一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术应用领域，具体为一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，是一种多色荧光原位检测方法的应用。

背景技术

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带荧光的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Genemapping)，转基因检测，基因表达定位(localization of gene expression)，核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA)，复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics)，产前诊断(Prenatal diagnosis)，肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定(biologicaldosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进，新的技术不断涌现，相信在不久的将来，原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科，并不断为生命科学提供新的资料，开拓新的领域。

肿瘤疾病的发生、发展过程中，肿瘤细胞往往会出现染色体、基因等发现异常变化，包括基因变异、基因多拷贝、染色体非整倍性等。FISH(荧光原位杂交，Fluorescence insitu hybridization)能通过检测染色体和基因的异常变化，供某些肿瘤的预后或者诊断参考，例如实体瘤中的宫颈癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和膀胱癌等，以及血液肿瘤中的慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病等疾病。

FISH技术也有其局限性，首先它只能用特异的探针检测已知的染色体异常，其次一种探针往往只能检测出一种异常，对同时存在的多种异常需采用多个探针检测，成本势必增加。

目前的荧光原位杂交法，一张杂交片最多实现三种颜色荧光。在实际操作中，DAPI一般用来标记细胞核，因此对于普通荧光显微镜来说，一张杂交片只能同时实现红光和绿光两种检测，即一张杂交片检测两种不同的基因或者染色体。如果杂交更多的基因，则需要另外增加杂交片或者另外配备其他荧光色，增加了操作人员的工作量，同时也提高了检测成本。另外，现有的荧光原位杂交法，通常是一张杂交片子只能检测一种目的基因，如果同时需要检测多种基因，也可选择进行多轮杂交。多轮杂交在同一张杂交片前一次杂交、检测结束后，需要进行清洗后再杂交、检测，如此循环实现检测多种基因的目的。目前，多轮杂交的过程中普遍存在清洗不彻底的情况，对后续检测带来干扰，影响检测结果的准确性，同时多轮杂交的时间周期很长，大大减低了基因检测的效率。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法。本发明的原位杂交法提高了检测的准确率，并且大大的增加了检测位点的数目，只需要一轮杂交。就可以同时对至少五种基因位点进行检测，大大的增加检测的效率，使操作更加的简便快捷，扩大了应用范围。

本发明的技术方案如下：

一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，包括步骤：

S1、制备杂交探针：合成引物片段，并对所述探针进行荧光标记；

S2、杂交：制备杂交片，将所制得的杂交片与S1中经过荧光标记的杂交探针进行杂交反应；

S3、成像，获取标记信息；

所述S1中的荧光标记包括组合色荧光标记。

进一步的，所述S1的杂交探针制备操作包括：

S11、对合成片段进行PCR扩增，回收扩增产物；

S12、将S11回收的扩增产物进行体外转录，收集转录片段；

S13、将S12的转录片段分别进行反转录，反转录体系中包括带有荧光修饰的dUTP，回收反转录产物。

进一步的，所述S11中的扩增体系为：

buffer：20μl；

引物片段混合液(5ng/μl)：1μl；

dNTP-mix(10mM)：1μl；

扩增引物MIX(10μM/μl)：4μl；

扩增酶：1μl；

ddH

进一步的，所述S11中的扩增程序为：95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；扩增19个循环。

进一步的，所述S13中的反转录体系为：

5x逆转录buffer：5μl；

dNTP mix：2.8μl；

带有荧光修饰的dUTP(1mM)：2μl；

反转录引物(20μM)：1μl；

逆转录酶混合液：2μl；

RNA：8.2μl。

进一步的，所述S13中的反转录程序为：25℃，5min；37℃，45min；85℃，5min。

进一步的，所述S13中操作还包括单链DNA杂交探针的纯化：反转结束后，向反转体系中加入20μl的0.25M EDTA 0.5M NaOH buffer，95℃反应10min。

进一步的，所述带有荧光修饰的dUTP为用至少两种基本颜色的荧光修饰剂对dUTP分别进行组合修饰得到的带有荧光修饰的dUTP。

进一步的，所选基本颜色数量为n，N1为单色可修饰的dUTP数量(即单色编码基因数量)，N2为双色可修饰的dUTP的数量(即双色编码基因数量)，N3为三色可修饰的dUTP数量(即三色编码基因数量)，以此类推，N(n-1)为(n-1)色可修饰的dUTP数量(即(n-1)色编码基因数量)，Nn为n色可修饰的dUTP数量(即n色编码基因数量)。N为n个基本颜色所能修饰的dUTP的总数(即编码的基因总数量)；N

需要说明的是，理论上来说，本发明的方法中，基本颜色数量n可以是任意数量，但由于目前荧光修饰dUTP原材料的限制，常用的荧光修饰dUTP原材料只有6种，故目前此处n的最大值可以为6。

本发明的原位杂交法中所述带有荧光修饰的dUTP的数量对应着本发明得原位杂交法所能检测得基因位点数量，即本发明的原位杂交法所能检测的基因数等于N，其中N为N1与N2至Nn中至少一个值的和；N的最大值N

进一步的，所述步骤S2中制备杂交片包括：

S21、制备待检细胞的杂交片；

S22、将杂交片于荧光探针进行杂交反应。

进一步的，所述S21包括：收集待检细胞样本，清洗；低渗悬浮；固定液固定；涂片，干燥；煮片；酒精洗涤。

优选的，所述低渗悬浮采用KCl(5.5g/L)作悬浮液，37℃温浴30min。

优选的，所述固定液固定操作包括：向细胞中加入甲醇/乙酸固定液，吹打均匀，离心，去上清；再重复操作次；第三次加入甲醇/乙酸固定液，吹打均匀，室温固定10min。

优选的，所述煮片操作包括：将干燥后的玻片、置于2xSSC溶液中，65℃水浴煮玻片30min。

优选的，所述酒精洗涤操作包括：70％-85％-100％酒精梯度洗涤玻片。

进一步的，所述S22的具体操作包括：将晾干后的玻片，加入含荧光探针的杂交液，封片(全封)，80℃变性5min；将片子放入湿盒中，37℃过夜。

优选的，所述杂交液中，所述荧光探针液的体积占比为10％；即9μl杂交液加1μl荧光探针。

进一步的，所述步骤S2中制备杂交片还包括：

S23、染色、封片：杂交结束后，去掉封片胶和盖玻片(去盖玻片时泡下水，防止干燥取玻片时磨损细胞)，再置于预热的0.3％NP40/0.4xSSC，65℃浸泡4min；用ddH2O中过一遍后，放进加10μl DAPI的水溶液中，染色1min；再用100％酒精过一遍后，放擦镜纸上晾干；加一滴封片剂，封片，镜检。

进一步的，所述步骤S3的成像操作包括：用荧光显微镜对所S2杂交后的杂交片拍照，分别拍摄红色(564nm激发)，绿色(488nm激发)，品红(594nm激发)，蓝色(425nm激发)通道图片，然后进行图像合并，得到检测基因或染色体信息。

本发明的有益效果：

目前荧光原位杂交最多检测是三种荧光色，即红，绿，天蓝，其中检测天蓝色荧光时，一般的荧光显微镜不能分辨，必须配备相应的滤光片，增加了检测成本，应用场景比较受限。通过组合色原位杂交的方法，采用组合色的方式，对同一基因位点，用多种颜色的荧光进行标记，多种颜色同时验证一个基因或者一条染色体，实现了一张片子上进行一次杂交，就能同时检测多个基因或多条染色体的目的，具体可以根据已有的荧光显微镜决定检测基因或染色体的数量。比如普通显微镜有红光，绿光和蓝光通道，一般杂交检测时，细胞核用DAPI染色，观察呈蓝光；因此普通显微镜只能检测两种不同的基因或染色体，分别通过红光和绿光区分。通过我们的方法制备探针，成像，可以同时检测三种基因或染色体，大大提高了检测效率，不需要额外再制备杂交片或者增加荧光通道，降低了检测成本，使操作更加便捷。且本身已有四种通道的荧光显微镜，实际操作过程中，可以同时在一张片子上检测六种不同的基因或染色体。

为了更好地理解和实施，下面结合实例详细说明本发明。

附图说明

图1是以4个基本颜色为例(n＝4)时，单色标记和双色标记的原理图。其中n为基本颜色数。Ns(即N1)为单色标记基因数，Nd(即N2)为双色标记基因数，N为标记基因总数。

图2是以4个基本颜色为例(n＝4)时，运用本发明的方法进行标记的原理图和能检测的最大基因总数。

图3为THP-1细胞的多色荧光杂交结果图；其中位点及标记色为：MYC：CY3+Alex594；HER2：Alex488+CY3；TOP2A：CY3；TERC：Alex594；CCND1：Alex488。

具体实施方式

以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。

在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

本申请实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本申请实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

本发明的一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，包括步骤：

S1、制备杂交探针：合成引物片段，并对所述探针进行荧光标记；

S2、杂交：制备杂交片，将所制得的杂交片与S1中经过荧光标记的杂交探针进行杂交反应；

S3、成像，获取标记信息；

所述S1中的荧光标记包括组合色荧光标记。

在一些实施例中，所述S1的杂交探针制备操作包括：

S11、对合成片段进行PCR扩增，回收扩增产物；

S12、将S11回收的扩增产物进行体外转录，收集转录片段；

S13、将S12的转录片段分别进行反转录，反转录体系中包括带有荧光修饰的dUTP，回收反转录产物。

在一些实施例中，所述S11中的扩增体系为：

buffer：20μl；

合成片段混合液(5ng/μl)：1μl；

dNTP-mix(10mM)：1μl；

扩增引物MIX(10μM/μl)：4μl；

扩增酶：1μl；

ddH

所述扩增引物为针对合成片段的扩增引物，采用现有技术手段进行设计即可。

在一些实施例中，所述S11中的扩增程序为：95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；扩增19个循环。

在一些实施例中，所述S13中的反转录体系为：

5x逆转录buffer：5μl；

dNTP mix：2.8μl；

带有荧光修饰的dUTP(1mM)：2μl；

反转录引物(20μM)：1μl；

逆转录酶混合液：2μl；

RNA：8.2μl。

在一些实施例中，所述S13中的反转录程序为：25℃，5min；37℃，45min；85℃，5min。

在一些实施例中，所述S13中操作还包括单链DNA杂交探针的纯化：反转结束后，向反转体系中加入20μl的0.25M EDTA 0.5M NaOH buffer，95℃反应10min。

在一些实施例中，所述带有荧光修饰的dUTP为用至少两种基本颜色的荧光修饰剂对dUTP分别进行组合修饰得到的带有荧光修饰的dUTP。

在一些实施例中，所选基本颜色数量为n，N1为单色修饰的dUTP数量(即单色编码基因数量)，N2为双色修饰的dUTP数量(即双色编码基因数量)，N3为三色修饰的dUTP数量(即三色编码基因数量)，以此类推，N(n-1)为(n-1)色修饰的dUTP数量(即(n-1)色编码基因数量)，Nn为n色修饰的dUTP数量(即n色编码基因数量)。N为n个基本颜色所能修饰的dUTP总数(即编码的基因总数量)；N

参阅图1，以4个基本颜色为例(n＝4)，其单色标记和双色标记的基因数为：

参阅图2，以4个基本颜色为例(n＝4)，运用本发明的方法能检测的基因总数为：

在一些实施例中，所述步骤S2中制备杂交片包括：

S21、制备待检细胞的杂交片；

S22、将杂交片于荧光探针进行杂交反应。

在一些实施例中，所述S21包括：收集待检细胞样本，清洗；低渗悬浮；固定液固定；涂片，干燥；煮片；酒精洗涤。

在一些实施例中，所述低渗悬浮采用KCl作悬浮液，37℃温浴30min。

在一些实施例中，所述固定液固定操作包括：向细胞中加入甲醇/乙酸固定液，吹打均匀，离心，去上清；再重复操作次；第三次加入甲醇/乙酸固定液，吹打均匀，室温固定10min。

在一些实施例中，所述煮片操作包括：将干燥后的玻片、置于2xSSC溶液中，65℃水浴煮玻片30min。

在一些实施例中，所述酒精洗涤操作包括：70％-85％-100％酒精梯度洗涤玻片。

在一些实施例中，所述S22的具体操作包括：将晾干后的玻片，加入含荧光探针的杂交液，封片(全封)，80℃变性5min；将片子放入湿盒中，37℃过夜。

在一些实施例中，所述杂交液与所述荧光探针液的体积比为：10:1，即9μl杂交液加1μl荧光探针。

在一些实施例中，所述步骤S2中制备杂交片还包括：

S23、染色、封片：杂交结束后，去掉封片胶和盖玻片(去盖玻片时泡下水，防止干燥取玻片时磨损细胞)，再置于预热的0.3％NP40/0.4xSSC，65℃浸泡4min；用ddH2O中过一遍后，放进加10μl DAPI的水溶液中，染色1min；再用100％酒精过一遍后，放擦镜纸上晾干；加一滴封片剂，封片，镜检。

在一些实施例中，所述步骤S3的成像操作包括：用荧光显微镜对所S2杂交后的杂交片拍照，分别拍摄红色(564nm激发)，绿色(488nm激发)，品红(594nm激发)，蓝色(425nm激发)通道图片，然后进行图像合并，得到检测基因或染色体信息。

实施例一本发明的通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法本发明的通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，包括步骤：

S1：制备杂交探针。

S11、在南京金斯瑞、上海生工、美国Integrated DNA Technologies(IDT)等公司合成短序列引物，对合成单链引物进行PCR扩增，回收扩增产物；扩增体系为：

PCR反应buffer(北京庄盟公司)：20μl；

合成片段混合液(5ng/μl)：1μl；

dNTP-mix(10mM)：1μl；

扩增引物MIX(10μM/μl)：4μl；

Taq扩增酶(北京庄盟公司)：1μl；

ddH

扩增程序为：95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；扩增19个循环。

S12、将S11回收的扩增产物进行体外转录，收集转录片段。

S13、将S12的转录片段进行反转录，反转录体系中包括带有荧光修饰的dUTP；反转结束后，向反转体系中加入20μl的0.25M EDTA 0.5M NaOH buffer，95℃反应10min；再用试剂盒回收反转录产物。

反转录体系为：

5x逆转录buffer(南京诺唯赞公司)：5μl；

dNTP mix：2.8μl；

带有荧光修饰的dUTP(1mM)(美国Thermo公司)：2μl；

反转录引物(20μM)：1μl；

逆转录酶混合液(南京诺唯赞公司)：2μl；

RNA：8.2μl。

反转录程序为：25℃，5min；37℃，45min；85℃，5min。

所述S13中，采用CY3(红色)，Alex488(绿色)，Alex594(品红)这三种颜色荧光修饰的dUTP，对五个癌基因位点进行标记，具体为：

位点1：MYC扩增检测探针为红色荧光(CY3)与品红荧光(Alex594)双标记；

位点2：HER2扩增检测探针为红色荧光(CY3)与绿色荧光(Alex488)双标记；

位点3：TOP2A扩增检测探针为红色荧光(CY3)单标记；

位点4：TERC扩增检测探针为品红荧光(Alex594)单标记；

位点5：CCND1扩增检测探针为绿色荧光(Alex488)单标记。

使用本发明方法制备的探针稳定，可以应用于各种原位杂交制备玻片。如石蜡切片，细胞滴片等。

S2、杂交：制备杂交片，将所制得的杂交片与S1中经过荧光标记的杂交探针进行杂交反应。

S21、制备待检细胞的杂交片；

本发明的荧光原位杂交使用石蜡切片或者细胞滴片均可进行实验，本实施例采用人类白血病THP-1细胞系为杂交细胞。

具体操作包括：

1)收集THP-1细胞，用PBS清洗细胞一次；

2)离心去上清，用5ml的低渗KCL悬浮细胞，37℃温浴30min；

3)加入1ml甲醇/乙酸固定液，吹打均匀，离心，去上清；

4)加入1ml甲醇/乙酸固定液，吹打均匀，离心，去上清；

5)加入1ml甲醇/乙酸固定液，吹打均匀，室温固定10min；

6)取10μl固定细胞悬液滴到玻片上，烘箱中干燥20min；

7)在2xSSC溶液中，65℃水浴煮玻片30min；

8)70％-85％-100％酒精梯度洗涤玻片；

9)酒精晾干后，加入杂交液(9μl杂交液加1μl荧光探针)，封片(全封)，

80℃变性5min；

10)将片子放入湿盒中，37℃杂交过夜；

11)杂交结束后，去掉封片胶和玻片(去盖玻片时泡下水，防止干燥取玻片时磨损细胞)，预热的0.3％NP40/0.4xSSC，65℃浸泡4min；

12)ddH2O中过一遍后，放进加10μl DAPI的水溶液中，染色1min；

13)100％酒精过一遍后，放擦镜纸上晾干；

14)加一滴封片剂，封片，镜检。

S3、成像，获取标记信息。

用荧光显微镜对所S2杂交后的杂交片拍照，分别拍摄红色(564nm激发)，绿色(488nm激发)，品红(594nm激发)，蓝色(425nm激发)通道图片，此处蓝色通道是细胞核染料DAPI的通道；然后进行图像merge，得到检测基因或染色体信息，参见图3。

结果分析

如图3所示，在THP-1白血病细胞系中，TOP2A，CCND1，以及TERC位点都只有两个信号点，说明这三种癌基因结构正常，没有发生染色体结构变异，而MYC和HER2位点，存在3个信号点，说明在THP-1细胞中，存在有MYC和HER2基因的断裂或者染色体易位。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。