到的油水混合物用正己烷进行萃取，萃取所得物用无水硫酸钠脱水后，用旋转蒸发器在40-45℃的水浴锅中减压蒸发浓缩，回收正己烷，所得残留油状液即为化血丹挥发油。

实验例2、化血丹精油的GC-MS检测

将实施例1制备的化血丹精油送北京师范大学气质检测中心进行检测。

采用Agilent6890N气相色谱仪和Agilent5973N质谱检测仪。

HP-5MS30mm×0.25mm×0.25μm石英毛细管柱，初始柱温60℃保持1分钟，以12℃/min的速率程序升温至180℃保持0.5分钟，再以25℃/min的速率程序升温至280℃保持18分钟，汽化器温度280℃，载气氦气，柱流量1.0mL/min，分流比1∶10。

质谱电离方式EI，电子轰击能量70eV，扫描质量范围20-550m/z，扫描时间2秒。

取化血丹植物精油1μL(500倍正己烷稀释液)进样，用气相色谱-质谱联用仪分析鉴定，通过HP-MSD化学工作站检索Nist05标准质谱图库，并结合有关文献，检测并鉴定到33个峰。鉴定结果如下表1所示。

表1.化血丹精油的化学成分

上表1中鉴定出来的全部成分的总百分比未到100％，是因为化血丹精油中仍存在未知成分，它们可能是新的化合物，无法利用现有的GC-MS检测方法鉴定出来。

实验例1、化血丹精油对嗜卷书虱的室内毒力测定

1、嗜卷书虱触杀活性测定

丙酮作溶剂，将药剂等比例稀释成5个浓度梯度，丙酮作为空白对照。准备直径为3.5cm的圆形滤纸，用移液枪吸取150ul的药液，均匀滴加在滤纸上，自然挥发2min后，将滤纸粘在内壁涂好聚四氟乙烯(防止试虫逃逸)的六孔培养板底部，用零号毛笔接入嗜卷书虱，每孔10头，每个浓度4个重复，每个重复10头试虫，置于人工培养箱(28～30℃，70～75％RH)中。24小时后，观察并记录试虫的死亡情况。

死亡率(％)＝100×死虫数/试虫数。

校正死亡率(％)＝100×(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)。

半致死剂量(LD50)即引起50％嗜卷书虱成虫死亡率的剂量，使用Probit软件包计算得到半致死剂量如表2所示。

2、嗜卷书虱熏蒸活性测定

丙酮作溶剂，将药剂等比例稀释成5个浓度梯度。10头试虫为一个重复处理，准备25ml容积的小安瓶，在瓶子的上半部分内壁涂聚四氟乙烯。用毛笔转移嗜卷书虱到小安瓶中，每瓶10头试虫，并将装有试虫的小瓶放入290ml广口瓶中。将滤纸条(1×8cm)粘在广口瓶瓶盖上，用移液枪吸取10ul药液，滴加在滤纸条上，迅速盖盖，封口膜密封。每个浓度4个重复，每个重复10头试虫，置于人工培养箱(28～30℃，70～75％RH)中。丙酮不加药剂作空白对照，敌敌畏为阳性对照。24小时后，观察并记录试虫的死亡情况。由于嗜卷书虱具有假死性，观察死亡情况时应将试虫倒在培养皿中，静置5min，虫体不动即为死亡。分别计算死亡率、校正死亡率和半致死剂量如下表5所示。

3、二斑叶螨触杀活性测定

采用叶碟法对二斑叶螨进行实验，具体操作如下：12孔细胞培养板，在培养板内壁涂聚四氟乙烯，用电吹风吹干；水和琼脂以100:1.5的比例在微波炉中加热混匀，倒入12孔细胞培养板中高度约0.5mm，冷却至凝固；取新鲜未施用农药的芸豆叶片，用直径19mm的打孔器将叶片打孔，制成圆形叶碟；取一定量化血丹精油加无水乙醇(量不超过药液体系的2％)溶解，加二甲基亚砜(不超过药液体系的1％)助溶，配制成母液，后用蒸馏水稀释至所需浓度并得到所述药液体系，共设置5组浓度。将叶碟浸入药剂10s后取出，晾干，将沾过药液的芸豆叶片背面朝上放在倒有琼脂的培养板上，每孔接入10只二斑叶螨成螨。用宣纸将培养板有孔的一面粘贴牢固并放进培养箱中，温度26-28℃，相对湿度为65％-75％，光周期L:D＝16:8；24h后在体视镜下观察记录死亡数量，用毛笔接触动者为活，不动者为死，计算LD

4、西花蓟马毒杀活性测定

取一定量化血丹精油加无水乙醇(量不超过药液体系的1％)溶解，加吐温80(不超过药液体系的0.5％)助溶，配制成母液，后用蒸馏水稀释至所需浓度并得到所述药液体系备用；将1mL药液放入容积为22mL玻璃安瓶中，均匀滚动数圈，形成药膜，将药液倒出，晾干备用。取新鲜未施用农药的扁豆，将扁豆制成1cm见方长段浸入药剂10s后取出，晾干，放置于安瓶中；每个处理设置5个重复，每个重复接入10头西花蓟马的二龄若虫，150目防虫网封瓶口；放置于室温下，24h后观察结果，以毛笔拨动虫体，虫体不动记为死亡。结果如表4所示。

表2、本发明的化血丹精油对嗜卷书虱的触杀致死试验数据

表2中半致死剂量LD50的含义是：在24小时内，药剂通过触杀的作用方式使嗜卷书虱达到半数死亡所需要的药剂量为嗜卷书虱所在平面的面积每平方厘米525.36ug。

表3、本发明的化血丹精油对二斑叶螨的致死试验数据

表4、本发明的化血丹精油对西花蓟马的致死试验数据

上表3-表4中的半致死剂量LC50的含义为：24小时内，每毫升药液体系(以酒精、二甲基亚砜、蒸馏水为溶剂)中含有的化血丹精油的毫克数，以这样的浓度处理，供试个体死亡率可以达到50％。

表5、本发明的化血丹精油对嗜卷书虱熏蒸的致死试验数据

表5中的半致死剂量LC50的含义为：24小时内，每升密闭的空间内含有的化血丹精油0.82mg时，嗜卷书虱的死亡率可以达到50％。

本领域公知，毒理学试验中，只需要5-6个有效浓度即可，且该浓度下，有昆虫个体死亡，100％和0％死亡率的浓度都不能算是有效浓度，因此本实验例分别基于表3-表5所列示的5个系列浓度(每个浓度分别设4-5个重复)测定出杀螨和杀虫的半致死剂量。