用于调节载脂蛋白(a)表达的组合物和方法

本申请是2014年5月1日提交的、发明名称为“用于调节载脂蛋白(a)表达的组合物和方法”的PCT申请PCT/US2014/036460的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2015年12月22日，申请号为201480035625.X。

序列表

本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表提供为在2014年5月1日创建的名称为BIOL0250WOSEQ_ST25.txt的文件，所述文件的大小为432Kb。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于调节载脂蛋白(a)表达的组合物和方法。具体而言，本发明提供了靶向载脂蛋白(a)[apo(a)]的具有缀合物基团的低聚化合物，以及使用所述化合物治疗疾病的方法。

背景技术

反义技术背后的原理是反义化合物与靶核酸杂交并且调节靶核酸的量、活性和/或功能。例如在某些情况下，反义化合物导致靶标的转录或翻译改变。可通过例如靶mRNA降解或占位型(occupancy-based)抑制来实现表达的所述调节。通过降解实现的RNA靶功能的调节的实例为在与DNA样反义化合物杂交时靶RNA的基于RNA酶H的降解。通过靶标降解实现的基因表达的调节的另一个实例为RNA干扰(RNAi)。RNAi是指通过利用RNA诱导的沉默复合物(RISC)的机制实现的反义介导的基因沉默。RNA靶功能的调节的另一个实例为通过占位型机制，如微小RNA天然采用的机制。微小RNA为调节蛋白质编码RNA的表达的小型非编码RNA。反义化合物与微小RNA的结合防止微小RNA与其信使RNA靶标结合，因此干扰微小RNA的功能。微小RNA模拟物可增强天然微小RNA功能。某些反义化合物改变前体mRNA(pre-mRNA)的剪接。不管具体机制是什么，序列特异性均使反义化合物具有作为用于靶标验证和基因功能化的工具以及用以选择性调节涉及疾病发病机理的基因的表达的治疗剂的吸引力。

反义技术是用于调节一种或多种特定基因产物的表达的有效手段并且可因此证明在许多治疗、诊断和研究应用中是特别有用的。可将化学修饰的核苷掺入反义化合物中，以增强一种或多种性质，如核酸酶抗性、药物代谢动力学或对靶核酸的亲合力。在1998年，反义化合物

新的化学修饰改进了反义化合物的效力和效能，揭示了经口递送的可能性并且增强了皮下施用、减少了副作用的可能性并在患者方便性上产生改进。增加反义化合物的效力的化学修饰允许施用较低剂量，所述较低剂量减小了毒性的可能性并且降低治疗的总成本。增加降解抗性的修饰使从体内清除较慢，从而允许较不频繁的给药。不同类型的化学修饰可组合在一种化合物中以进一步优化化合物的效能。

脂蛋白为球状、胶束状颗粒，其由被蛋白质、磷脂和胆固醇的两亲性涂层所包围的酰基甘油和胆固醇酯的非极性核心组成。脂蛋白基于其功能和物理特性被分为五个大类：乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒将膳食脂质从肠运输到组织。VLDL、IDL和LDL均是将三酰基甘油和胆固醇从肝脏运输到组织。HDL将内源性胆固醇从组织运输到肝脏。

脂蛋白颗粒经历连续的代谢加工并且具有变化的特性和组成。脂蛋白密度增加而颗粒直径不增加，因为其外涂层的密度小于内涂层的密度。脂蛋白的蛋白组分被称为载脂蛋白。至少九种载脂蛋白以显著量分布于各种人类脂蛋白当中。

脂蛋白(a)[Lp(a)]颗粒在将近50年以前得到鉴别并且包含高独特性的LDL颗粒，其中一个载脂蛋白B(apoB)蛋白经由二硫键连接至单个载脂蛋白(a)[apo(a)]蛋白。apo(a)蛋白与纤维蛋白溶酶原具有高度的同源性，特别是在kringle IV 2型重复结构域内。循环Lp(a)水平与分子中存在的kringle IV 2型可变重复的数目成反比，并且因为两个等位基因在个体内共表达，可显示杂合的血浆同工型分布(Kraft等，Eur J Hum Genet，1996；4(2)：74-87)。据认为apo(a)中的这种kringle重复结构域可负责其促血栓形成和抗蛋白纤维溶解特性，从而潜在地加快动脉粥样硬化进展。

Apo(a)由IL-6转录调控并且在用IL-6抑制剂(托珠单抗)治疗的类风湿性关节炎患者的研究中，治疗3个月后血浆水平降低30％(Schultz等，PLoS One 2010；5：e14328)。

已显示Apo(a)优先结合氧化的磷脂并且促成血管炎症(Bergmark等，J Lipid Res2008；49：2230-2239；Tsimikas等，Circulation.2009；119(13)：1711-1719)。

此外，研究表明Lp(a)颗粒也可刺激内皮通透性、诱导纤溶酶原激活物抑制剂1型表达并且激活巨噬细胞白细胞介素-8分泌(Koschinsky和Marcovina，Curr Opin Lipidol2004；15：167-174)。重要的是，新近的遗传关联研究表明Lp(a)是心肌梗塞、中风、外周血管疾病和腹主动脉瘤的独立风险因子(Rifai等，Clin Chem 2004；50：1364-71；Erqou等，JAMA2009；302：412-23；Kamstrup等，Circulation 2008；117：176-84)。此外，在新近的早熟性冠状动脉疾病(PROCARDIS)研究中，Clarke等(Clarke等，NEJM(2009)361；2518-2528)描述了冠心病和血浆Lp(a)浓度之间的稳健且独立的关联。另外，Solfrizzi等提出，增加的血清Lp(a)可能与阿兹海默氏病(AD)的风险增加有关联(Solfrizzi等，J Neurol NeurosurgPsychiatry 2002，72：732-736。当前，在临床环境中，用于治疗心血管疾病的间接apo(a)抑制剂的实例包括阿司匹林、Niaspan、Mipomersen、Anacetrapib、Epirotirome和Lomitapide，它们分别将血浆Lp(a)水平降低18％、39％、32％、36％、43％和17％。另外，Lp(a)血浆分离置换法已经在临床上被使用来降低含有apo(a)的Lp(a)颗粒。

至今，通过直接靶向apo(a)水平治疗心血管疾病的治疗策略仍然有限。已经开发出核酶寡核苷酸(美国专利5,877,022)和反义寡核苷酸(WO 2005/000201；WO 2003/014397；WO2013/177468；US20040242516；美国专利号8,138,328、8,673,632和7,259,150；Merki等，JAm Coil Cardiol 2011；57：1611-1621；每个公开案整体以引用的方式并入)，但无一被批准用于商业用途。

因此，仍然对新颖药剂存在明显未满足的医学需求，所述药剂可强烈地且选择性地降低患者中由于长期升高的血浆Lp(a)水平而引起的处于增强的心血管事件风险下的apo(a)水平。

发明内容

本文提供用于调节apo(a)mRNA和蛋白质表达的组合物和方法。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂降低apo(a)mRNA和蛋白质的表达。本文提供用于调节Lp(a)水平的表达的组合物和方法。

在某些实施方案中，组合物是apo(a)特异性抑制剂。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂是核酸、蛋白质或小分子。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂是具有缀合物的靶向apo(a)的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂是修饰寡核苷酸和缀合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO：1的核碱基3901至3920的等长度部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1至少80％互补。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂是修饰寡核苷酸和缀合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：1-130、133、134的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂是修饰寡核苷酸和缀合物，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：58中的任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸包含：(a)由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由五个连接核苷组成的5’翼区段；(c)由五个连接核苷组成的3’翼区段，并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

某些实施方案提供组合物，其包含本文所述的缀合反义化合物或其盐，和药学上可接受的载体或稀释剂。

在某些实施方案中，apo(a)表达的调节发生在细胞或组织中。在某些实施方案中，调节发生在动物的细胞或组织中。在某些实施方案中，动物为人。在某些实施方案中，调节是apo(a)mRNA水平的降低。在某些实施方案中，调节是apo(a)蛋白水平的降低。在某些实施方案中，apo(a)mRNA和蛋白质都被降低。在某些实施方案中，调节是Lp(a)水平的降低。所述降低可以时间相关性或剂量相关性方式进行。

某些实施方案提供用于疗法中的缀合反义组合物和方法。某些实施方案提供用于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善apo(a)相关疾病、病症和病状的组合物和方法。某些实施方案提供用于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善Lp(a)相关疾病、病症和病状的组合物和方法。在某些实施方案中，所述疾病、病症和病状为炎性、心血管和/或代谢疾病、病症和病状。在某些实施方案中，用于疗法的组合物和方法包括向有此需要的个体施用apo(a)特异性抑制剂。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂为核酸。在某些实施方案中，核酸为反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物为修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，反义化合物为具有缀合物的修饰寡核苷酸。

在某些实施方案中，本公开提供缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触的方法。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触并且降低细胞中核酸转录物的量或活性的方法。

去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)先前已有描述。参见例如，Park等，PNAS第102卷，第47期，第17125-17129页(2005)。所述受体在肝脏细胞尤其是肝细胞上表达。此外，已显示，包含三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)配体的聚簇的化合物能够结合ASGP-R，从而导致化合物被摄取到细胞中。参见例如，Khorev等，Bioorganic and Medicinal Chemistry，16，9，第5216-5231页(2008年5月)。因此，包含所述GalNAc聚簇的缀合物已用来促进将某些化合物摄取到肝脏细胞(确切地是肝细胞)中。例如，已显示，某些含有GalNAc的缀合物在体内增加双链siRNA化合物在肝脏细胞中的活性。在所述情况下，含有GalNAc的缀合物通常连接至siRNA双链体的有义链。因为在反义链最终与靶核酸杂交之前丢弃有义链，所以存在很少关于缀合物将干扰活性的问题。通常，缀合物连接至siRNA的有义链的3’末端。参见例如，美国专利8,106,022。本文描述的某些缀合物基团比先前描述的缀合物基团更有活性和/或更易于合成。

在本发明的某些实施方案中，缀合物连接至单链反义化合物，包括但不限于基于RNA酶H的反义化合物和改变前体mRNA靶核酸的剪接的反义化合物。在所述实施方案中，缀合物应该保持连接至反义化合物足以提供益处(摄取到细胞中的改进)的时间，但是随后应裂解或以其它方式不干扰对于活性所必需的后续步骤，如与靶核酸杂交以及与RNA酶H或与和剪接或剪接调节相关的酶相互作用。这种性质平衡在单链反义化合物的环境中比在其中缀合物可简单连接至有义链的siRNA化合物中更为重要。本文公开了与缺乏缀合物的相同反义化合物相比在体内在肝脏细胞中具有改进效力的缀合的单链反义化合物。已知这些化合物所需的性质平衡如改进的效力是令人惊奇的。

在某些实施方案中，本文的缀合物基团包含可裂解部分。如所指出的，不希望受机制的束缚，合乎逻辑的是，缀合物应在化合物上保持足以提供摄取增强的时间，但其后，希望缀合物的一些部分或理想的是缀合物的全部均裂解，从而释放呈其最具活性形式的母体化合物(例如，反义化合物)。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷。所述实施方案通过经由一个或多个可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)通过核苷使缀合物的其余部分(聚簇)连接至反义寡核苷酸来利用细胞中的内源性核酸酶。在某些实施方案中，聚簇通过磷酸二酯键联与可裂解核苷结合。在某些实施方案中，可裂解核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸(反义化合物)。在某些实施方案中，缀合物基团可包含两个或三个可裂解核苷。在所述实施方案中，所述可裂解核苷通过可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)彼此连接，连接至反义化合物和/或连接至聚簇。本文的某些缀合物不包含可裂解核苷而是包含可裂解键。显示了通过至少一个在细胞中易受裂解的键(可裂解键)来提供缀合物自寡核苷酸的充分裂解。

在某些实施方案中，缀合反义化合物为前药。向动物施用所述前药并且其最终代谢为更具活性的形式。例如，使缀合反义化合物裂解以去除缀合物的全部或部分，从而产生缺乏缀合物的全部或一些的反义化合物的活性(或更具活性)形式。

在某些实施方案中，缀合物连接在寡核苷酸的5’末端。某些所述5’-缀合物比具有连接在3’末端的类似缀合物基团的对应物更有效地裂解。在某些实施方案中，改进的活性可与改进的裂解相关。在某些实施方案中，在5’末端包含缀合物的寡核苷酸比在3’末端包含缀合物的寡核苷酸具有更大的效能(参见，例如，实施例56、81、83和84)。此外，5’-连接允许更简单的寡核苷酸合成。通常，在固体载体上在3’至5’方向上合成寡核苷酸。为了制得3’-缀合寡核苷酸，通常将预先缀合的3’核苷连接至固体载体，然后按常规构造寡核苷酸。然而，将所述缀合核苷连接至固体载体增加了合成的复杂性。此外，使用所述方法，缀合物则存在于寡核苷酸的整个合成中并且在后续步骤期间可能发生降解或可能限制可使用的反应和试剂的种类。使用本文针对5’-缀合寡核苷酸所述的结构和技术，可使用标准自动化技术合成寡核苷酸并且与最后(最5’)的核苷一起或在寡核苷酸从固体载体上裂解之后引入缀合物。

鉴于现有技术和本公开，普通技术人员可简单制得本文的任何缀合物和缀合寡核苷酸。此外，本文公开的某些所述缀合物和缀合寡核苷酸的合成更简单和/或需要更少步骤，并且因此比先前公开的缀合物的合成更低廉，从而在制造上提供优点。例如，某些缀合物基团的合成由较少合成步骤组成，从而导致相对先前所述的缀合物基团产率增加。缀合物基团如实施例46中的GalNAc3-10和实施例48中的GalNAc3-7比先前描述的缀合物简单得更多，所述先前描述的缀合物如需要装配更多化学中间体的U.S.8,106,022或U.S.7,262,177中所述的那些。因此，本文描述的这些和其它缀合物在与任何寡核苷酸一起使用方面优于先前描述的化合物，所述寡核苷酸包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。

类似地，本文公开了仅具有一个或两个GalNAc配体的缀合物基团。如所示出的，所述缀合物基团改进了反义化合物的活性。所述化合物比包含三个GalNAc配体的缀合物更易于制备。包含一个或两个GalNAc配体的缀合物基团可连接至任何反义化合物，包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。

在某些实施方案中，本文的缀合物大致上不改变耐受性的某些量度。例如，本文显示缀合反义化合物不比未缀合的母体化合物更具有免疫原性。因为效力得到改进，所以其中耐受性保持相同(或甚至与效力增益相比耐受性实际上仅略微变差)的实施方案对于治疗具有改进的性质。

在某些实施方案中，缀合允许人们以在不存在缀合的情况下具有较不吸引人的结果的方式改变反义化合物。例如，在某些实施方案中，用磷酸二酯键联替代完全的硫代磷酸酯反义化合物的一个或多个硫代磷酸酯键联造成耐受性的一些量度的改进。例如，在某些情况下，具有一个或多个磷酸二酯的所述反义化合物比其中每个键联为硫代磷酸酯的相同化合物具有更小的免疫原性。然而，在某些情况下，如实施例26中所示，用磷酸二酯键联同样替代一个或多个硫代磷酸酯键联还造成细胞摄取减少和/或效力损失。在某些实施方案中，本文描述的缀合反义化合物耐受所述键联变化，其中当与缀合的完全硫代磷酸酯对应物相比时摄取和效力损失很少或没有损失。事实上，在某些实施方案中，例如在实施例44、57、59和86中，包含缀合物和至少一个磷酸二酯核苷间键联的寡核苷酸实际上表现出增加的体内效力，即使是相对于也包含相同缀合物的完全硫代磷酸酯对应物来说。此外，因为缀合导致摄取/效力的实质增加，所以为实现改进的耐受性，所述实质增益的些微损失是可接受的。因此，在某些实施方案中，缀合反义化合物包含至少一个磷酸二酯键联。

在某些实施方案中，本文的反义化合物的缀合造成肝细胞中递送、摄取和活性的增加。因此，向肝脏组织递送更多的化合物。然而，在某些实施方案中，仅递送增加不能解释活性的整体增加。在某些所述实施方案中，更多化合物进入肝细胞。在某些实施方案中，即使是肝细胞摄取增加也不能解释活性的整体增加。在所述实施方案中，缀合化合物的生产性(productive)摄取增加。例如，如实施例102中所示，相对于非实质细胞，含有GalNAc的缀合物的某些实施方案增加了反义寡核苷酸在肝细胞中的富集。此富集对靶向在肝细胞中表达的基因的寡核苷酸是有益的。

在某些实施方案中，本文的缀合反义化合物造成肾暴露减少。例如，如实施例20中所示，包含含有GalNAc的缀合物的某些实施方案的反义寡核苷酸在肾中的浓度低于缺乏含有GalNAc的缀合物的反义寡核苷酸的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此对于非肾靶标，肾积累是不希望的。

在某些实施方案中，本公开提供由下式表示的缀合反义化合物：

其中

A为反义寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在上图和在本文的类似图中，支链基团“D”支化多次，所述次数是适应由“q”指示的(E-F)基团数目所必需的。因此，在q＝1时，式为：

A-B-C-D-E-F

在q＝2时，式为：

在q＝3时，式为：

在q＝4时，式为：

在q＝5时，式为：

在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：

在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：

在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：

在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：

本公开提供以下非限制性编号的实施方案：

在具有多于一个具体变量(例如，多于一个“m”或“n”)的实施方案中，除非另外指出，否则独立选择每个所述具体变量。因此，对于具有多于一个n的结构，独立地选择每个n，所以它们可为或可不为彼此相同的。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有5’-X的修饰寡核苷酸ISIS 494372，其中X为包含GalNAc的缀合物基团。在某些实施方案中，反义化合物由具有5’-X的修饰寡核苷酸ISIS 494372组成，其中X为包含GalNAc的缀合物基团。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681251。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681251组成。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681257。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681257组成。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有SEQ ID NO：58的修饰寡核苷酸，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。在某些实施方案中，反义化合物由具有SEQ ID NO：58的修饰寡核苷酸组成，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。

其中R

并且对于同一环上的每一对R

并且R

并且Z选自S

本公开提供以下非限制性编号的实施方案：

详述

应该理解，上述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和解释性的并且不限制本公开。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另外确切说明，否则术语如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。

本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，均出于任何目的特此明确地以引用的方式整体并入。

A.

除非提供确切的定义，否则结合本文所描述的分析化学、合成有机化学和医药化学所使用的命名法和这些化学领域的工序和技术为本领域熟知和常用的那些。标准技术可用于化学合成和化学分析。某些所述技术和工序可例如见于由Sangvi和Cook编著的“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，American Chemical Society，Washington D.C.，1994；″Remington′s Pharmaceutical Sciences，″Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，第21版，2005；和由Stanley T.Crooke编著的“Antisense DrugTechnology，Principles，Strategies，and Applications”，CRC Press，Boca Raton，Florida；以及Sambrook等，“Molecular Cloning，A laboratory Manual”，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，所述参考文献出于任何目的特此以引用的方式并入。如果允许，本公开通篇提及的所有专利、申请、已公布的申请和其它出版物以及其它数据以引用的方式整体并入本文。

除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：

如本文所使用，“核苷”意指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷(如在DNA和RNA中发现的)和修饰核苷。核苷可连接至磷酸部分。

如本文所使用，“化学修饰”意指当与天然存在的对应物相比时化合物的化学差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修饰。就寡核苷酸而言，化学修饰不包括仅在核碱基序列上的差异。

如本文所使用，“呋喃糖基”意指包含5元环的结构，所述5元环包含四个碳原子和一个氧原子。

如本文所使用，“天然存在的糖部分”意指如在天然存在的RNA中发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中发现的脱氧呋喃核糖基。

如本文所使用，“糖部分”意指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。

如本文所使用，“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。

如本文所使用，“取代的糖部分”意指并非天然存在的糖部分的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在2’-位、3’-位、5’-位和/或4’-位上包含取代基的呋喃糖基。某些取代的糖部分为双环糖部分。

如本文所使用，“2’-取代的糖部分”意指在2’-位上包含除H或OH之外的取代基的呋喃糖基。除非另外指出，否则2’-取代的糖部分不是双环糖部分(即，2’-取代的糖部分的2’-取代基与呋喃糖基环的另一个原子不形成桥联。

如本文所使用，“MOE”意指-OCH

如本文所使用，“2’-F核苷”是指包含在2’位上包含氟的糖的核苷。除非另外指出，否则2’-F核苷中的氟在核糖位上(替代天然核糖的OH)。

如本文所使用，术语“糖替代物”意指如下结构：所述结构不包含呋喃糖基并且能够替代核苷的天然存在的糖部分，使得所得到的核苷亚基能够连接在一起和/或与其它核苷连接以形成能够与互补的低聚化合物杂交的低聚化合物。所述结构包括如下环：所述环包含与呋喃糖基(例如，4元环、6元环或7元环)不同的原子数；用非氧原子(例如，碳、硫或氮)替代呋喃糖基的氧；或原子数和氧替代均有所变化。所述结构还可包含对应于对于取代的糖部分所描述的那些取代的取代(例如，任选包含另外取代基的6元碳环双环糖替代物)。糖替代物还包括更复杂的糖代替物(例如，肽核酸的非环系统)。糖替代物包括但不限于吗啉代、环己烯基和环己六醇。

如本文所使用，“双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二个环，从而产生双环结构的桥联。在某些实施方案中，4至7元环为糖环。在某些实施方案中，4至7元环为呋喃糖基。在某些所述实施方案中，桥联连接了呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。

如本文所使用，“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸(ssDNA)、双链核酸(dsDNA)、小干扰核糖核酸(siRNA)和微RNA(miRNA)。核酸还可包含单一分子中的这些要素的任何组合。

如本文所使用，“核苷酸”意指还包含磷酸酯连接基团的核苷。如本文所使用，“连接核苷”可或可不通过磷酸酯键联连接并且因此包括但不限于“连接的核苷酸”。如本文所使用，“连接核苷”为以连续顺序连接的核苷(即，在那些连接的核苷之间不存在另外的核苷)。

如本文所使用，“核碱基”意指可连接至糖部分以形成能够掺入到寡核苷酸中的核苷的原子基团，并且其中原子基团能够与另一个寡核苷酸或核酸的互补的天然存在的核碱基键合。核碱基可为天然存在的或可为修饰的。如本文所使用，“核碱基序列”意指不依赖于任何糖、键联或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。

如本文所使用，术语“未修饰的核碱基”或“天然存在的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环核碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基C)和尿嘧啶(U)。

如本文所使用，“修饰核碱基”意指并非天然存在的核碱基的任何核碱基。

如本文所使用，“修饰核苷”意指与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一个化学修饰的核苷。修饰核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。

如本文所使用，“双环核苷”或“BNA”意指包含双环糖部分的核苷。

如本文所使用，“约束的乙基核苷”或“cEt”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH(CH

如本文所使用，“锁核酸核苷”或“LNA”意指包含双环糖部分的核苷，所述双环糖部分包含4’-CH

如本文所使用，“2’-取代的核苷”意指在2’-位上包含除H或OH之外的取代基的核苷。除非另外指出，否则2’-取代的核苷不是双环核苷。

如本文所使用，“脱氧核苷”意指包含如在天然存在的脱氧核糖核苷(DNA)中所发现的2’-H呋喃糖基糖部分的核苷。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(例如，尿嘧啶)。

如本文所使用，“寡核苷酸”意指包含多个连接核苷的化合物。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)和/或一个或多个修饰核苷。

如本文所使用，“寡核苷”意指其中没有核苷间键联含有磷原子的寡核苷酸。如本文所使用，寡核苷酸包含寡核苷。

如本文所使用，“修饰寡核苷酸”意指包含至少一个修饰核苷和/或至少一个修饰的核苷间键联的寡核苷酸。

如本文所使用，“键联”或“连接基团”意指将两个或更多个其它原子基团连接在一起的原子基团。

如本文所使用，“核苷间键联”意指寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联。

如本文所使用，“天然存在的核苷间键联”意指3′至5′磷酸二酯键联。

如本文所使用，“修饰的核苷间键联”意指除了天然存在的核苷间键联之外的任何核苷间键联。

如本文所使用，“末端核苷间键联”意指寡核苷酸或其限定区域的最后两个核苷之间的键联。

如本文所使用，“磷连接基团”意指包含磷原子的连接基团。磷连接基团包括但不限于具有下式的基团：

其中：

R

R

R

J

磷连接基团包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯。

如本文所使用，“核苷间磷连接基团”意指直接连接两个核苷的磷连接基团。

如本文所使用，“非核苷间磷连接基团”意指不直接连接两个核苷的磷连接基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。

如本文所使用，“中性连接基团”意指不带电荷的连接基团。中性连接基团包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(-CH

如本文所使用，“核苷间中性连接基团”意指直接连接两个核苷的中性连接基团。

如本文所使用，“非核苷间中性连接基团”意指不直接连接两个核苷的中性连接基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。

如本文所使用，“低聚化合物”意指包含两个或更多个子结构的聚合结构。在某些实施方案中，低聚化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含一个或多个缀合物基团和/或端基。在某些实施方案中，低聚化合物由寡核苷酸组成。低聚化合物还包括天然存在的核酸。在某些实施方案中，低聚化合物包含一个或多个连接的单体亚基的骨架，其中每个连接的单体亚基直接或间接地连接至杂环碱基部分。在某些实施方案中，低聚化合物还可包括没有连接至杂环碱基部分的单体亚基，从而提供无碱基位点。在某些实施方案中，连结单体亚基、糖部分或糖替代物以及杂环碱基部分的键联可独立地修饰。在某些实施方案中，可或可不包括杂环碱基的键联-糖单元可被模拟物如肽核酸中的单体取代。

如本文所使用，“端基”意指连接至寡核苷酸的3’末端或5’末端中的任一或两者的一个或多个原子。在某些实施方案中，端基为缀合物基团。在某些实施方案中，端基包含一个或多个端基核苷。

如本文所使用，“缀合物”或“缀合物基团”意指结合至寡核苷酸或低聚化合物的原子或原子基团。通常，缀合物基团改变它们所连接至的化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。

如本文所使用，在缀合物基团背景下的“缀合物接头”或“接头”意指包含任何原子或原子基团的缀合物基团的一部分并且其(1)将寡核苷酸共价连接至缀合物基团的另一个部分或(2)共价连接缀合物基团的两个或更多个部分。

缀合物基团在本文中示为基团，提供用于形成至低聚化合物如反义寡核苷酸的共价连接的键。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的3’末端核苷的3′-羟基的3′-氧原子。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的5’末端核苷的5′-羟基的5′-氧原子。在某些实施方案中，用于形成至低聚化合物的连接的键为可裂解键。在某些所述实施方案中，所述可裂解键构成可裂解部分的全部或部分。

在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分(例如，可裂解键或可裂解核苷)和碳水化合物聚簇部分，如GalNAc聚簇部分。所述碳水化合物聚簇部分包含：靶向部分和任选地缀合物接头。在某些实施方案中，通过配体的数目和身份来鉴定碳水化合物聚簇部分。例如，在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含3个GalNAc基团并且命名为“GalNAc

如本文所使用，“可裂解部分”意指能够在生理条件下分裂的键或基团。在某些实施方案中，可裂解部分在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内部裂解。在某些实施方案中，可裂解部分通过内源性酶如核酸酶裂解。在某些实施方案中，可裂解部分包含具有一个、两个、三个、四个或多于四个可裂解键的原子基团。

如本文所使用，“可裂解键”意指能够被分裂的任何化学键。在某些实施方案中，可裂解键选自以下：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物或肽。

如本文所使用，“碳水化合物聚簇”意指具有连接至支架或接头基团的一个或多个碳水化合物残基的化合物。(对于碳水化合物缀合物聚簇的实例，参见，例如，Maier等，“Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a MultivalentCarbohydrate Cluster for Cellular Targeting，”Bioconjugate Chemistry，2003，(14)：18-29，所述参考文献以引用的方式整体并入本文，或Rensen等，“Design andSynthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targetingof Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor，”J.Med.Chem.2004，(47)：5798-5808)。

如本文所使用，“修饰的碳水化合物”意指相对于天然存在的碳水化合物具有一个或多个化学修饰的任何碳水化合物。

如本文所使用，“碳水化合物衍生物”意指可使用碳水化合物作为起始材料或中间体合成的任何化合物。

如本文所使用，“喊水化合物”意指天然存在的碳水化合物、修饰的碳水化合物或碳水化合物衍生物。

如本文所使用，“保护基”意指本领域技术人员已知的任何化合物或保护基。保护基的非限制性实例可见于″Protective Groups in Organic Chemistry″，T.W.Greene、P.G.M.Wuts，ISBN 0-471-62301-6，John Wiley&Sons，Inc，New York，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。

如本文所使用，“单链的”意指不与其补体杂交并且缺乏足够自身互补性以形成稳定自身双链体的低聚化合物。

如本文所使用，“双链的”意指彼此杂交的低聚化合物对或形成发夹结构的单个自身互补的低聚化合物。在某些实施方案中，双链低聚化合物包含第一和第二低聚化合物。

如本文所使用，“反义化合物”意指包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成的化合物，所述寡核苷酸的至少一部分与其能够杂交的靶核酸互补，从而导致至少一种反义活性。

如本文所使用，“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测和/或可测量的变化。在某些实施方案中，反义活性包括靶核酸转录物(例如mRNA)的量或活性的调节。在某些实施方案中，反义活性包括前体mRNA的剪接的调节。

如本文所使用，“基于RNA酶H的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于反义化合物与靶核酸的杂交和随后的RNA酶H对靶核酸的裂解。

如本文所使用，“基于RISC的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于RNA诱导的沉默复合物(RISC)。

如本文所使用，“检测”或“测量”意指用于进行检测或测量的测试或测定。所述检测和/或测量可能得到零值。因此，如果用于检测或测量的测试得到没有活性(活性为零)的发现，尽管如此，也已经进行了检测或测量活性的步骤。

如本文所使用，“可检测和/或可测量的活性”意指不为零的在统计学上显著的活性。

如本文所使用，“基本上未变化”意指具体地相对于变化更多的另一个参数，具体参数几乎没有或没有变化。在某些实施方案中，当参数变化小于5％时，所述参数基本上未变化。在某些实施方案中，如果参数变化小于两倍而另一个参数变化至少十倍，则所述参数基本上未变化。例如，在某些实施方案中，反义活性为靶核酸的量的变化。在某些所述实施方案中，如果非靶核酸的量比靶核酸的量变化的小得多，那么所述非靶核酸的量基本上未变化，但变化不必需为零。

如本文所使用，“表达”意指基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于转录、转录后修饰(例如，剪接、聚腺苷酸化、添加5’-帽)以及翻译。

如本文所使用，“靶核酸”意指反义化合物意图与其杂交以产生希望的反义活性的核酸分子。反义寡核苷酸与其靶核酸具有足够的互补性以允许在生理条件下杂交。

如本文所使用，在提到核碱基时的“核碱基互补性”或“互补性”意指能够与另一个核碱基碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基意指能够与其靶核酸的核碱基碱基配对的反义化合物的核碱基。例如，如果反义化合物的某个位置上的核碱基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位置被认为在所述核碱基对上是互补的。包含某些修饰的核碱基可维持与对应核碱基配对的能力，并且因此仍能够具有核碱基互补性。

如本文所使用，关于核碱基的“非互补性”意指彼此不形成氢键的核碱基对。

如本文所使用，关于低聚化合物(例如，连接核苷、寡核苷酸或核酸)的“互补性”意指所述低聚化合物或其区域与另一个低聚化合物或其区域通过核碱基互补性杂交的能力。互补的低聚化合物不必需在每个核苷上均具有核碱基互补性。相反，容忍一些错配。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域在70％的核碱基上互补(70％互补)。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域80％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域90％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域95％互补。在某些实施方案中，互补的低聚化合物或区域100％互补。

如本文所使用，“错配”意指当第一和第二低聚化合物对准时，不能够与第二低聚化合物的对应位置上的核碱基配对的第一低聚化合物的核碱基。第一和第二低聚化合物中的任一或两者可为寡核苷酸。

如本文所使用，“杂交”意指互补低聚化合物(例如，反义化合物及其靶核酸)的配对。虽然不限于具体机制，但配对的最常见机制涉及氢键合，所述氢键合可为互补核碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。

如本文所使用，“特异性杂交”意指低聚化合物与一个核酸位点杂交比它与另一个核酸位点杂交具有更大亲合力的能力。

如本文所使用，关于寡核苷酸或其部分的“完全互补”意指寡核苷酸或其部分的每个核碱基均能够与互补核酸或其邻接部分的核碱基配对。因此，完全互补区在任一链中均不包含错配或未杂交的核碱基。

如本文所使用，“互补百分比”意指与靶核酸的等长部分互补的低聚化合物的核碱基的百分数。通过将与靶核酸中的对应位置上的核碱基互补的低聚化合物的核碱基数除以低聚化合物的总长度来计算互补百分比。

如本文所使用，“同一性百分比”意指与第二核酸中的对应位置上的核碱基相同类型(不依赖于化学修饰)的第一核酸中的核碱基数除以第一核酸中的核碱基总数。

如本文所使用，“调节”意指当与调节前的分子、功能或活性的量或质量相比时分子、功能或活性的量或质量的变化。例如，调节包括基因表达的变化，增加(刺激或诱导)或减少(抑制或降低)。作为另一个实例，表达的调节可包括前体mRNA加工的剪接位点选择的变化，从而导致与不存在调节情况下的量相比的具体剪接变体的绝对或相对量的变化。

如本文所使用，“化学基序”意指寡核苷酸或其区域中的化学修饰的模式(pattern)。可通过寡核苷酸的某些核苷和/或某些连接基团上的修饰来定义基序。

如本文所使用，“核苷基序”意指寡核苷酸或其区域中的核苷修饰的模式。这样的寡核苷酸的键联可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述核苷的基序意图为核苷基序。因此，在所述情况下，键联不受限制。

如本文所使用，“糖基序”意指寡核苷酸或其区域中的糖修饰的模式。

如本文所使用，“键联基序”意指寡核苷酸或其区域中的键联修饰的模式。这样的寡核苷酸的核苷可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述键联的基序意图为键联基序。因此，在所述情况下，核苷不受限制。

如本文所使用，“核碱基修饰基序”意指沿着寡核苷酸的核碱基的修饰的模式。除非另外指出，否则核碱基修饰基序不依赖于核碱基序列。

如本文所使用，“序列基序”意指沿着寡核苷酸或其部分布置的核碱基的模式。除非另外指出，否则序列基序不依赖于化学修饰并且因此可具有化学修饰的任何组合，包括没有化学修饰。

如本文所使用，关于核苷或一种“类型”的核苷的“修饰类型”意指核苷的化学修饰并且包括修饰和未修饰的核苷。因此，除非另外指出，否则“具有第一类型的修饰的核苷”可为未修饰的核苷。

如本文所使用，“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷为“不同修饰的”，即使DNA核苷为未修饰的。同样，DNA和RNA为“不同修饰的”，即使这两者均为天然存在的未修饰的核苷。相同但包含不同核碱基的核苷不为不同修饰的。例如，包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的腺嘌呤核碱基的核苷和包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不为不同修饰的。

如本文所使用，“相同类型的修饰”是指彼此相同的修饰，包括不存在修饰。因此，例如，两个未修饰的DNA核苷具有“相同类型的修饰”，即使DNA核苷为未修饰的。具有相同类型修饰的所述核苷可包含不同的核碱基。

如本文所使用，“单独区域”意指寡核苷酸的部分，其中任何相邻部分的化学修饰或化学修饰的基序包括至少一个差异以允许单独的区域彼此区分。

如本文所使用，“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合用于向动物施用的任何物质。在某些实施方案中，药学上可接受的载体或稀释剂为无菌盐水。在某些实施方案中，所述无菌盐水为药用级盐水。

如本文所使用，术语“代谢病症”意指主要特征在于代谢失调-与食物分解产生能量相关的一系列复杂化学反应的疾病或病状。

如本文所使用，术语“心血管病症”意指主要特征在于心脏或血管功能受损的疾病或病状。

如本文所使用，术语“单环系统或多环系统”意指包括选自单一或多环基团环系统的所有环系统，其中环稠合或连接并且意图包括单独地选自以下的单环系统和混合环系统：脂肪族、脂环族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环、杂芳基、杂芳香族和杂芳基烷基。所述单环结构和多环结构可含有环，所述环各自具有相同水平的饱和或各自独立地具有不同程度的饱和，包括完全饱和、部分饱和或完全不饱和。每个环可包含选自C、N、O和S的环原子以产生杂环以及仅包含C环原子的环，所述环可存在于混合基序中，例如像苯并咪唑，其中一个环仅具有碳环原子并且稠环具有两个氮原子。单环系统或多环系统可进一步被取代基取代，例如像具有两个连接至环中的一个的＝O基团的邻苯二甲酰亚胺。单环系统或多环系统可使用各种策略连接至母体分子，如直接通过环原子、通过多个环原子稠合、通过取代基或通过双官能连接部分。

如本文所使用，“前药”意指化合物的无活性或具有较小活性的形式，当向受试者施用时，所述前药被代谢形成活性或更具活性的化合物(例如，药物)。

如本文所使用，“取代基(substituent)”和“取代基(substituent group)”意指替代指定母体化合物的原子或基团的原子或基团。例如，修饰核苷的取代基为不同于在天然存在的核苷中发现的原子或基团的任何原子或基团(例如，修饰的2’-取代基为在核苷的2’-位上的除H或OH之外的任何原子或基团)。取代基可为保护或未保护的。在某些实施方案中，本公开的化合物在母体化合物的一个位置上或多于一个位置上具有取代基。取代基还可进一步被其它取代基取代并且可直接连接或通过连接基团如烷基或烃基连接至母体化合物。

同样，如本文所使用，关于化学官能团的“取代基”意指不同于通常存在于指定官能团中的原子或原子基团的原子或原子基团。在某些实施方案中，取代基替代官能团的氢原子(例如，在某些实施方案中，取代的甲基的取代基为替代未取代的甲基的一个氢原子的除氢之外的原子或基团)。除非另外指出，否则适合用作取代基的基团包括但不限于卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)R

如本文所使用，如本文所使用的“烷基”意指含有最多至二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子(C

如本文所使用，“烯基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键的直链或支链链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1，3-丁二烯等。烯基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的烯基可任选地包括一个或多个另外的取代基。

如本文所使用，“炔基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的炔基可任选地包括一个或多个另外的取代基。

如本文所使用，“酰基”意指通过从有机酸中去除羟基形成的基团并且具有通式-C(O)-X，其中X通常为脂肪族、脂环族或芳香族。实例包括脂肪族羰基、芳香族羰基、脂肪族磺酰基、芳香族亚硫酰基、脂肪族亚硫酰基、芳香族磷酸酯、脂肪族磷酸酯等。如本文所使用的酰基可任选地包括另外的取代基。

如本文所使用，“脂环族”意指其中环为脂肪族的环系统。环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族。优选的脂环族包括其中具有约5至约9个碳原子的环。如本文所使用的脂环族可任选地包括另外的取代基。

如本文所使用，“脂肪族”意指含有最多至二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任何两个碳原子之间的饱和度为单键、双键或三键。脂肪族基团优选含有1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子，其中1至约6个碳原子更优选。脂肪族基团的直链或支链可被一个或多个杂原子中断，所述杂原子包括氮、氧、硫和磷。被杂原子中断的所述脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。如本文所使用的脂肪族基团可任选地包括另外的取代基。

如本文所使用，“烷氧基”意指在烷基与氧原子之间形成的基团，其中氧原子用来将烷氧基连接至母体分子。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。如本文所使用的烷氧基可任选地包括另外的取代基。

如本文所使用，“氨基烷基”意指氨基取代的C

如本文所使用，“芳烷基”和“芳基烷基”意指共价连接至C

如本文所使用，“芳基”和“芳香族”意指具有一个或多个芳环的单环或多环碳环系统基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。优选的芳环系统在一个或多个环中具有约5至约20个碳原子。如本文所使用的芳基可任选地包括另外的取代基。

如本文所使用，“卤代基”和“卤素”意指选自氟、氯、溴和碘的原子。

如本文所使用，“杂芳基”和“杂芳香族”意指包含单环或多环芳环、环系统或稠环系统的基团，其中至少一个环为芳香族的并且包括一个或多个杂原子。杂芳基还意图包括稠环系统，所述稠环系统包括其中一个或多个稠环不含有杂原子的系统。杂芳基通常包括一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过连接部分如脂肪族基团或杂原子连接至母体分子。如本文所使用的杂芳基可任选地包括另外的取代基。

如本文所使用，“缀合物化合物”意指适合用作缀合物基团的任何原子、原子基团或连接的原子基团。在某些实施方案中，缀合物化合物可具有或赋予一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。

如本文所使用，除非另外指出或修改，术语“双链的”是指彼此杂交的两个单独的低聚化合物。所述双链化合物可在一个或两个链的一个或两个末端上具有一个或多个或非杂交的核苷(突出端)和/或一个或多个内部非杂交核苷(错配)，前提是存在足够互补性，以维持在生理学相关条件下的杂交。

如本文所使用，“5’靶位点”是指与特定反义化合物的最5’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。

如本文所使用，“约”意指在值的±10％以内。例如，如果陈述标志物可增加约“50％”，则意味着标志物可增加45％-55％。

如本文所使用，“伴随施用”是指在相同时间以任何方式对两种药剂同时施用，其中两种药剂的药理作用均在患者中显现。伴随施用不需要在单一药物组合物中、以相同剂型或通过相同施用途经对两种药剂进行施用。两种药剂的作用不需要在相同时间显现。所述作用仅需要重叠一段时间但不需要同延。

如本文所使用，“施用(administering)”或“施用(administration)”意指将药剂提供给个体，并且包括但不限于通过医学专业人员施用或自我施用。药剂向个体的施用可以是连续的、长期的、短期的或间歇的。施用可以是肠胃外的或非肠胃外的。

如本文所施用，“药剂”意指在施用给动物时可提供治疗益处的活性物质。“第一药剂”意指本文提供的治疗化合物。例如，第一药剂可以是靶向apo(a)的反义寡核苷酸。“第二药剂”意指本发明的第二治疗化合物(例如，靶向apo(a)的第二反义寡核苷酸)和/或非apo(a)治疗化合物。

如本文所使用，“改善(amelioration)”或“改善(ameliorate)”或“改善(ameliorating)”是指相关疾病、病症或病状的至少一种指标、体征或症状的减轻。指标的严重性可通过本领域技术人员已知的主观或客观测量来确定。

如本文所使用，“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴子和猩猩。

如本文所使用，“apo(a)”意指编码apo(a)的任何核酸或蛋白质序列。例如，在某些实施方案中，apo(a)包括编码apo(a)的DNA序列、从编码apo(a)的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列、编码apo(a)的mRNA序列或编码apo(a)的肽序列。

如本文所使用，“apo(a)核酸”意指编码apo(a)的任何核酸。例如，在某些实施方案中，apo(a)核酸包括编码apo(a)的DNA序列、从编码apo(a)的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列，和编码apo(a)的mRNA序列。

如本文所使用，“apo(a)mRNA”意指编码apo(a)蛋白的mRNA。

如本文所使用，“apo(a)蛋白”意指编码Apo(a)的任何蛋白序列。

如本文所使用，“apo(a)特异性抑制剂”是指能够特异性地抑制apo(a)核酸和/或apo(a)蛋白的表达的任何试剂。例如，apo(a)特异性抑制剂包括核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子和其它能够抑制apo(a)核酸和/或apo(a)蛋白的表达的试剂。在某些实施方案中，通过特异性地调节apo(a)核酸表达和/或apo(a)蛋白表达，apo(a)特异性抑制剂可影响脂质运输系统的其它组分，包括下游组分。类似地，在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂可影响动物中的其它分子过程。

如本文所使的那样，“动脉粥样硬化”意指影响大动脉和中等动脉的动脉的硬化并且以存在脂肪沉积物为特征。脂肪沉积物被称为“动脉粥样化”或“斑”，其主要由胆固醇和其它脂肪、钙和疤痕组织组成，并且损伤动脉的内衬。

如本文所使用，“冠心病(CHD)”意指向心脏供应血液和氧气的小血管的变窄，这通常是动脉粥样硬化的结果。

如本文所使用，“糖尿病(Diabetes mellitus)”或“糖尿病(diabetes)”是以由胰岛素水平不足或胰岛素敏感性降低所致的代谢障碍或异常高血糖(高血糖症)为特征的综合征。特征症状为由高血糖水平引起的过量尿产生(多尿)、试图补偿增加排尿的过度口渴和增加的液体摄取(烦渴)、由对眼睛光学系统的高血糖作用引起的视力模糊、原因不明的体重减轻、和嗜眠。

如本文所使用，“糖尿病性血脂异常”或“伴血脂异常的2型糖尿病”意指以2型糖尿病、HDL-C降低、甘油三酯升高(TG)以及小而密LDL颗粒的升高为特征的病状。

如本文所使用，“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需的或期望的成分。例如，注射型组合物中的稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。

如本文所使用，“血脂异常”是指脂质和/或脂蛋白代谢的障碍，包括脂质和/或脂蛋白过度产生或缺乏。血脂异常可表现为诸如乳糜微粒、胆固醇和甘油三酯的脂质以及诸如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的脂蛋白的升高。

如本文所使用，“剂量单位”意指所提供的药剂的形式，例如丸剂、片剂或本领域中已知的其它剂量单位。在某些实施方案中，剂量单位为含有冻干反义寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位为含有重构反义寡核苷酸的小瓶。

如本文所使用，“剂量”意指在单个施用中或在指定时间内提供的指定量的药剂。在某些实施方案中，剂量可在一个、两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂中施用。例如，在某些实施方案中，当期望皮下施用时，所需剂量需要不易由单次注射调节的体积，因此，两个或更多个注射可用于实现所需剂量。在某些实施方案中，药剂通过在延长的时段内或连续地输注来施用。剂量可被陈述为每小时、每天、每周或每月药剂的量。剂量可表示为mg/kg或g/kg。

如本文所使用，“有效量”或“治疗有效量”意指足以在需要活性药剂的个体中实现所需生理学结果的药剂的量。有效量可在个体间变化，取决于待治疗个体的健康和身体条件、待治疗个体的分类群、组合物的制剂、个体的医疗条件的评价以及其它相关因素。

如本文所使用，“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的核碱基序列的每个核碱基在第二核酸的第二核碱基序列中具有互补核碱基。”在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物且第二核酸是靶核酸。

如本文所使用，“葡萄糖”是指被细胞用作能量源和炎性介体的单糖。“血浆葡萄糖”是指血浆中存在的葡萄糖。

如本文所使用，“高密度脂蛋白-C”或“HDL-C”意指与高密度脂蛋白颗粒结合的胆固醇。血清(或血浆)中HDL-C的浓度通常以mg/dL或nmol/L计量。“血清HDL-C”和“血浆HDL-C”分别意指血清和血浆中的HDL-C。

如本文所使用，“HMG-CoA还原酶抑制剂”意指通过抑制酶HMG-CoA还原酶起作用的药剂，例如阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀和辛伐他汀。

如本文所使用，“高胆固醇血症”意指按照National Cholesterol EducationalProgram(NCEP)对于检测、评价或治疗成人高胆固醇的专家小组报告的指南(参见Arch.Int.Med.(1988)148，36-39)，以升高的胆固醇或循环(血浆)胆固醇、LDL-胆固醇和VLDL-胆固醇为特征的病状。

如本文所使用，“高脂血症(Hyperlipidemia)”或“高脂血症(hyperlipemia)”是以血清脂质或循环(血浆)脂质升高为特征的病状。此病状表现为异常高浓度的脂肪。循环血液中的脂质级分为胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒和甘油三酯。高脂血症的Fredrickson分类是基于如电泳或超速离心测量的TG和富含胆固醇的脂蛋白颗粒的图案，并且通常用来表征高脂血症如高甘油三酯血症的主要原因(Fredrickson和Lee，Circulation，1965，31：321-327；Fredrickson等，New Eng J Med，1967，276(1)：34-42)。

如本文所使用，“高甘油三酯血症”意指以甘油三酯水平升高为特征的病状。其病因包括原发性(即遗传原因)和继发性(其它潜在原因如糖尿病、代谢综合征/胰岛素抵抗、肥胖症、身体不活动、吸烟、过量的酒精和非常高含量的碳水化合物的饮食)因素或最通常的是两者的组合(Yuan等CMAJ，2007，176：1113-1120)。

如本文所使用，“鉴定”或“选择具有代谢或心血管疾病的动物”意指鉴定或选择易于患有或已诊断出代谢疾病、心血管疾病或代谢综合征的受试者；或，鉴定或选择具有代谢疾病、心血管疾病或代谢综合征的任何症状的受试者，所述症状包括但不限于高胆固醇血症、高血糖、高脂血症、高甘油三酯血症、高血压、增加的胰岛素抵抗、胰岛素敏感性降低、超过正常体重，和/或超过正常体脂肪含量或它们的任何组合。所述鉴定可通过任何方法来实现，所述方法包括但不限于标准临床试验或评价，如测量血清或循环(血浆)胆固醇，测量血清或循环(血浆)血液葡萄糖，测量血清或循环(血浆)甘油三酯，测量血压，测量体脂肪含量，测量体重等。

如本文所使用，“改进的心血管转归”意指不利的心血管事件的发生率或其风险降低。不利心血管事件的实例包括但不限于死亡、再梗死、中风、心源性休克、肺水肿、心脏停搏和心房性心律失常。

如本文所使用，“紧邻”意指在紧邻的元素之间，例如，区域、片段、核苷酸和/或核苷之间不存在插入元素。

如本文所使用，“增加HDL”或“提升HDL”意指与未施用任何化合物的HDL水平相比，在施用至少一种本发明的化合物之后增加动物中HDL的水平。

如本文所使用，“个体”或“受试者”或“动物”意指对于治疗或疗法所选择的人或非人动物。

如本文所使用，“有此需要的个体”是指针对治疗或疗法所选择的需要这种治疗或疗法的人或非人动物。

如本文所使用，“诱导”、“抑制”、“加强”、“升高”、“增加”、“减少”、“降低”等表示两个状态之间的定量差异。例如，“有效抑制apo(a)的活性或表达的量”意指处理样品中apo(a)的活性或表达的水平将不同于未处理样品中apo(a)活性或表达的水平。所述术语例如适用于表达水平和活性水平。

如本文所使用，“炎性病状”是指疾病、疾病状态、综合征或其它导致炎症的病状。例如，类风湿性关节炎和肝纤维化是炎性病状。炎性病状的其它实例包括败血症、心肌缺血/再灌注损伤、成人呼吸窘迫综合征、肾炎、移植排斥、炎性肠病、多发性硬化、动脉硬化、动脉粥样硬化和血管炎。

如本文所使用，“抑制表达或活性”是指RNA或蛋白质的表达或活性的降低或阻断并且不一定表示表达或活性的完全消除。

如本文所使用，“胰岛素抵抗”被定义为其中正常胰岛素量不足以产生来自脂肪、肌肉和肝组织的正常胰岛素应答的病状。脂肪细胞中的胰岛素抵抗导致储存的甘油三酯水解，这升高血浆中的游离脂肪酸。肌肉中的胰岛素抵抗降低葡萄糖摄取，而肝脏中的胰岛素抵抗减少葡萄糖储存，两种作用都会升高血液葡萄糖。由胰岛素抵抗引起的胰岛素和葡萄糖的高血浆水平往往导致代谢综合征和2型糖尿病。

如本文所使用，“胰岛素敏感性”是个体对葡萄糖加工的有效程度的量度。具有高胰岛素敏感性的个体有效地加工葡萄糖，而具有低胰岛素敏感性的个体不会有效地加工葡萄糖。

如本文所使用，“降低脂质”意指受试者中一种或多种脂质(例如LDL、VLDL)的减少。“提高脂质”意指受试者中脂质(例如HDL)的增加。降低脂质或提高脂质可随时间在一个或多个剂量下发生。

如本文所使用，“降脂质疗法”或“降脂质剂”意指提供给受试者以降低受试者中的一种或多种脂质的治疗方案。在某些实施方案中，提供降脂质疗法以降低受试者中的apo(a)、CETP、apoB、总胆固醇、LDL-C、VLDL-C、IDL-C、非-HDL-C、甘油三酯、小而密LDL颗粒和Lp(a)中的一种或多种。降脂质疗法的实例包括但不限于apoB抑制剂、他汀类、贝特类和MTP抑制剂。

如本文所使用，“脂蛋白”诸如VLDL、LDL和HDL是指血清、血浆和淋巴中发现的一组蛋白质并且对于脂质运输是重要的。每种脂蛋白的化学组成有所不同，例如其中HDL具有更高的蛋白质对脂质比例，而VLDL具有更低的蛋白质对脂质比例。

如本文所使用，“Lp(a)”包含apo(a)和含有apoB的LDL样颗粒。apo(a)通过二硫键连接至apoB。

如本文所使用，“低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)”意指在低密度脂蛋白颗粒中携带的胆固醇。血清(或血浆)中LDL-C的浓度通常以mg/dL或nmol/L计量。“血清LDL-C”和“血浆LDL-C”分别意指血清和血浆中的LDL-C。

如本文所使用，“主要风险因素”是指促成特定疾病或病状的高风险的因素。在某些实施方案中，冠心病的主要风险因素包括但不限于吸烟、高血压、高LDL、低HDL-C、冠心病家族史、年龄和本文公开的其它因素。

如本文所使用，“代谢病症”或“代谢疾病”是指以代谢功能的改变或紊乱为特征的病状。“代谢的”和“代谢”是本领域中熟知的术语并且通常包括发生在活有机体内的整个范围的生物化学过程。代谢病症包括但不限于高血糖症、前驱糖尿病、糖尿病(1型和2型)、肥胖症、胰岛素抵抗、代谢综合征和2型糖尿病引起的血脂异常。

如本文所使用，“代谢综合征”意指以代谢来源的脂质和非脂质心血管风险因素的聚类为特征的病状。在某些实施方案中，通过以下因素中任何3个的存在来鉴定代谢综合征：男性中腰围大于102cm或女性中腰围大于88cm；至少150mg/dL的血清甘油三酯；男性中HDL-C小于40mg/dL或女性中小于50mg/dL；至少130/85mmHg的血压；以及至少110mg/dL的空腹葡萄糖。这些决定因素可在临床实践中容易地测量(JAMA，2001，285：2486-2497)。

“肠胃外施用”意指通过注射或输注来施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。施用可以是连续的、长期的、短期的或间歇的。

如本文所使用，“肽”意指通过由酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。肽是指多肽和蛋白质。

如本文所使用，“药剂”意指当施用给个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向apo(a)的反义寡核苷酸为药剂。

如本文所使用，“药物组合物”或“组合物”意指适用于对个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含一种或多种活性剂和药物载体，例如无菌水溶液。

如本文所使用，“药物学上可接受的衍生物”包括本文所述化合物的衍生物，例如溶剂化物、水合物、酯、前药、多晶型物、异构体、同位素标记变体、药学上可接受的盐和本领域中已知的其它衍生物。

如本文所使用，“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性且不会赋予不希望的毒理学效应的盐。术语“药学上可接受的盐”或“盐”包括由药学上可接受的无毒性酸或碱(包括无机或有机酸和碱)制备的盐。本文所述的化合物的“药学上可接受的盐”可通过本领域中已知的方法制备。关于药学上可接受的盐的综述，参见Stahl和Wermuth，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use(Wiley-VCH，Weinheim，Germany，2002)。反义寡核苷酸的钠盐是有用的并且对于人类的治疗性施用是广泛接受的。因此，在一个实施方案中，本文所述的化合物是呈钠盐的形式。

如本文所述，“部分”意指核酸的限定数目的连续(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。

如本文所使用，“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指延迟或阻止疾病、病症或病状的发作或发展达数分钟到无限期的时间段。预防还意指降低发展疾病、疾病或病状的风险。

如本文所使用，“提高”意指量的增加。例如，提高血浆HDL水平意指增加血浆中HDL的量。

如本文所使用，“降低”意指下降至更小的程度、尺寸、量或数目。例如，降低血浆甘油三酯水平意指减少血浆中甘油三酯的量。

如本文所使用，“区域”或“靶区域”被定义为具有至少一个可鉴定的结构、功能或特征的靶核酸的部分。例如，靶区域可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合部、编码区、翻译起始区、翻译终止区，或其它所定义的核酸区域。关于apo(a)的结构上定义的区域可通过登录号从序列数据库如NCBI获得并且所述信息以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，靶区域可涵盖从靶区域内一个靶区段的5’靶位点到所述靶区域内另一靶区段的3’靶位点的序列。

如本文所使用，“第二药剂”或“第二治疗剂”意指能与“第一药剂”结合使用的药剂。第二治疗剂可包括但不限于靶向apo(a)或apoB的反义寡核苷酸。第二药剂还可包括抗apo(a)抗体、apo(a)肽抑制剂、降胆固醇剂、降脂质剂、降血糖剂和抗炎剂。

如本文所使用，“区段”被定义为核酸内的区域的更小的子部分。例如，“靶区段”意指一种或多种反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。或者，“起始位点”可指靶区段的最5’核苷酸并且“终止位点”是指靶区段的最3’核苷酸。靶区段也可开始于一个序列的“起始位点”并结束于另一序列的“终止位点”。

如本文所使用，“抑制素”意指意指HMG-CoA还原酶的活性的药剂。

如本文所使用，“皮下施用”意指刚好在皮肤下方的施用。

如本文所使用，“受试者”意指对于治疗或疗法所选择的人或非人动物。

如本文所使用，“心血管疾病或病症的症状”意指由心血管疾病或病症引起并伴随心血管疾病或病症的现象，并且充当心血管疾病或病症的指示。例如，心绞痛；胸痛；呼吸短促；心悸；虚弱；头晕；恶心；出汗；心动过速；心动过缓；心律失常；心房纤维性颤动；下肢肿胀；发绀；疲劳；昏晕；面部发麻；四肢发麻；跛行或肌肉抽筋；腹部鼓胀；或发热是心血管疾病或病症的症状。

如本文所使用，“靶向”或“靶向的”意指将与靶核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的设计和选择的过程。

如本文所使用，“治疗有效量”意指对个体提供治疗益处的药剂的量。

如本文所使用，“治疗生活方式变化”意指旨在降低脂肪/脂肪组织质量和/或胆固醇的饮食和生活方式变化。此类变化会降低发展心脏病的风险，并且可包括每日总卡路里、总脂肪、饱和脂肪、多不饱和脂肪、单不饱和脂肪、碳水化合物、蛋白质、胆固醇、不溶纤维的饮食摄取的推荐，以及身体活动的推荐。

如本文所使用，“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指施用本文所述的化合物以达到疾病、病症或病状的改变或改善。

如本文所使用，“甘油三酯”或“TG”意指由与三个脂肪酸分子结合的甘油组成的脂质或中性脂肪。

如本文所使用，“2型糖尿病(type 2 diabetes)”(也称为“2型糖尿病(type 2diabetes mellitus)”、“糖尿病2型(diabetes mellitus，type 2)”、“非胰岛素依赖型糖尿病”、“NIDDM”、“肥胖相关糖尿病”或“成人发作糖尿病”是代谢病症，其主要以胰岛素抵抗、相对胰岛素缺乏和高血糖为特征。

某些实施方案

在某些实施方案中，化合物包含本领域中已知的靶向载脂蛋白(a)(apo(a))的siRNA或反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。适用于缀合的靶向apo(a)的反义寡核苷酸的实例包括但不限于WO 2013/177468、US 8,673,632、US 7,259,150和美国专利申请公布号2004/0242516中公开的那些，所述参考案全部以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，化合物包含具有公开于WO 2013/177468中的SEQ ID NO 12-130、133、134中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含具有公开于US 8,673,632中的SEQ ID NO 11-45和85-96中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含具有公开于US 7,259,150中的SEQ ID NO 11-45中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。在某些实施方案中，化合物包含具有公开于美国专利申请公布号US 2004/0242516中的SEQ ID NO 7-41中的任一个的核碱基序列的反义寡核苷酸和本文所述的缀合物基团。以上提及的所有SEQ ID NO的核碱基序列以引用的方式并入本文。

某些实施方案提供用于降低apo(a)mRNA和蛋白质表达的化合物和方法。在某些实施方案中，化合物为用于治疗、预防或改善apo(a)相关疾病的apo(a)特异性抑制剂。在某些实施方案中，化合物为靶向apo(a)的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物为靶向apo(a)的反义寡核苷酸和缀合物基团。

某些实施方案提供用于降低Lp(a)水平的化合物和方法。在某些实施方案中，化合物为用于治疗、预防或改善Lp(a)相关疾病的apo(a)特异性抑制剂。在某些实施方案中，化合物为靶向apo(a)的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物为靶向apo(a)的反义寡核苷酸和缀合物基团。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成。在某些实施方案中，具有缀合物基团的修饰寡核苷酸由15至30、18至24、19至22、13至25、14至25、15至25个连接核苷组成。在某些实施方案中，具有缀合物基团的修饰寡核苷酸包含至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或30个连接核苷。在某些实施方案中，具有缀合物基团的修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-4中的任一个的等长度部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)区段的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸包含与例如实施例114和117中所示的靶区段中的任一个的等长度部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基。在表中，“起始位点”是指靶区段的最5’核苷酸并且“终止位点”是指靶区段的最3’核苷酸。靶区段的范围可从表中列出的每个序列的起始位点到终止位点。或者，靶区段的范围可为从一个序列的起始位点起并结束于另一序列的终止位点。例如，如表125中所示，靶区段的范围可为3901-3920，SEQ ID NO：58的起始位点至终止位点。在另一个实例中，如表125中所示，靶区段的范围可为3900-3923，SEQ ID NO：57的起始位点至SEQ ID NO：61的终止位点。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1-4中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与例如实施例114和117中所示的靶区段中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包含含有与SEQ ID NO：1的核碱基3901至3920的等长度部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1至少80％互补。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包含含有与SEQ ID NO：1的核碱基3900至3923的等长度部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或30个连续核碱基的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1至少80％互补。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：12-130、133、134的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：12-130、133、134的核碱基序列中的任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：12-130、133、134中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：12-20、22-33、35-44、47-50、51、53、57-62、65-66、68、70-79、81、85-86、89-90、92-94、97、105-110、103-104、133-134中的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：12-20、22-33、35-44、47-50、51、53、57-62、65-66、68、70-79、81、85-86、89-90、92-94、97、105-110、103-104、133-134的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：12-19、26-30、32、35、38-44、46-47、50、57-58、61、64-66、68、72-74、76-77、92-94、103-110的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：12-19、26-30、32、35、38-44、46-47、50、57-58、61、64-66、68、72-74、76-77、92-94、103-110的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：111、114-121、123-129的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：111、114-121、123-129的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：14、17、18、26-28、39、71、106-107的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：14、17、18、26-28、39、71、106-107的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：14、26-29、39-40、82的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：14、26-29、39-40、82的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：14、16-18的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ IDNO：14、16-18的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：26-27、107的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQID NO：26-27、107的核碱基中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：28-29、39-40、47的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：28-29、39-40、47的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：28、93、104、134的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：28、93、104、134的核碱基序列中的任一个和缀合物基团组成。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：58的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，具有缀合物基团的修饰寡核苷酸具有包含SEQ ID NO：58的核碱基序列的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，化合物由SEQ ID NO：58和缀合物基团组成。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有5’-X的修饰寡核苷酸ISIS 494372，其中X为包含GalNAc的缀合物基团。在某些实施方案中，反义化合物由具有5’-X的修饰寡核苷酸ISIS 494372组成，其中X为包含GalNAc的缀合物基团。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681251。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681251组成。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681257。在某些实施方案中，反义化合物由缀合的修饰寡核苷酸ISIS 681257组成。

在某些实施方案中，本公开提供由以下结构表示的缀合反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含具有SEQ ID NO：58的核碱基序列的修饰寡核苷酸，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。在某些实施方案中，反义化合物由具有SEQ ID NO：58的核碱基序列的修饰寡核苷酸组成，其中5’-GalNAc在翼的糖模式上具有可变性。

其中R

并且对于同一环上的每一对R

并且R

并且Z选自S

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸为单链的。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中至少一个核苷间键联为修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，所述修饰寡核苷酸的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的糖。在某些实施方案中，修饰的糖为双环糖。在某些实施方案中，修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基、受限的乙基、3’-氟-HNA或4’-(CH

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含：(a)由连接脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由连接核苷组成的5’翼区段；(c)由连接核苷组成的3’翼区段，并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且包含：(a)由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由五个连接核苷组成的5’翼区段；(c)由五个连接核苷组成的3’翼区段，并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：12-130、133、134中的任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸包含：(a)由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由五个连接核苷组成的5’翼区段；(c)由五个连接核苷组成的3’翼区段，并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

某些实施方案提供包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：58的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸包含：(a)由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由五个连接核苷组成的5’翼区段；(c)由五个连接核苷组成的3’翼区段，并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

某些实施方案提供靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有SEQ ID NO：58的核碱基序列，其中修饰寡核苷酸包含：(a)由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由五个连接核苷组成的5’翼区段；(c)由五个连接核苷组成的3’翼区段，并且其中缺口区段定位在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的5’端连接至修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的3’端连接至修饰寡核苷酸。

在某些实施方案中，缀合物基团包含一个或多个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含两个或更多个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含三个或更多个配体。在某些实施方案中，缀合物基团包含三个配体。在某些实施方案中，每个配体选自：多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4，6-二脱氧-4-甲酰胺基-2，3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2，3，4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3，4，6，7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1，5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2，5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。

在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。

在某些实施方案中，缀合物基团包含选自以下的结构：

其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

在某些实施方案中，缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：

其中L为磷连接基团或中性连接基团；

Z1为C(＝O)O-R2；

Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；

R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且

每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

在某些实施方案中，缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：

其中Z2为H或CH3；并且

每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

在某些实施方案中，缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：

其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

在某些实施方案中，缀合物基团共价连接至修饰寡核苷酸。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中：

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；

每个n独立地为0或1；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且

每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合物接头包含吡咯烷。在某些实施方案中，缀合物接头不包含吡咯烷。在某些实施方案中，缀合物接头包含PEG。在某些实施方案中，缀合物接头包含酰胺。在某些实施方案中，缀合物接头包含至少两个酰胺。在某些实施方案中，缀合物接头不包含酰胺。在某些实施方案中，缀合物接头包含聚酰胺。在某些实施方案中，缀合物接头包含胺。在某些实施方案中，缀合物接头包含一个或多个二硫键。在某些实施方案中，缀合物接头包含蛋白质结合部分。在某些实施方案中，蛋白质结合部分包含脂质。

在某些实施方案中，蛋白质结合部分选自：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂草配基、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。

在某些实施方案中，蛋白质结合部分选自：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

其中n为1至20。

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。

在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构之一：

其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且

每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构之一：

其中每个A1独立地为O、S、C＝O或NH；并且

每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：

在某些实施方案中，支链基团包含醚。

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：

每个n独立地为1至20；并且

m为2至6。

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：

在某些实施方案中，支链基团具有以下结构：

在某些实施方案中，支链基团包含：

其中每个j为1至3的整数；并且

其中每个n为1至20的整数。

在某些实施方案中，支链基团包含：

在某些实施方案中，每个系链选自以下：

其中L选自磷连接基团和中性连接基团；

Z1为C(＝O)O-R2；

Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；

R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且

每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。

在某些实施方案中，每个系链选自以下：

其中Z2为H或CH3；并且

每个m2独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m2大于0。

在某些实施方案中，每个系链选自以下：

其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

在某些实施方案中，至少一个系链包含乙二醇。在某些实施方案中，至少一个系链包含酰胺。在某些实施方案中，至少一个系链包含聚酰胺。在某些实施方案中，至少一个系链包含胺。在某些实施方案中，至少两个系链彼此不同。在某些实施方案中，所有系链彼此相同。在某些实施方案中，每个系链选自以下：

其中每个n独立地为1至20；并且

每个p为1至约6。

在某些实施方案中，每个系链选自以下：

在某些实施方案中，每个系链具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，每个系链具有以下结构：

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，配体为半乳糖。在某些实施方案中，配体为甘露糖-6-磷酸。

在某些实施方案中，每个配体选自：

其中每个R1选自OH和NHCOOH。

在某些实施方案中，每个配体选自：

在某些实施方案中，每个配体具有以下结构：

在某些实施方案中，每个配体具有以下结构：

在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分。

在某些实施方案中，缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：

其中每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：

在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，细胞靶向部分具有以下结构：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

在某些实施方案中，细胞靶向部分包含：

其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

在某些实施方案中，缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺或酯。

在某些实施方案中，缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。

在某些实施方案中，缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中缀合物基团包含处于缀合物基团与寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合物基团包含酰胺可裂解部分。在某些实施方案中，缀合物基团包含酯可裂解部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，化合物具有以下结构：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，缀合物基团包含：

其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些实施方案中，Bx选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，Bx为腺嘌呤。在某些实施方案中，Bx为胸腺嘧啶。在某些实施方案中，Q13为O(CH2)2-OCH3。在某些实施方案中，Q13为H。

在某些实施方案中，化合物呈盐形式。在某些实施方案中，化合物还包含药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中，化合物包含靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团或其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

某些实施方案提供包含如本文所述的缀合反义化合物的组合物，其中化合物的粘度水平小于40厘泊(cP)。在某些实施方案中，如本文所述的缀合反义化合物由于通过如实施例125中所述的参数测量时为小于40cP、小于35cP、小于30cP、小于25cP、小于20cP或小于15cP的粘度而有效。

某些实施方案提供组合物和方法，其包括向动物施用本文公开的缀合反义化合物或组合物。在某些实施方案中，施用所述缀合反义化合物预防、治疗、改善心血管、代谢和/或炎性疾病或减慢其进展。

某些实施方案提供用于治疗apo(a)相关疾病、病症或病状的疗法中的组合物和方法。某些实施方案提供用于治疗Lp(a)相关疾病、病症或病状的疗法中的组合物和方法。在某些实施方案中，apo(a)和/或Lp(a)水平在动物中是升高的。在某些实施方案中，组合物为包含apo(a)特异性抑制剂的化合物。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂为核酸。在某些实施方案中，核酸为反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物为靶向apo(a)的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，反义化合物为靶向apo(a)的修饰寡核苷酸和缀合物基团。在某些实施方案中，具有缀合物基团的靶向apo(a)的修饰寡核苷酸被用于治疗、预防、改善心血管和/或代谢疾病、病症或病状、减慢其进展。在某些实施方案中，用于疗法的组合物和方法包括向有此需要的个体施用apo(a)特异性抑制剂。

某些实施方案提供用于降低apo(a)水平的组合物和方法。某些实施方案提供用于降低Lp(a)水平的组合物和方法。在某些实施方案中，降低组织、器官或受试者中的apo(a)水平改善LDL与HDL之比或TG与HDL之比。某些实施方案提供降低动物中apo(a)mRNA或蛋白质表达的组合物和方法，其包括向动物施用本文公开的缀合反义化合物或组合物以降低动物中的apo(a)mRNA或蛋白质表达。某些实施方案提供降低动物中Lp(a)水平的组合物和方法，其包括向动物施用本文公开的缀合反义化合物或组合物以降低动物中的apo(a)mRNA或蛋白质表达。

某些实施方案提供用于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善有此需要的受试者的apo(a)相关疾病、病症和病状的组合物和方法。某些实施方案提供用于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善有此需要的受试者的Lp(a)相关疾病、病症和病状的组合物和方法。在某些实施方案中，所述疾病、病症和病状包括炎性、心血管和/或代谢疾病、病症和病状。某些所述心血管疾病、病症或病状包括但不限于主动脉瓣狭窄、动脉瘤(例如腹主动脉瘤)、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管疾病、冠状动脉疾病、冠心病、血脂异常、高胆固醇血症、高脂血症、高血压、高甘油三脂血症、心肌梗塞、外周血管疾病(例如外周动脉疾病、外周动脉闭塞性疾病)、视网膜血管阻塞或中风。某些所述代谢疾病、病症或病状包括但不限于高血糖症、前驱糖尿病、糖尿病(I型和II型)、肥胖症、胰岛素抗性、代谢综合征和糖尿病性血脂异常。某些所述炎性疾病、病症或病状包括但不限于主动脉瓣狭窄、冠状动脉疾病(CAD)、阿兹海默氏病和血栓栓塞疾病、病症或病状。某些血栓栓塞疾病、病症或病状包括但不限于中风、血栓形成(例如静脉血栓栓塞)、心肌梗塞和外周血管疾病。某些实施方案提供用于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善主动脉瓣狭窄的组合物和方法。

某些实施方案提供减少心血管疾病、病症或病状的至少一个症状的方法。在某些实施方案中，症状包括但不限于心绞痛、胸痛、呼吸短促、心悸、虚弱、头晕、恶心、出汗、心动过速、心动过缓、心律失常、心房纤维性颤动、下肢肿胀、发绀、疲劳、昏晕、面部发麻、四肢发麻、跛行或肌肉抽筋、腹部鼓胀和发热。某些实施方案提供减少主动脉瓣狭窄的至少一个症状的方法。

在某些实施方案中，apo(a)或Lp(a)表达的调节发生在细胞、组织或器官中。在某些实施方案中，调节发生在动物的细胞、组织或器官中。在某些实施方案中，调节是apo(a)mRNA水平的降低。在某些实施方案中，调节是apo(a)蛋白水平的降低。在某些实施方案中，apo(a)mRNA和蛋白质都被降低。在某些实施方案中，调节是Lp(a)水平的降低。所述降低可以时间相关性或剂量相关性方式进行。

在某些实施方案中，受试者或动物为人。

在某些实施方案中，缀合反义化合物是肠胃外施用的。在另外的实施方案中，肠胃外施用是皮下的。

在某些实施方案中，缀合反义化合物与第二药剂或疗法共同施用。在某些实施方案中，缀合反义化合物或组合物以及第二药剂伴随施用。

在某些实施方案中，第二药剂为降血糖剂。在某些实施方案中，第二药剂为降LDL、TG或胆固醇剂。在某些实施方案中，第二药剂为抗炎剂。在某些实施方案中，第二药剂为阿兹海默氏病药物。在某些实施方案中，第二药剂可以是但不限于非类固醇抗炎药(NSAID如阿司匹林)、尼克酸(例如Niaspan)、烟酸、apoB抑制剂(例如，Mipomersen)、CETP抑制剂(例如，Anacetrapib)、apo(a)抑制剂、甲状腺激素类似物(例如，Eprotirome)，HMG-辅酶A还原酶抑制剂(例如他汀类))、贝特类(如Gemfibrozil)和微粒体甘油三酯转移蛋白抑制剂(例如，Lomitapide)。疗法可为但不限于Lp(a)血浆分离置换法。试剂或疗法可共同施用或同时施用。试剂或疗法可相继或随后施用。

某些实施方案提供靶向apo(a)的缀合反义化合物用于降低动物中的apo(a)水平的用途。某些实施方案提供靶向apo(a)的缀合反义化合物用于降低动物中的Lp(a)水平的用途。某些实施方案提供靶向apo(a)的缀合反义化合物用于治疗、预防或改善与apo(a)相关的疾病、病症或病状的用途。某些实施方案提供靶向apo(a)的缀合反义化合物用于治疗、预防或改善与Lp(a)相关的疾病、病症或病状的用途。

某些实施方案提供靶向apo(a)的缀合反义化合物用于制备降低动物中apo(a)水平的药物的用途。某些实施方案提供靶向apo(a)的缀合反义化合物用于制备降低动物中Lp(a)水平的药物的用途。某些实施方案提供缀合反义化合物用于制备用于治疗、预防或改善与apo(a)相关的疾病、病症或病状的药物的用途。某些实施方案提供缀合反义化合物用于制备用于治疗、预防或改善与Lp(a)相关的疾病、病症或病状的药物的用途。

某些实施方案提供如本文所述的缀合反义化合物用于制备用于治疗、改善、延迟或预防与apo(a)和/或Lp(a)相关的疾病中的一种或多种的药物的用途。

某些实施方案提供用于治疗、预防或改善如本文所述的疾病、病症或病状的试剂盒，其中试剂盒包括：(i)如本文所述的apo(a)特异性抑制剂；以及任选地(ii)如本文所述的第二药剂或疗法。

本发明的试剂盒还可包括用于通过如本文所述的联合疗法来使用试剂盒治疗、预防或改善如本文所述的疾病、病症或病状的说明书。

B.

在某些实施方案中，本发明提供缀合反义化合物，所述缀合反义化合物包含反义寡核苷酸和缀合物。

a.

在某些实施方案中，本发明提供反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸包含连接核苷，每个核苷包含糖部分和核碱基。可根据化学特征(例如，修饰和修饰的模式)和核碱基序列(例如，反义寡核苷酸的序列、靶核酸的身份和序列)来考虑所述反义寡核苷酸的结构。

i.

在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个修饰。在某些所述实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷和/或修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。

1.

在某些实施方案中，本公开的化合物包含一个或多个修饰核苷，所述修饰核苷包含修饰的糖部分。相对于仅包含包含有天然存在的糖部分的核苷的寡核苷酸，包含一个或多个糖修饰的核苷的所述化合物可具有希望的性质，如增强的核酸酶稳定性或增大的与靶核酸的结合亲合力。在某些实施方案中，修饰的糖部分为取代的糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。所述糖替代物可包含对应于取代的糖部分的那些取代的一个或多个取代。

在某些实施方案中，修饰的糖部分为包含一个或多个非桥联糖取代基的取代的糖部分，包括但不限于在2’位和/或5’位上的取代基。适于2’-位的糖取代基的实例包括但不限于：2’-F、2′-OCH

包含2’-取代的糖部分的核苷称为2’-取代的核苷。在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含选自以下的2′-取代基：卤代基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF

在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、NH

在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2’-取代基：F、OCF

在某些实施方案中，2’-取代的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自以下的2’-取代基：F、O-CH

某些修饰的糖部分包含桥联糖取代基，所述桥联糖取代基形成第二个环，从而产生双环糖部分。在某些所述实施方案中，双环糖部分在4′呋喃糖环原子与2′呋喃糖环原子之间包含桥联。所述4’至2’糖取代基的实例包括但不限于：-[C(R

在某些实施方案中，所述4’至2’桥联独立地包含1至4个连接的基团，所述基团独立地选自以下：-[C(R

其中：

x为0、1或2；

n为1、2、3或4；

每个R

每个J

包含双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。双环核苷包括但不限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH

其中Bx为核碱基部分并且R独立地为H、保护基或C

另外的双环糖部分为本领域中已知的，例如：Singh等，Chem.Commun.，1998，4，455-456；Koshkin等，Tetrahedron，1998，54，3607-3630；Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638；Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222；Singh等，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039；Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.，129(26)8362-8379(2007年7月4日)；Elayadi等，Curr.OpinionInvens.Drugs，2001，2，558-561；Braasch等，Chem.Biol.，2001，8，1-7；Orum等，Curr.Opinion Mol.Ther.，2001，3，239-243；美国专利号7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、6,670,461和7,399,845；WO 2004/106356、WO1994/14226、WO 2005/021570和WO 2007/134181；美国专利公布号US2004/0171570、US2007/0287831和US2008/0039618；美国专利序列号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154和PCT/US2008/068922。

在某些实施方案中，双环糖部分和掺入所述双环糖部分的核苷通过异构构型进一步定义。例如，包含4’-2’亚甲基-氧基桥联的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。先前，已将α-L-亚甲基氧基(4’-CH

在某些实施方案中，取代的糖部分包含一个或多个非桥联糖取代基和一个或多个桥联糖取代基(例如，5’-取代的糖和4’-2’桥联的糖)。(参见，11/22/07公布的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5′-甲基或5′-乙烯基取代)。

在某些实施方案中，修饰的糖部分为糖替代物。在某些所述实施方案中，天然存在的糖的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在某些所述实施方案中，所述修饰的糖部分还包含如上所述的桥联取代基和/或非桥联取代基。例如，某些糖替代物包含4’-硫原子和2′-位(参见，例如，2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005/0130923)和/或5’位上的取代。通过另外举例的方式，具有4′-2′桥联的碳环双环核苷已有所描述(参见，例如，Freier等，Nucleic Acids Research，1997，25(22)，4429-4443和Albaek等，J.Org.Chem.，2006，71，7731-7740)。

在某些实施方案中，糖替代物包含具有除了5个原子以外的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含吗啉代。吗啉代化合物及其在低聚化合物中的用途已报道于许多专利和出版的文章中(参见例如：Braasch等，Biochemistry，2002，41，4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444和5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”意指具有以下结构的糖替代物：

在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。

对于另一个实例，在某些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃。所述四氢吡喃可被进一步修饰或取代。包含所述修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann，CJ.Bioorg.&Med.Chem.(2002)10：841-854)、氟代HNA(F-HNA)以及具有式VI的那些化合物：

其中独立地对于式VI的所述至少一个四氢吡喃核苷类似物中的每一个：

Bx为核碱基部分；

T

q

R

在某些实施方案中，提供了式VI的修饰的THP核苷，其中q

许多其它双环和三环糖替代物环系统也为本领域中已知的，其可用来修饰核苷以掺入到反义化合物中(参见，例如，综述文章：Leumann，J.C，Bioorganic&MedicinalChemistry，2002，10，841-854)。

还提供了修饰的组合，不限于如2′-F-5′-甲基取代的核苷(对于其它公开的5′，2′-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2′-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5′-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4′-CH

在某些实施方案中，本公开提供了包含修饰核苷的寡核苷酸。那些修饰核苷酸可包括修饰的糖、修饰的核碱基和/或修饰的键联。选择具体的修饰，使得所得到的寡核苷酸具有希望的特征。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个RNA样核苷。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个DNA样核苷酸。

2.

在某些实施方案中，本公开的核苷包含一个或多个未修饰核碱基。在某些实施方案中，本公开的核苷包含一个或多个修饰核碱基。

在某些实施方案中，修饰核碱基选自以下：通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸膨胀碱基以及如本文所定义的氟化碱基。5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH

教导某些上述修饰核碱基以及其它修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于U.S.3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096，某些所述美国专利与本申请共有，并且所述美国专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。

3.

在某些实施方案中，本公开提供了包含连接核苷的寡核苷酸。在所述实施方案中，核苷可使用任何核苷间键联连接在一起。通过磷原子的存在或不存在来定义两大类核苷间连接基团。代表性含磷核苷间键联包括但不限于磷酸二酯(PO)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯(PS)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH

本文描述的寡核苷酸含有一个或多个不对称中心并且因此产生对映异构体、非对映异构体和可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)、a或b如对于糖端基异构体或定义为(D)或(L)如对于氨基酸等的其它立体异构构型。在本文提供的反义化合物中包括所有所述可能的异构体以及其外消旋形式和光学纯形式。

中性核苷间键联包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3′-CH

4.

在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷(例如，包含修饰的糖和/或修饰的核碱基的核苷)和/或一个或多个修饰的核苷间键联。寡核苷酸上的所述修饰的模式在本文中称为基序。在某些实施方案中，糖、核碱基和键联基序彼此独立。

a.

在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或糖修饰基序沿着寡核苷酸或其区域布置的一种或多种类型的修饰的糖部分和/或天然存在的糖部分。所述基序可包括本文讨论的任何糖修饰和/或其它已知的糖修饰。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有缺口聚物糖基序的区域或由所述区域组成，所述缺口聚物糖基序包含两个外部区域或“翼”以及中心或内部区域或“缺口”。缺口聚物糖基序的三个区域(5’-翼、缺口和3’-翼)形成连续的核苷序列，其中每个翼的核苷的至少一些糖部分不同于缺口的核苷的至少一些糖部分。确切来说，每个翼的核苷的至少最接近缺口的糖部分(5’-翼的最3’核苷和3’-翼的最5’核苷)不同于邻近缺口核苷的糖部分，从而限定了翼与缺口之间的边界。在某些实施方案中，缺口内的糖部分彼此相同。在某些实施方案中，缺口包括一个或多个核苷，所述核苷具有不同于缺口的一个或多个其它核苷的糖部分的糖部分。在某些实施方案中，两翼的糖基序彼此相同(对称的糖缺口聚物)。在某些实施方案中，5′-翼的糖基序不同于3′-翼的糖基序(不对称的糖缺口聚物)。

i.某些5’-翼

在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至7个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至6个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由3至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由4或5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1至3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1或2个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2至4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2或3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由3或4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由1个核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由2个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼由6个连接核苷组成。

在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少两个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少三个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少四个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个LNA核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为约束乙基核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为LNA核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为2’-OMe核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个核糖核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼的每个核苷均为核糖核苷。在某些实施方案中，5’-翼的核苷中的一个、多于一个、或每一个为RNA样核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-脱氧核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的5’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-脱氧核苷。

ii.某些3’-翼

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至7个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至6个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由3至5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由4或5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1至3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1或2个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2至4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2或3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由3或4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由1个核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由2个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由3个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由4个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由5个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼由6个连接核苷组成。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为双环核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为约束乙基核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为LNA核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少两个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少三个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少四个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为2’-OMe核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个核糖核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼的每个核苷均为核糖核苷。在某些实施方案中，5’-翼的核苷中的一个、多于一个、或每一个为RNA样核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷和至少一个2’-脱氧核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷和至少一个2’-脱氧核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一个非双环修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一个2’-取代的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一个2’-MOE核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一个2’-OMe核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷和至少一个2’-脱氧核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个非双环修饰核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷、至少一个非双环修饰核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个非双环修饰核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个2’-取代的核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷、至少一个2’-取代的核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个2’-取代的核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个2’-MOE核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷、至少一个2’-MOE核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个2’-MOE核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。

在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个双环核苷、至少一个2’-OMe核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个约束乙基核苷、至少一个2’-OMe核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的3’-翼包含至少一个LNA核苷、至少一个2’-OMe核苷以及至少一个2’-脱氧核苷。

iii.某些中心区(缺口)

在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至20个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至15个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至12个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至10个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6至8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6或7个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由7至10个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由7至9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由7或8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由8至10个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由8或9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由6个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由7个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由8个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由9个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由10个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由11个连接核苷组成。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口由12个连接核苷组成。

在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的每个核苷均为2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的每个核苷均为2’-脱氧核苷或为“DNA样”的修饰核苷。在所述实施方案中，“DNA样”意指核苷具有与DNA类似的特征，使得包含缺口聚物和RNA分子的双链体能够激活RNA酶H。例如，在某些条件下，2’-(ara)-F已显示支持RNA酶H激活，并且因此为DNA样的。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的一个或多个核苷不为2’-脱氧核苷并且不为DNA样的。在某些所述实施方案中，尽管如此，缺口聚物仍然支持RNA酶H激活(例如，凭借非DNA核苷的数目或位置)。

在某些实施方案中，缺口包含被一个或多个修饰核苷中断的未修饰的2’-脱氧核苷的链段(stretch)，从而产生三个子区(两个具有一个或多个2’-脱氧核苷的链段和一个具有一个或多个中断的修饰核苷的链段)。在某些实施方案中，未修饰的2’-脱氧核苷的链段不长于5、6或7个核苷。在某些实施方案中，通过使用短缺口区来实现所述短链段。在某些实施方案中，通过中断较长的缺口区来实现短链段。

在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含选自以下的一个或多个修饰核苷：cEt、FHNA、LNA和2-硫代-胸苷。在某些实施方案中，缺口包含一个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含选自以下的5’-取代的糖部分：5’-Me和5’-(R)-Me。在某些实施方案中，缺口包含两个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含三个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含四个修饰核苷。在某些实施方案中，缺口包含两个或更多个修饰核苷并且每个修饰核苷是相同的。在某些实施方案中，缺口包含两个或更多个修饰核苷并且每个修饰核苷是不同的。

在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰的键联。在某些实施方案中，缺口包含一个或多个甲基膦酸酯键联。在某些实施方案中，缺口包含两个或更多个修饰的键联。在某些实施方案中，缺口包含一个或多个修饰的键联和一个或多个修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口包含一个修饰的键联和一个修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口包含两个修饰的键联和两个或更多个修饰的核苷。

b.

在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区域布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区域。在某些实施方案中，本公开的寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区域。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少7个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少9个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少11个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少12个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少13个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少14个硫代磷酸酯核苷间键联。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少7个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少9个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸至少包含具有至少一种12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于15个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于14个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于13个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于12个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于11个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于9个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于7个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含少于5个硫代磷酸酯核苷间键联。

c.

在某些实施方案中，寡核苷酸包含对以限定的模式或核碱基修饰基序沿着寡核苷酸或其区域布置的核碱基的化学修饰。在某些所述实施方案中，核碱基修饰以有缺口的基序布置。在某些实施方案中，核碱基修饰以交替基序布置。在某些实施方案中，每个核碱基均为修饰的。在某些实施方案中，没有一个核碱基为化学修饰的。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含修饰核碱基的嵌段。在某些所述实施方案中，嵌段处于寡核苷酸的3’-末端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’-末端的3个核苷酸内。在某些所述实施方案中，嵌段处于寡核苷酸的5’-末端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的5’-末端的3个核苷酸内。

在某些实施方案中，核碱基修饰随寡核苷酸的具体位置上的天然碱基变化。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸中的每个嘌呤或每个嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个腺嘌呤均为修饰的。在某些实施方案中，每个鸟嘌呤均为修饰的。在某些实施方案中，每个胸腺嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个胞嘧啶均为修饰的。在某些实施方案中，每个尿嘧啶均为修饰的。

在某些实施方案中，寡核苷酸中的一些、所有或没有一个胞嘧啶部分为5-甲基胞嘧啶部分。在本文中，5-甲基胞嘧啶不为“修饰核碱基”。因此，除非另外指出，否则未修饰的核碱基包括具有5-甲基的胞嘧啶残基和缺乏5甲基的那些胞嘧啶残基。在某些实施方案中，指定了所有或一些胞嘧啶核碱基的甲基化状态。

在某些实施方案中，对核碱基的化学修饰包括将某些缀合物基团连接至核碱基。在某些实施方案中，寡核苷酸中的每个嘌呤或每个嘧啶可任选地被修饰以包含缀合物基团。

d.

在某些实施方案中，本公开提供了具有各种长度范围中的任何一个的寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸由X至Y个连接核苷组成，其中X表示范围内的最小核苷数并且Y表示范围内的最大核苷数。在某些所述实施方案中，X和Y各自独立地选自：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50；前提是X≤Y。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸可由8至9、8至10、8至11、8至12、8至13、8至14、8至15、8至16、8至17、8至18、8至19、8至20、8至21、8至22、8至23、8至24、8至25、8至26、8至27、8至28、8至29、8至30、9至10、9至11、9至12、9至13、9至14、9至15、9至16、9至17、9至18、9至19、9至20、9至21、9至22、9至23、9至24、9至25、9至26、9至27、9至28、9至29、9至30、10至11、10至12、10至13、10至14、10至15、10至16、10至17、10至18、10至19、10至20、10至21、10至22、10至23、10至24、10至25、10至26、10至27、10至28、10至29、10至30、11至12、11至13、11至14、11至15、11至16、11至17、11至18、11至19、11至20、11至21、11至22、11至23、11至24、11至25、11至26、11至27、11至28、11至29、11至30、12至13、12至14、12至15、12至16、12至17、12至18、12至19、12至20、12至21、12至22、12至23、12至24、12至25、12至26、12至27、12至28、12至29、12至30、13至14、13至15、13至16、13至17、13至18、13至19、13至20、13至21、13至22、13至23、13至24、13至25、13至26、13至27、13至28、13至29、13至30、14至15、14至16、14至17、14至18、14至19、14至20、14至21、14至22、14至23、14至24、14至25、14至26、14至27、14至28、14至29、14至30、15至16、15至17、15至18、15至19、15至20、15至21、15至22、15至23、15至24、15至25、15至26、15至27、15至28、15至29、15至30、16至17、16至18、16至19、16至20、16至21、16至22、16至23、16至24、16至25、16至26、16至27、16至28、16至29、16至30、17至18、17至19、17至20、17至21、17至22、17至23、17至24、17至25、17至26、17至27、17至28、17至29、17至30、18至19、18至20、18至21、18至22、18至23、18至24、18至25、18至26、18至27、18至28、18至29、18至30、19至20、19至21、19至22、19至23、19至24、19至25、19至26、19至29、19至28、19至29、19至30、20至21、20至22、20至23、20至24、20至25、20至26、20至27、20至28、20至29、20至30、21至22、21至23、21至24、21至25、21至26、21至27、21至28、21至29、21至30、22至23、22至24、22至25、22至26、22至27、22至28、22至29、22至30、23至24、23至25、23至26、23至27、23至28、23至29、23至30、24至25、24至26、24至27、24至28、24至29、24至30、25至26、25至27、25至28、25至29、25至30、26至27、26至28、26至29、26至30、27至28、27至29、27至30、28至29、28至30或29至30个连接核苷组成。在其中化合物的寡核苷酸的核苷数限制至一定范围或具体数字的实施方案中，化合物仍然还可包含另外的其它取代基。例如，包含8-30个核苷的寡核苷酸不包括具有31个核苷的寡核苷酸，但是，除非另外指出，否则这样的寡核苷酸还可包含例如一个或多个缀合物基团、端基或其它取代基。

另外，在通过总长度范围和通过具有指定长度的区域来描述寡核苷酸时并且在区域的指定长度的总和小于总长度范围的上限时，寡核苷酸可具有超出指定区域的那些核苷的另外的核苷，前提是核苷的总数不超过总长度范围的上限。

5.

在某些实施方案中，反义寡核苷酸的化学结构特征通过其糖基序、核苷间键联基序、核碱基修饰基序和总长度来表征。在某些实施方案中，所述参数各自彼此独立。因此，具有缺口聚物糖基序的寡核苷酸的每个核苷间键联均可为修饰或未修饰的并且可或可不遵循糖修饰的缺口聚物修饰模式。因此，糖-缺口聚物的翼区内的核苷间键联可为彼此相同或不同的，并且可与缺口区的核苷间键联相同或不同。同样，所述糖-缺口聚物寡核苷酸可包含一个或多个独立于糖修饰的缺口聚物模式的修饰核碱基。本领域技术人员将了解，可将所述基序组合以产生各种寡核苷酸。

在某些实施方案中，核苷间键联和核苷修饰的选择彼此之间不是独立的。

i.

在某些实施方案中，本发明提供了具有与靶核酸互补的序列的反义寡核苷酸。所述反义化合物能够与靶核酸杂交，产生至少一种反义活性。在某些实施方案中，反义化合物与一种或多种靶核酸特异性杂交。在某些实施方案中，特异性杂交的反义化合物具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与靶核酸具有足够互补性以允许杂交和产生反义活性并且与任何非靶标具有不足够的互补性以便在希望特异性杂交的条件下(例如，在用于体内或治疗用途的生理条件下，和在体外测定的情况下进行测定的条件下)避免或减少与非靶核酸序列的非特异性杂交的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸在靶标与非靶标之间为选择性的，即使靶标和非靶标均包含靶序列。在所述实施方案中，选择性可由与另一种核酸分子相比一种核酸分子的靶区域的相对可接近性造成。

在某些实施方案中，本公开提供了包含寡核苷酸的反义化合物，所述寡核苷酸在寡核苷酸的整个长度上与靶核酸完全互补。在某些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸99％互补。在某些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸95％互补。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸90％互补。

在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸85％互补。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与靶核酸80％互补。在某些实施方案中，反义化合物包含与靶核酸完全互补并且在寡核苷酸的整个长度上与靶核酸至少80％互补的区域。在某些所述实施方案中，具有完全互补性的区域的长度为6至14个核碱基。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含杂交区和末端区。在某些所述实施方案中，杂交区由12-30个连接核苷组成并且与靶核酸完全互补。在某些实施方案中，相对于靶核酸，杂交区包括一个错配。在某些实施方案中，相对于靶核酸，杂交区包括两个错配。在某些实施方案中，相对于靶核酸，杂交区包括三个错配。在某些实施方案中，末端区由1-4个末端核苷组成。在某些实施方案中，末端核苷处于3’末端。在某些实施方案中，一个或多个末端核苷不与靶核酸互补。

反义机制包括涉及寡核苷酸与靶核酸的杂交的任何机制，其中杂交产生生物作用。在某些实施方案中，所述杂交导致靶核酸降解或占位并伴有细胞机器的抑制或刺激，涉及例如靶核酸的翻译、转录或剪接。

涉及靶RNA的降解的一种类型的反义机制为RNA酶H介导的反义。RNA酶H为裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物在哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶标的裂解，从而极大地增强了基因表达的DNA样寡核苷酸介导的抑制的效率。

在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些实施方案中，缀合物基团包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团包含接头。在某些实施方案中，接头包含蛋白质结合部分。在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分(也称为细胞靶向基团)。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含一个或多个系链。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含碳水化合物或碳水化合物聚簇。

ii.

在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分包含可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸。在某些所述实施方案中，可裂解部分直接连接至细胞靶向部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至缀合物接头。在某些实施方案中，可裂解部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷或核苷类似物。在某些实施方案中，核苷或核苷类似物包含选自以下的任选保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施方案中，可裂解部分为包含选自以下的任何保护的杂环碱基的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。在某些实施方案中，可裂解部分为2′-脱氧核苷，所述2′-脱氧核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3′位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2′-脱氧腺苷，所述2′-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3′位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2′-脱氧腺苷，所述2′-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3′位并且通过磷酸二酯键联连接至接头。

在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的3′位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的5′位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的2′位。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至接头。在某些实施方案中，缀合物基团不包括可裂解部分。

在某些实施方案中，在将复合物施用至动物之后，仅在被靶细胞内化之后，可裂解部分才被裂解。在细胞内部，可裂解部分裂解，从而释放活性反义寡核苷酸。虽然不希望受理论的束缚，但是据信可裂解部分在细胞内被一种或多种核酸酶裂解。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶裂解可裂解部分与接头之间的磷酸二酯键联。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：

其中Bx、Bx

iii.

在某些实施方案中，缀合物基团包含接头。在某些所述实施方案中，接头共价结合至可裂解部分。在某些所述实施方案中，接头共价结合至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，接头共价结合至细胞靶向部分。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接并且还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体(tethered ligand)的位置。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体的位置并且不连接至支链基团。在某些实施方案中，接头还包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括接头。

在某些实施方案中，接头包括至少线性基团，所述线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚(-S-)和羟氨基(-O-N(H)-)。在某些实施方案中，线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，线性基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷连接基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷酸二酯基团。在某些实施方案中，线性基团包括至少一个中性连接基团。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和可裂解部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和反义寡核苷酸。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分、固体载体和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团包括一个或多个可裂解键。

在某些实施方案中，接头包括共价连接至支架基团的线性基团。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支架包括至少一个单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支架包括至少两个单环系统或多环系统。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分和接头。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头、蛋白质结合部分和固体载体。在某些实施方案中，支架基团包括一个或多个可裂解键。

在某些实施方案中，接头包括蛋白质结合部分。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为脂质，例如像包括但不限于：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂草配基、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

其中n为1至20。

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且

每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

其中n为1至20。

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：

在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。

iv.

在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分。某些所述细胞靶向部分使反义化合物的细胞摄取增加。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链和一个或多个配体。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链、一个或多个配体以及一个或多个可裂解键。

1.

在某些实施方案中，缀合物基团包含靶向部分，所述靶向部分包含支链基团和至少两个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团连接缀合物接头。在某些实施方案中，支链基团连接可裂解部分。在某些实施方案中，支链基团连接反义寡核苷酸。在某些实施方案中，支链基团共价连接至接头和每个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团包含支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支链基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支链基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，支链基团包含单环系统或多环系统。在某些实施方案中，支链基团包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括支链基团。

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20；

j为1至3；并且

m为2至6。

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20；并且

m为2至6。

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

其中每个A

每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

其中每个A

每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

其中A

每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：

2.

在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至支链基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至连接基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺、磷酸二酯和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、磷酸二酯、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基和磷酸二酯。在某些实施方案中，每个系链包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。

在某些实施方案中，系链包括一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷酸二酯基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷连接基团或中性连接基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。

在某些实施方案中，每个系链在配体与支链基团之间包含约8至约20个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团在配体与支链基团之间包含约10至约18个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团包含约13个原子的链长。

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20；并且

每个p为1至约6。

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20。

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

其中L为磷连接基团或中性连接基团；

Z

Z

R

每个m

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

其中Z

每个m

在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，系链包含磷连接基团。在某些实施方案中，系链不包含任何酰胺键。在某些实施方案中，系链包含磷连接基团并且不包含任何酰胺键。

3.

在某些实施方案中，本公开提供了配体，其中每个配体共价连接至系链。在某些实施方案中，每个配体经过选择以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲合力。在某些实施方案中，选择对哺乳动物肝脏细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲合力的配体。在某些实施方案中，选择对肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲合力的配体。在某些实施方案中，每个配体为碳水化合物。在某些实施方案中，每个配体独立地选自半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及岩藻糖。在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施方案中，靶向部分包含2至6个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个N-乙酰基半乳糖胺配体。

在某些实施方案中，配体为碳水化合物、碳水化合物衍生物、改性的碳水化合物、多价碳水化合物聚簇、多糖、改性的多糖或多糖衍生物。在某些实施方案中，配体为氨基糖或硫代糖。例如，氨基糖可选自任何数目的本领域中已知的化合物，例如葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖(GalNAc)、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖(β-胞壁酸)、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4，6-二脱氧-4-甲酰氨基-2，3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖和N-磺基-D-葡糖胺以及N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫代糖可选自由以下组成的组：5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2，3，4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖以及3，4，6，7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1，5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯。

在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰基半乳糖胺。在某些实施方案中，“N-乙酰基半乳糖胺”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”’是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，其包括β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖可互换使用。因此，在其中描绘一种形式的结构中，这些结构也意图包括另一种形式。例如，在针对α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖示出结构时，该结构也意图包括另一种形式。在某些实施方案中，在某些优选的实施方案中，β形式2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖为优选的实施方案。

在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：

其中每个R

在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：

i.

在某些实施方案中，缀合物基团包含以上结构特征。在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20。

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Z为H或连接的固体载体；

Q为反义化合物；

X为O或S；并且

Bx为杂环碱基部分。

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些实施方案中，缀合物不包含吡咯烷。

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中X为具有六至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链。

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中X为具有十个连续键合的原子的取代或未取代的系链。

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中X为具有四至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链包含恰好一个酰胺键。

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中Y和Z独立地选自C

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中Y和Z独立地选自C

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中Y和Z独立地选自C

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中m和n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中m为4、5、6、7或8，并且n为1、2、3或4。

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中X为具有八个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中系链包含恰好一个酰胺键，并且其中X不包含醚基团。

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链由酰胺键和取代或未取代的C

在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中Y选自C

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中Y选自C

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中Y选自C

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。

在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：

其中n为4、5、6、7或8。

b.

在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：

其中

A为反义寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：

其中

A为反义寡核苷酸；

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。

在某些所述实施方案中，支链基团包含至少一个可裂解键。

在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。

在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：

其中

A为反义寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：

其中

A为反义寡核苷酸；

C为缀合物接头

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：

其中

A为反义寡核苷酸；

B为可裂解部分

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：

其中

A为反义寡核苷酸；

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。

在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：

在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：

教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其它修饰的制备的代表性美国专利、美国专利申请公布和国际专利申请公布包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、US 7,491,805、US 8,106,022、US 7,723,509、US 2006/0148740、US 2011/0123520、WO 2013/033230和WO 2012/037254，所述专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。

教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其它修饰的代表性出版物包括但不限于BIESSEN等，″The Cholesterol Derivativeof a Triantennary Galactoside with High Affinity for the HepaticAsialoglycoprotein Receptor：a Potent Cholesterol Lowering Agent″J.Med.Chem.(1995)38：1846-1852；BIESSEN等，″Synthesis of Cluster Galactosides with HighAffinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor″J.Med.Chem.(1995)38：1538-1546；LEE等，″New and more efficient multivalent glyco-ligands forasialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes″Bioorganic&MedicinalChemistry(2011)19：2494-2500；RENSEN等，″Determination of the Upper Size Limitfor Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor onHepatocytes in Vitro and in Vivo″J.Biol.Chem.(2001)276(40)：37577-37584；RENSEN等，″Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-TerminatedGlycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic AsialoglycoproteinReceptor″J.Med.Chem.(2004)47：5798-5808；SLIEDREGT等，″Design and Synthesis ofNovel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomesto the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor″J.Med.Chem.(1999)42：609-618以及Valentijn等，“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides withhigh affinity for the Asialoglycoprotein Receptor”Tetrahedron，1997，53(2)，759-770，所述参考文献中的每一个均以引用的方式整体并入本文。

在某些实施方案中，缀合反义化合物包含基于RNA酶H的寡核苷酸(如缺口聚物)或剪接调节寡核苷酸(如完全修饰的寡核苷酸)和包含至少一个、两个或三个GalNAc基团的任何缀合物基团。在某些实施方案中，缀合反义化合物包含见于任何以下参考文献中的任何缀合物基团：Lee，Carbohydr Res，1978，67，509-514；Connolly等，J Biol Chem，1982，257，939-945；Pavia等，Int J Pep Protein Res，1983，22，539-548；Lee等，Biochem，1984，23，4255-4261；Lee等，Glycoconjugate J，1987，4，317-328；Toyokuni等，Tetrahedron Lett，1990，31，2673-2676；Biessen等，J Med Chem，1995，38，1538-1546；Valentijn等，Tetrahedron，1997，53，759-770；Kim等，Tetrahedron Lett，1997，38，3487-3490；Lee等，Bioconjug Chem，1997，8，762-765；Kato等，Glycobiol，2001，11，821-829；Rensen等，JBiol Chem，2001，276，37577-37584；Lee等，Methods Enzymol，2003，362，38-43；Westerlind等，Glycoconj J，2004，21，227-241；Lee等，Bioorg Med Chem Lett，2006，16(19)，5132-5135；Maierhofer等，Bioorg Med Chem，2007，15，7661-7676；Khorev等，BioorgMed Chem，2008，16，5216-5231；Lee等，Bioorg Med Chem，2011，19，2494-2500；Kornilova等，Analyt Biochem，2012，425，43-46；Pujol等，Angew Chemie Int Ed Engl，2012，51，7445-7448；Biessen等，J Med Chem，1995，38，1846-1852；Sliedregt等，J Med Chem，1999，42，609-618；Rensen等，J Med Chem，2004，47，5798-5808；Rensen等，Arterioscler ThrombVasc Biol，2006，26，169-175；van Rossen berg等，Gene Ther，2004，11，457-464；Sato等，J Am Chem Soc，2004，126，14013-14022；Lee等，J Org Chem，2012，77，7564-7571；Biessen等，FASEB J，2000，14，1784-1792；Rajur等，Bioconjug Chem，1997，8，935-940；Duff等，Methods Enzymol，2000，313，297-321；Maier等，Bioconjug Chem，2003，14，18-29；Jayaprakash等，Org Lett，2010，12，5410-5413；Manoharan，Antisense Nucleic AcidDrug Dev，2002，12，103-128；Merwin等，Bioconjug Chem，1994，5，612-620；Tomiya等，Bioorg Med Chem，2013，21，5275-5281；国际申请WO1998/013381；WO2011/038356；WO1997/046098；WO2008/098788；WO2004/101619；WO2012/037254；WO2011/120053；WO2011/100131；WO2011/163121；WO2012/177947；WO2013/033230；WO2013/075035；WO2012/083185；WO2012/083046；WO2009/082607；WO2009/134487；WO2010/144740；WO2010/148013；WO1997/020563；WO2010/088537；WO2002/043771；WO2010/129709；WO2012/068187；WO2009/126933；WO2004/024757；WO2010/054406；WO2012/089352；WO2012/089602；WO2013/166121；WO2013/165816；美国专利4,751,219；8,552,163；6,908,903；7,262,177；5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；7,582,744；8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548；8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；已公布的美国专利申请公布US2011/0097264；US2011/0097265；US 2013/0004427；US2005/0164235；US2006/0148740；US2008/0281044；US2010/0240730；US2003/0119724；US2006/0183886；US2008/0206869；US2011/0269814；US2009/0286973；US2011/0207799；US2012/0136042；US2012/0165393；US2008/0281041；US2009/0203135；US2012/0035115；US2012/0095075；US2012/0101148；US2012/0128760；US2012/0157509；US2012/0230938；US2013/0109817；US2013/0121954；US2013/0178512；US2013/0236968；US2011/0123520；US2003/0077829；US2008/0108801以及US2009/0203132；所述参考文献中的每一个均以引用的方式整体并入。

C.

在某些实施方案中，缀合反义化合物表现出有效的体内靶RNA减少。在某些实施方案中，未缀合反义化合物在肾中积累。在某些实施方案中，缀合反义化合物在肝脏中积累。在某些实施方案中，缀合反义化合物为耐受良好的。所述性质使得缀合反义化合物特别有用于抑制许多靶RNA，包括但不限于涉及代谢、心血管和其它疾病、病症或病状的那些。因此，本文提供了通过使肝脏组织与靶向与所述疾病、病症或病状相关的RNA的缀合反义化合物接触来治疗所述疾病、病症或病状的方法。因此，还提供了用于使用本发明的缀合反义化合物来改善各种代谢、心血管和其它疾病、病症或病状中的任何一种的方法。

在某些实施方案中，缀合反义化合物在特定的组织浓度下比未缀合的对应物更有效。不希望受任何理论或机制的束缚，在某些实施方案中，缀合物可允许缀合反义化合物更有效地进入细胞或更有成效地进入细胞。例如，在某些实施方案中，缀合反义化合物与其未缀合的对应物相比可表现出更大的靶标减少，其中缀合反义化合物和其未缀合的对应物均以相同的浓度存在于组织中。例如，在某些实施方案中，缀合反义化合物与其未缀合的对应物相比可表现出更大的靶标减少，其中缀合反义化合物和其未缀合的对应物均以相同的浓度存在于肝脏中。

先前已讨论了寡核苷酸的产生性和非产生性摄取(参见例如Geary，R.S.，E.Wancewicz等(2009).″Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptakeand Pharmacologic Activity of a 2′-Methoxyethyl Modified Chimeric AntisenseOligonucleotide Targeting PTEN.″Biochem.Pharmacol.78(3)：284-91；&Koller，E.，T.M.Vincent等(2011).″Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modiiedantisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes.″Nucleic Acids Res.39(11)：4795-807)。本文描述的缀合物基团可改进产生性摄取。

在某些实施方案中，本文描述的缀合物基团可通过增加缀合反义化合物对特定类型的细胞或组织的亲合力来进一步改进效力。在某些实施方案中，本文描述的缀合物基团可通过增加一种或多种细胞表面受体对缀合反义化合物的识别来进一步改进效力。在某些实施方案中，本文描述的缀合物基团可通过促进缀合反义化合物的内吞作用来进一步改进效力。

在某些实施方案中，可裂解部分可通过允许缀合物在缀合反义化合物进入细胞之后从反义寡核苷酸中裂解来进一步改进效力。因此，在某些实施方案中，可以低于对未缀合的反义寡核苷酸来说将为必要的剂量施用缀合反义化合物。

先前已将硫代磷酸酯键联掺入到反义寡核苷酸中。所述硫代磷酸酯键联对核酸酶具有抗性并且因此改进了寡核苷酸的稳定性。此外，硫代磷酸酯键联还结合某些蛋白质，这导致反义寡核苷酸在肝脏中的积累。具有较少硫代磷酸酯键联的寡核苷酸在肝脏中积累较少并且在肾中积累较多(参见，例如Geary，R.，“Pharmacokinetic Properties of 2’-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats，”Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，第296卷，第3期，890-897；&Antisense aDrug Technology中的Pharmacological Properties of 2’-O-Methoxyethyl ModifiedOligonucleotides，第10章，Crooke，S.T.编著，2008)。在某些实施方案中，具有较少硫代磷酸酯核苷间键联和较多磷酸二酯核苷间键联的寡核苷酸在肝脏中积累较少并且在肾中积累较多。当治疗肝脏中的疾病时，出于以下若干原因这是不希望的：(1)较少药物到达希望作用的部位(肝脏)；(2)药物逸散到尿液中；以及(3)肾暴露于相对高浓度的药物，这可导致肾中毒。因此，对于肝脏疾病，硫代磷酸酯键联提供重要益处。

然而，在某些实施方案中，统一被硫代磷酸酯核苷间键联连接的寡核苷酸的施用诱发一种或多种促炎性反应。(参见例如：J Lab Clin Med.1996年9月；128(3)：329-38.“Amplification of antibody production by phosphorothioateoligodeoxynucleotides”。Branda等；并且还参见例如：Antisense a Drug Technology中的Toxicologic Properties，第12章，第342-351页，Crooke，S.T.编著，2008)。在某些实施方案中，其中大多数核苷间键联包含硫代磷酸酯核苷间键联的寡核苷酸的施用诱发一种或多种促炎性反应。

在某些实施方案中，促炎性作用的程度可取决于若干变量(例如骨架修饰、脱靶效应、核碱基修饰和/或核苷修饰)，参见例如：Antisense a Drug Technology中的Toxicologic Properties，第12章，第342-351页，Crooke，S.T.编著，2008)。在某些实施方案中，促炎性作用的程度可通过调节一个或多个变量来减轻。例如，给定寡核苷酸的促炎性作用的程度可通过用磷酸二酯核苷间键联替代任何数目的硫代磷酸酯核苷间键联并且由此减少硫代磷酸酯核苷间键联的总数来减轻。

在某些实施方案中，将希望减少硫代磷酸酯键联的数目，如果可以在不丧失稳定性并且不使分布从肝脏转移至肾的情况下实现的话。例如，在某些实施方案中，可通过用磷酸二酯键联替代硫代磷酸酯键联来减少硫代磷酸酯键联的数目。在这样一个实施方案中，具有较少硫代磷酸酯键联和较多磷酸二酯键联的反义化合物可诱发较少的促炎性反应或不诱导促炎性反应。虽然具有较少硫代磷酸酯键联和较多磷酸二酯键联的反义化合物可诱发较少的促炎性反应，但是具有较少硫代磷酸酯键联和较多磷酸二酯键联的反义化合物可以不在肝脏中积累并且与具有较多硫代磷酸酯键联的反义化合物相比在相同或类似的剂量下可为功效较小的。在某些实施方案中，因此希望设计具有多个磷酸二酯键和多个硫代磷酸酯键但还具有稳定性和对肝脏的良好分布的反义化合物。

在某些实施方案中，缀合反义化合物比未缀合的对应物在肝脏中积累更多并且在肾中积累更少，即使在一些硫代磷酸酯键联被较少促炎性的磷酸二酯核苷间键联替代时也是如此。在某些实施方案中，缀合反义化合物与其未缀合的对应物相比在肝脏中积累更多并且没有同样多地排泄到尿液中，即使在一些硫代磷酸酯键联被较少促炎性的磷酸二酯核苷间键联替代时也是如此。在某些实施方案中，缀合物的使用允许人们设计更有效并且耐受性更好的反义药物。事实上，在某些实施方案中，缀合反义化合物具有比未缀合的对应物更大的治疗指数。这允许缀合反义化合物在较高绝对剂量下施用，因为存在较小的促炎性应答风险和较小的肾毒性风险。这种较高剂量允许人们较不频繁地给药，因为预期清除(代谢)为类似的。此外，因为化合物更有效，如上所述，所以可允许浓度在下一次剂量之前变低而不失去治疗活性，从而允许给药之间的甚至更长的时间段。

在某些实施方案中，包括一些硫代磷酸酯键联仍是希望的。例如，末端键联易受到核酸外切酶的破坏，所以在某些实施方案中，那些键联为硫代磷酸酯或其它修饰的键联。连接两个脱氧核苷的核苷间键联易受到核酸内切酶的破坏，所以在某些实施方案中，那些键联为硫代磷酸酯或其它修饰的键联。修饰核苷与脱氧核苷(其中脱氧核苷在键联脱氧核苷的5’侧上)之间的核苷间键联易受到核酸内切酶的破坏，所以在某些实施方案中，那些键联为硫代磷酸酯或其它修饰的键联。某些类型的两个修饰核苷之间和脱氧核苷与某种类型的修饰核苷(其中修饰核苷处于键联的5’侧)之间的核苷间键联对核酸酶消化具有足够的抗性，键联可为磷酸二酯。

在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于16个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于15个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于14个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于13个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于12个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于11个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于10个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于9个硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，缀合反义化合物的反义寡核苷酸包含少于8个硫代磷酸酯键联。

在某些实施方案中，包含本文描述的一个或多个缀合物基团的反义化合物与缺乏所述一个或多个缀合物基团的母体反义化合物相比具有增加的活性和/或效力和/或耐受性。因此，在某些实施方案中，所述缀合物基团连接至寡核苷酸为希望的。所述缀合物基团可连接在寡核苷酸的5’-末端和/或3’-末端。在某些情况下，5’-末端的连接在合成上是希望的。通常，通过使用本领域中熟知的技术将3’末端核苷连接至固体载体并且从3’至5’依次偶联核苷来合成寡核苷酸。因此，如果希望缀合物基团位于3’-末端处，那么人们可(1)将缀合物基团连接至3’-末端核苷并且将所述缀合的核苷连接至固体载体用于随后寡核苷酸的制备或(2)在合成之后将缀合物基团连接至完全寡核苷酸的3’-末端核苷。这些方法中没有一个是非常有效的并且因此均为昂贵的。具体来说，虽然在本文的实施例中展示，但缀合核苷至固体载体的连接是低效的过程。在某些实施方案中，将缀合物基团连接至5’-末端核苷比连接在3’-末端处在合成上更容易。人们可将非缀合的3’末端核苷连接至固体载体并且使用标准和表征良好的反应制备寡核苷酸。然后人们仅需要在最后的偶联步骤连接具有缀合物基团的5’核苷。在某些实施方案中，这比将缀合核苷直接连接至固体载体(如通常进行来制备3’-缀合寡核苷酸)更有效。本文的实施例展示了5’-末端处的连接。另外，某些缀合物基团具有合成优点。例如，包含磷连接基团的某些缀合物基团比包括先前报道的缀合物基团的其它缀合物基团在合成上更简单并且制备更有效(例如，WO/2012/037254)。

在某些实施方案中，向受试者施用缀合反义化合物。在所述实施方案中，包含本文描述的一个或多个缀合物基团的反义化合物与缺乏所述一个或多个缀合物基团的母体反义化合物相比具有增加的活性和/或效力和/或耐受性。不受机制的束缚，据信缀合物基团有助于分布、递送和/或摄取到靶细胞或组织中。在某些实施方案中，一旦在靶细胞或组织内部，就希望缀合物基团的所有或部分裂解，以释放活性寡核苷酸。在某些实施方案中，整个缀合物基团从寡核苷酸中裂解是不必要的。例如，在实施例20中，向小鼠施用缀合寡核苷酸并且检测到许多不同的化学物质，所述化学物质各自包含剩余在寡核苷酸上的缀合物基团的不同部分(表23a)。此缀合反义化合物展示出良好的效力(表23)。因此，在某些实施方案中，缀合物基团的多个部分裂解的所述代谢特征不干扰活性/效力。尽管如此，在某些实施方案中，希望前药(缀合寡核苷酸)产生单一活性化合物。在某些情况下，如果发现活性化合物的多种形式，那么确定每一个的相对量和活性可为必要的。在其中需要监管审查(例如，USFDA或对应机构)的某些实施方案中，希望具有单一(或主要为单一的)活性物质。在某些所述实施方案中，希望所述单一活性物质为缺乏缀合物基团的任何部分的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，5’-末端处的缀合物基团更可能导致缀合物基团的完全代谢。不受机制的束缚，负责5’末端(例如，5’核苷)处的代谢的内源性酶可比3’对应物更有活性/更有效。在某些实施方案中，特定缀合物基团更适于单一活性物质的代谢。在某些实施方案中，某些缀合物基团更适于寡核苷酸的代谢。

在某些实施方案中，本发明的低聚化合物为反义化合物。在所述实施方案中，低聚化合物与靶核酸互补。在某些实施方案中，靶核酸为RNA。在某些实施方案中，靶核酸为非编码RNA。在某些实施方案中，靶核酸编码蛋白质。在某些实施方案中，靶核酸选自mRNA、前体mRNA、微小RNA、非编码RNA(包括小型非编码RNA)以及启动子指导的RNA(promoter-directed RNA)。在某些实施方案中，低聚化合物至少部分地与多于一种靶核酸互补。例如，本发明的低聚化合物可为微小RNA模拟物，其通常结合多个靶标。

在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列至少70％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列至少80％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列至少90％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列至少95％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列至少98％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物包含具有与靶核酸的核碱基序列100％互补的核碱基序列的部分。在某些实施方案中，反义化合物在反义化合物的整个长度上与靶核酸的核碱基序列至少70％、80％、90％、95％、98％或100％互补。

反义机制包括涉及低聚化合物与靶核酸的杂交的任何机制，其中杂交产生生物作用。在某些实施方案中，所述杂交导致靶核酸降解或占位并伴有细胞机器的抑制或刺激，涉及例如靶核酸或靶核苷酸可能以另外的方式与其相互作用的核酸的翻译、转录或聚腺苷酸化。

涉及靶RNA的降解的一种类型的反义机制为RNA酶H介导的反义。RNA酶H为裂解RNA：DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样”的单链反义化合物在哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶标的裂解，从而极大地增强了基因表达的DNA样寡核苷酸介导的抑制的效率。

反义机制还包括但不限于利用RISC途径的RNAi机制。所述RNAi机制包括但不限于siRNA、ssRNA和微小RNA机制。所述机制包括产生微小RNA模拟物和/或抗微小RNA。

反义机制还包括但不限于杂交或模拟非编码RNA而不是微小RNA或mRNA的机制。所述非编码RNA包括但不限于启动子指导的RNA和影响一种或多种核酸的转录或翻译的短和长RNA。

在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸为RNAi化合物。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的低聚寡核苷酸为ssRNA化合物。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸与第二低聚化合物配对以形成siRNA。在某些所述实施方案中，第二低聚化合物也包含缀合物。在某些实施方案中，第二低聚化合物为任何修饰或未修饰的核酸。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸为siRNA化合物中的反义链。在某些实施方案中，包含本文描述的缀合物的寡核苷酸为siRNA化合物中的有义链。在其中缀合低聚化合物为双链siRnA的实施方案中，缀合物可位于有义链、反义链或有义链和反义链两者上。

C.

在某些实施方案中，缀合反义化合物靶向任何apo(a)核酸。在某些实施方案中，靶核酸编码临床相关的apo(a)靶蛋白。在所述实施方案中，靶核酸的调节产生临床益处。

靶向过程通常包括确定靶核酸内的至少一个靶区域、区段或位点用于发生反义相互作用，使得将产生希望的作用。

在某些实施方案中，靶区域为核酸的结构限定区。例如，在某些所述实施方案中，靶区域可涵盖3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、编码区、翻译起始区、翻译终止区，或其它限定的核酸区域或靶区段。

在某些实施方案中，靶区段为缀合反义化合物靶向的靶区域的至少约8个核碱基部分。靶区段可包括从靶区段之一的5′-末端起包含至少8个连续核碱基的DNA或RNA序列(其余核碱基为紧邻靶区段的5′-末端上游开始并且继续直到DNA或RNA包含约8至约30个核碱基为止的相同DNA或RNA的连续链段)。靶区段还由从靶区段之一的3′-末端起包含至少8个连续核碱基的DNA或RNA序列表示(其余核碱基为紧邻靶区段的3′-末端下游开始并且继续直到DNA或RNA包含约8至约30个核碱基为止的相同DNA或RNA的连续链段)。靶区段还可由从靶区段的序列的内部起包含至少8个连续核碱基的DNA或RNA序列表示，并且可在任一或两个方向上延伸直到缀合反义化合物包含约8至约30个核碱基。

在某些实施方案中，靶向apo(a)核酸的反义化合物可如本文所述进行修饰。在某些实施方案中，反义化合物可具有修饰的糖部分、未修饰的糖部分或如本文所述的修饰和未修饰的糖部分的混合物。在某些实施方案中，反义化合物可具有修饰的核苷间键联、未修饰的核苷间键联或如本文所述的修饰和未修饰的核苷间键联的混合物。在某些实施方案中，反义化合物可具有修饰的核碱基、未修饰的核碱基或如本文所述的修饰和未修饰的核碱基的混合物。在某些实施方案中，反义化合物可具有如本文所述的基序。

在某些实施方案中，靶向apo(a)核酸的反义化合物可如本文所述进行缀合。

一个apo(a)蛋白通过二硫键连接至单个载脂蛋白B(apoB)蛋白以形成脂蛋白(a)(Lp(a))颗粒。apo(a)蛋白与纤维蛋白溶酶原具有高度的同源性，特别是在kringle IV 2型重复结构域内。据认为apo(a)中的这种kringle重复结构域可负责其促血栓形成和抗蛋白纤维溶解特性，从而潜在地加快动脉粥样硬化进展。Apo(a)由IL-6转录调控并且在用IL-6抑制剂(托珠单抗)治疗的类风湿性关节炎患者的研究中，治疗3个月后血浆水平降低30％。已显示Apo(a)优先结合氧化的磷脂并且促成血管炎症。此外，研究表明Lp(a)颗粒也可刺激内皮通透性、诱导纤溶酶原激活物抑制剂1型表达并且激活巨噬细胞白细胞介素-8分泌。重要的是，新近的遗传关联研究表明Lp(a)是心肌梗塞、中风、外周血管疾病和腹主动脉瘤的独立风险因子。此外，在新近的早熟性冠状动脉疾病(PROCARDIS)研究中，Clarke等描述了冠心病和血浆Lp(a)浓度之间的稳健且独立的关联。另外，Solfrizzi等提出，增加的血清Lp(a)可能与阿兹海默氏病(AD)的风险增加有关联。靶向apo(a)的反义化合物先前已公开于WO2005/000201和US2010-0331390中，所述参考案整体以引用的方式并入本文。靶向Apo(a)的反义寡核苷酸ISIS-APOA

靶向Apo(a)核酸的某些缀合反义化合物

在某些实施方案中，缀合反义化合物靶向具有以下序列的Apo(a)核酸：

在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO：1-4的核碱基序列中的任一个的缀合反义化合物包含选自SEQ ID NO：12-130、133、134中的任一个的核碱基序列的至少8个连续核碱基序列。在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO：1-4中的任一个的缀合反义化合物包含选自SEQID NO：12-130、133、134中的任一个的核碱基序列的核碱基序列。

表A：靶向Apo(a)SEQ ID NO：1的反义化合物

Apo(a)治疗适应症

在某些实施方案中，本发明提供了用于使用靶向apo(a)核酸的缀合反义化合物来调节受试者中apo(a)的表达的方法。在某些实施方案中，减少了apo(a)的表达。

在某些实施方案中，本文提供治疗受试者的方法，其包括施用如本文所述的一种或多种药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于使用药物组合物中靶向apo(a)核酸的缀合反义化合物来治疗受试者的方法。在某些实施方案中，个体具有apo(a)相关疾病。在某些实施方案中，个体具有Lp(a)相关疾病。在某些实施方案中，个体具有炎性、心血管和/或代谢疾病、病症或病状。

在某些实施方案中，受试者具有炎性、心血管和/或代谢疾病、病症或病状。

在某些实施方案中，心血管疾病、病症或病状包括但不限于主动脉瓣狭窄、动脉瘤(例如腹主动脉瘤)、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管疾病、冠状动脉疾病、冠心病、血脂异常、高胆固醇血症、高脂血症、高血压、高甘油三脂血症、心肌梗塞、外周血管疾病(例如外周动脉疾病)、中风等。

在某些实施方案中，本文所述的靶向apo(a)的化合物调节所述心血管疾病、病症或病状的生理标志物或表型。例如，与未治疗动物相比，对动物施用化合物可降低那些动物中的LDL和胆固醇水平。在某些实施方案中，生理标志物或表型的调节可与化合物对apo(a)的抑制相关。

在某些实施方案中，心血管疾病、病症或病状的生理标志物可以是能够量化的。例如，可例如通过标准脂质测试来测量和量化LDL或胆固醇水平。对于所述标志物，在某些实施方案中，标志物可被降低约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％或这些值中的任意两个所限定的范围。

另外，本文提供用于预防、治疗或改善有此需要的受试者中与心血管疾病、病症或病状相关的症状的方法。在某些实施方案中，提供用于降低与心血管疾病、病症或病状相关的症状的发作率的方法。在某些实施方案中，提供用于降低与心血管疾病、病症或病状相关的症状的严重性的方法。在所述实施方案中，方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的靶向apo(a)核酸的化合物。

心血管疾病、病症或病状可由许多身体症状表征。本领域的技术人员所知的与心血管疾病、病症或病状相关的任何症状都可以利用本文所述的化合物和方法得到预防、治疗、改善或以其他方式调节。在某些实施方案中，症状可为以下中的任一个，但不限于心绞痛、胸痛、呼吸短促、心悸、虚弱、头晕、恶心、出汗、心动过速、心动过缓、心律失常、心房纤维性颤动、下肢肿胀、发绀、疲劳、昏晕、面部发麻、四肢发麻、跛行或肌肉抽筋、腹部鼓胀或发热。

在某些实施方案中，所述代谢疾病、病症或病状包括但不限于高血糖症、前驱糖尿病、糖尿病(I型和II型)、肥胖症、胰岛素抗性、代谢综合征和糖尿病性血脂异常。

在某些实施方案中，本文所述的靶向apo(a)的化合物调节代谢疾病、病症或病状的生理标志物或表型。例如，与未治疗动物相比，对动物施用化合物可降低那些动物中的葡萄糖和胰岛素抵抗水平。在某些实施方案中，生理标志物或表型的调节可与化合物对apo(a)的抑制相关。

在某些实施方案中，代谢疾病、病症或病状的生理标志物可以是能够量化的。例如，可通过本领域中已知的标准测试来测量和量化葡萄糖水平或胰岛素抵抗。对于所述标志物，在某些实施方案中，标志物可被降低约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％或这些值中的任意两个所限定的范围。在另一实例中，可通过本领域中已知的标准测试来测量和量化胰岛素敏感性。对于所述标志物，在某些实施方案中，标志物可被增加约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％或这些值中的任意两个所限定的范围。

另外，本文提供用于预防、治疗或改善有此需要的受试者中与代谢疾病、病症或病状相关的症状的方法。在某些实施方案中，提供用于降低与代谢疾病、病症或病状相关的症状的发作率的方法。在某些实施方案中，提供用于降低与代谢疾病、病症或病状相关的症状的严重性的方法。在所述实施方案中，方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的靶向apo(a)核酸的化合物。

代谢疾病、病症或病状可由许多身体症状表征。本领域的技术人员所知的与代谢疾病、病症或病状相关的任何症状都可以利用本文所述的化合物和方法得到预防、治疗、改善或以其他方式调节。在某些实施方案中，症状可以为以下中的任一个，但不限于过量尿产生(多尿)、过度口渴和增加的液体摄取(烦渴)、视力模糊、原因不明的体重减轻、和嗜眠。

在某些实施方案中，所述炎性疾病、病症或病状包括但不限于主动脉瓣狭窄、冠状动脉疾病(CAD)、阿兹海默氏病和血栓栓塞疾病、病症或病状。某些血栓栓塞疾病、病症或病状包括但不限于中风、血栓形成、心肌梗塞和外周血管疾病。

在某些实施方案中，本文所述的靶向apo(a)的化合物调节所述炎性疾病、病症或病状的生理标志物或表型。例如，与未治疗动物相比，对动物施用化合物可降低那些动物中的炎性细胞因子或其它炎性标志物水平。在某些实施方案中，生理标志物或表型的调节可与化合物对apo(a)的抑制相关。

在某些实施方案中，炎性疾病、病症或病状的生理标志物可以是能够量化的。例如，可通过本领域中已知的标准测试来测量和量化细胞因子水平。对于所述标志物，在某些实施方案中，标志物可被降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或这些值中的任意两个所限定的范围。

另外，本文提供用于预防、治疗或改善有此需要的受试者中与炎性疾病、病症或病状相关的症状的方法。在某些实施方案中，提供用于降低与炎性疾病、病症或病状相关的症状的发作率的方法。在某些实施方案中，提供用于降低与炎性疾病、病症或病状相关的症状的严重性的方法。在所述实施方案中，方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的靶向apo(a)核酸的化合物。

在某些实施方案中，提供治疗具有apo(a)相关疾病、病症或病状的个体的方法，其包括施用治疗有效量的如本文所述的一种或多种药物组合物。在某些实施方案中，个体具有升高的apo(a)水平。在某些实施方案中，提供治疗具有Lp(a)相关疾病、病症或病状的个体的方法，其包括施用治疗有效量的如本文所述的一种或多种药物组合物。在某些实施方案中，个体具有升高的Lp(a)水平。在某些实施方案中，个体具有炎性、心血管和/或代谢疾病、病症或病状。在某些实施方案中，治疗有效量的靶向apo(a)核酸的反义化合物的施用伴随有apo(a)或Lp(a)水平的监测。在某些实施方案中，治疗有效量的靶向apo(a)核酸的反义化合物的施用伴随有炎性、心血管和/或代谢疾病或其它与apo(a)表达相关的疾病过程的标志物的监测，以确定个体对反义化合物的应答。个体对靶向apo(a)的反义化合物施用的应答可被医师用来确定利用化合物进行治疗干预的量和持续时间。

在某些实施方案中，靶向apo(a)核酸的反义化合物的施用导致apo(a)表达降低至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或由这些值中的任两个所限定的范围。在某些实施方案中，apo(a)表达被降低到至少≤100mg/dL、≤90mg/dL、≤80mg/dL、≤70mg/dL、≤60mg/dL、≤50mg/dL、≤40mg/dL、≤30mg/dL、≤20mg/dL或≤10mg/dL。

在某些实施方案中，靶向apo(a)核酸的反义化合物的施用导致Lp(a)表达降低至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或由这些值中的任两个所限定的范围。在某些实施方案中，Lp(a)表达被降低到至少≤200mg/dL、≤190mg/dL、≤180mg/dL、≤175mg/dL、≤170mg/dL、≤160mg/dL、≤150mg/dL、≤140mg/dL、≤130mg/dL、≤120mg/dL、≤110mg/dL、≤100mg/dL、≤90mg/dL、≤80mg/dL、≤70mg/dL、≤60mg/dL、≤55mg/dL、≤50mg/dL、≤45mg/dL、≤40mg/dL、≤35mg/dL、≤30mg/dL、≤25mg/dL、≤20mg/dL、≤15mg/dL或≤10mg/dL。

在某些实施方案中，本发明提供使用靶向apo(a)核酸的缀合反义化合物来制备药物的方法。在某些实施方案中，包含靶向apo(a)的缀合反义化合物的药物组合物被用于制备用于治疗患有或容易患有炎性、心血管和/或代谢疾病、病症或病状的患者的药物。

Apo(a)治疗人群

某些具有高Lp(a)水平的受试者处于各种疾病的显著风险之下(Lippi等，ClinicaChimica Acta，2011，412：797-801；Solfrizz等)。在许多具有高Lp(a)水平的受试者中，当前治疗不能将其Lp(a)水平降低到安全水平。Apo(a)在Lp(a)的形成中起到重要作用，因此降低apo(a)能够降低Lp(a)并且预防、治疗或改善与Lp(a)相关的疾病。

在某些实施方案中，采用本文公开的化合物和方法的治疗被指示用于具有升高的apo(a)水平和/或Lp(a)水平的人类动物。在某些实施方案中，人类具有≥10mg/dL、≥20mg/dL、≥30mg/dL、≥40mg/dL、≥50mg/dL、≥60mg/dL、≥70mg/dL、≥80mg/dL、≥90mg/dL或≥100mg/dL的apo(a)水平。在某些实施方案中，人类具有≥10mg/dL、≥15mg/dL、≥20mg/dL、≥25mg/dL、≥30mg/dL、≥35mg/dL、≥40mg/dL、≥50mg/dL、≥60mg/dL、≥70mg/dL、≥80mg/dL、≥90mg/dL、≥100mg/dL、≥110mg/dL、≥120mg/dL、≥130mg/dL、≥140mg/dL、≥150mg/dL、≥160mg/dL、≥170mg/dL、≥175mg/dL、≥180mg/dL、≥190mg/dL、≥200mg/dL的Lp(a)水平。

D.

在某些实施方案中，本公开提供了包含一种或多种反义化合物的药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物包含合适的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中，药物组合物包含无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物。在某些实施方案中，所述药物组合物由无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级盐水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种反义化合物和无菌水。在某些实施方案中，药物组合物由一种或多种反义化合物和无菌水组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种反义化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施方案中，药物组合物由一种或多种反义化合物和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成。在某些实施方案中，无菌盐水为药用级PBS。

在某些实施方案中，反义化合物可与药学上可接受的活性物质和/或惰性物质混合用于制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用的剂量。

包含反义化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐。在某些实施方案中，包含反义化合物的药物组合物包含一种或多种寡核苷酸，当向动物(包括人)施用时，所述一种或多种寡核苷酸能够(直接地或间接地)提供生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，本公开还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐以及其它生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。

前药可包括在寡核苷酸的一个或两个末端处掺入另外的核苷(所述核苷被体内的内源性核酸酶裂解)以形成活性反义寡核苷酸。

脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法中。在某些所述方法中，将核酸引入到由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预先形成的脂质体或脂质复合物中。在某些方法中，在不存在中性脂质的情况下形成具有单阳离子脂质或聚阳离子脂质的DNA复合物。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至具体细胞或组织的分布。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至脂肪组织的分布。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至肌肉组织的分布。

在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含一种或多种修饰寡核苷酸和一种或多种赋形剂。在某些所述实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。

在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统有用于制备某些药物组合物，所述药物组合物包括包含疏水化合物的那些。在某些实施方案中，使用了某些有机溶剂如二甲亚砜。

在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含设计来将本公开的一种或多种药剂递送至特定组织或细胞类型的一个或多个组织特异性递送分子。例如，在某些实施方案中，药物组合物包括涂覆有组织特异性抗体的脂质体。

在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含共溶剂系统。某些所述共溶剂系统包含例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混溶的有机聚合物以及水相。在某些实施方案中，所述共溶剂系统用于疏水化合物。所述共溶剂系统的非限制性实例为VPD共溶剂系统，其为包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80TM和65％w/v聚乙二醇300的无水乙醇溶液。所述共溶剂系统的比例可在不显著改变其溶解度和毒性特征的情况下明显改变。此外，共溶剂组分的身份可改变：例如，可使用其它表面活性剂替代聚山梨酯80TM；可改变聚乙二醇的分数大小；其它生物相容的聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其它糖或多糖可取代右旋糖。

在某些实施方案中，本文提供的药物组合物被制备用于经口施用。在某些实施方案中，药物组合物被制备用于经颊施用。

在某些实施方案中，药物组合物被制备用于通过注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内等)施用。在某些所述实施方案中，药物组合物包含载体并且配制在水溶液中，如水或生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。在某些实施方案中，包括其它成分(例如，帮助溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施方案中，使用适当的液体载体、悬浮剂等制备可注射悬浮液。某些注射用药物组合物以单位剂型呈现，例如在安瓿中或在多剂量容器中。某些注射用药物组合物为油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。某些适用于注射用药物组合物的溶剂包括但不限于亲脂溶剂和脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)以及脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，所述悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加药剂溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。

在某些实施方案中，制备药物组合物用于透粘膜施用。在某些所述实施方案中，在配制中使用适用于待渗透的屏障的渗透剂。所述渗透剂通常为本领域中已知的。

在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的寡核苷酸。在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、减轻或改善疾病的症状或延长正在治疗的受试者的存活。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内。

在某些实施方案中，本文提供的一种或多种修饰寡核苷酸被配制成前药。在某些实施方案中，当体内施用时，前药化学转化为寡核苷酸的生物学、药学或治疗学上更具活性的形式。在某些实施方案中，前药为有用的，因为它们比对应的活性形式更容易施用。例如，在某些情况下，前药可比对应的活性形式生物利用度更高(例如，通过经口施用)。在某些情况下，与对应的活性形式相比，前药可具有改进的溶解度。在某些实施方案中，前药比对应的活性形式水溶性更小。在某些情况下，所述前药具有优越的跨越细胞膜传输的能力，其中水溶性不利于迁移性。在某些实施方案中，前药为酯。在某些所述实施方案中，当施用时酯被代谢水解为羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物为对应的活性形式。在某些实施方案中，前药包含结合至酸基团的短肽(聚氨基酸)。在某些所述实施方案中，当施用时肽裂解以形成对应的活性形式。

在某些实施方案中，本公开提供了用于减少细胞中靶核酸的量或活性的组合物和方法。在某些实施方案中，细胞在动物中。在某些实施方案中，动物为哺乳动物。在某些实施方案中，动物为啮齿动物。在某些实施方案中，动物为灵长类动物。在某些实施方案中，动物为非人灵长类动物。在某些实施方案中，动物为人。

在某些实施方案中，本公开提供了向动物施用包含本公开的寡核苷酸的药物组合物的方法。合适的施用途径包括但不限于经口、直肠、透粘膜、肠、肠内、局部、栓剂、通过吸入、鞘内、脑室内、腹膜内、鼻内、眼内、瘤内以及肠胃外(例如，静脉内、肌肉内、髓内和皮下)。在某些实施方案中，施用鞘内药物(pharmaceutical intrathecal)以实现局部暴露而非全身暴露。例如，可将药物组合物直接注射在希望作用的区域中(例如，到肝脏中)。

虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中引用的每个参考文献、GenBank登录号和类似物均以引用的方式整体并入本文。

虽然在要求时随附本文件的序列表将每个序列鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上，那些序列可用任何化学修饰组合来修饰。本领域技术人员将容易了解，在某些情况下，这种命名为“RNA”或“DNA”来描述修饰寡核苷酸是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可被描述为具有修饰的糖(对于DNA的天然2'-H为2'-OH)的DNA或具有修饰碱基(对于RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))的RNA。

因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于序列表中的那些)意图涵盖含有任何组合的天然或修饰RNA和/或DNA的核酸，包括但不限于具有修饰核碱基的所述核酸。通过进一步举例而非限制的方式，具有核碱基序列“ATCGATCG”的寡核苷酸涵盖具有所述核碱基序列(无论修饰的或未修饰的)的任何寡核苷酸，包括但不限于包含RNA碱基的所述化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些以及具有其它修饰碱基如“AT

具体实施方式

实施例

以下实施例说明了本公开的某些实施方案并且不是限制性的。此外，在提供具体实施方案时，发明人已预期了那些具体实施方案的一般应用。例如，具有具体基序的寡核苷酸的公开为具有相同或类似基序的另外的寡核苷酸提供了合理支持。并且，例如，在特别高亲合力的修饰出现在具体位置上时，相同位置上的其它高亲合力修饰也认为是合适的，除非另外指出。

实施例1：用于制备亚磷酰胺化合物1、1a和2的一般方法

Bx为杂环碱基；

根据描述于本文的说明书中的本领域熟知的工序制备化合物1、1a和2(参见Seth等，Bioorg.Med.Chem.，2011，21(4)，1122-1125、J.Org.Chem.，2010，75(5)，1569-1581，Nucleic Acids Symposium Series，2008，52(1)，553-554)；并且还参见已公布的PCT国际申请(WO 2011/115818、WO 2010/077578、WO2010/036698、WO2009/143369、WO 2009/006478和WO 2007/090071)和美国专利7,569,686)。

实施例2：化合物7的制备

化合物3(2-乙酰氨基-1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D吡喃半乳糖或半乳糖胺五乙酸酯)为商业上可获得的。根据公布的工序制备化合物5(Weber等，J.Med.Chem.，1991，34，2692)。

实施例3：化合物11的制备

化合物8和9为商业上可获得的。

实施例4：化合物18的制备

根据实施例3中说明的工序制备化合物11。化合物14为商业上可获得的。使用由Rensen等，J.Med.Chem.，2004，47，5798-5808所报道的类似工序制备化合物17。

实施例5：化合物23的制备

化合物19和21为商业上可获得的。

实施例6：化合物24的制备

根据实施例4和5中说明的工序制备化合物18和23。

实施例7：化合物25的制备

根据实施例6中说明的工序制备化合物24。

实施例8：化合物26的制备

根据实施例6中说明的工序制备化合物24。

实施例9：在3’末端包含GalNAc

其中受保护的GalNAc

缀合物基团GalNAc

根据实施例7中说明的工序制备固体载体结合的受保护的GalNAc

实施例10：在5’末端包含GalNAc

Unylinker

实施例11：化合物39的制备

根据实施例2、4和5中说明的工序制备化合物4、13和23。使用公布于以下的类似工序制备化合物35：Rouchaud等，Eur.J.Org.Chem.，2011，12，2346-2353。

实施例12：化合物40的制备

根据实施例11中说明的工序制备化合物38。

实施例13：化合物44的制备

根据实施例5和11中说明的工序制备化合物23和36。使用公布于WO 2009082607中的类似工序制备化合物41。

实施例14：化合物45的制备

根据实施例13中说明的工序制备化合物43。

实施例15：化合物47的制备

化合物46为商业上可获得的。

实施例16：化合物53的制备

化合物48和49为商业上可获得的。根据实施例4和15中说明的工序制备化合物17和47。

实施例17：化合物54的制备

根据实施例16中说明的工序制备化合物53。

实施例18：化合物55的制备

根据实施例16中说明的工序制备化合物53。

实施例19：用于通过固相技术制备在3’位包含GalNAc

除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G和

在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscience

在装配希望的序列之后，使用三乙胺和乙腈的1∶1(v/v)混合物将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28wt％-30wt％)中并且在55℃下加热6h。

然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。残余物通过高压液相色谱法在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source 30Q，30μm，2.54x8cm，A＝30％水性CH

使用本领域中熟知的标准寡核苷酸合成工序合成不包含缀合物的反义寡核苷酸。

使用这些方法，制备了靶向ApoC III的三种单独的反义化合物。如以下表17中所概述，靶向ApoC III的三种反义化合物中的每一种均具有相同的核碱基序列；ISIS 304801为具有所有硫代磷酸酯键联的5-10-5 MOE缺口聚物；ISIS 647535与ISIS 304801相同，除了ISIS 647535具有缀合在其3’末端的GalNAc

表17

靶向ApoC III和SRB-1的修饰ASO

下标：“e”指示2'-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH

实施例20：huApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的剂量依赖性反义抑制

在剂量依赖性研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且以上描述的ISIS 304801和ISIS 647535进行单独测试和评价。

处理

将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。

每周一次在0.08μmol/kg、0.25μmol/kg、0.75μmol/kg、2.25μmol/kg或6.75μmol/kg下用ISIS 304801或647535或使用PBS作为对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。每个处理组由4只动物组成。在施用最后剂量之后的四十八小时，从每只小鼠中抽血并且将小鼠处死并收集组织。

ApoC III mRNA分析

使用实时PCR和

如所说明的，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III RNA减少。此外，缀合至GalNAc

表18

ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响

ApoC III蛋白分析(浊度测定)

使用在2013年3月29日印刷之前在线公布的Graham等，Circulation Research所报道的工序确定血浆ApoC III蛋白分析。

在不稀释的情况下使用Olympus临床分析器和商业上可获得的浊度ApoC III测定(Kamiya，Cat#KAI-006，Kamiya Biomedical，Seattle，WA)来分析从小鼠中分离的大约100μl血浆。如供应商所述执行测定方案。

如以下表19中所示，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III蛋白减少。此外，缀合至GalNAc

表19

ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响

通过Bligh和Dyer(Bligh，E.G.和Dyer，W.J.Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917，1959)(Bligh，E和Dyer，W，Can J Biochem Physiol，37，911-917，1959)(Bligh，E和Dyer，W，Can J Biochem Physiol，37，911-917，1959)的方法提取血浆甘油三酯和胆固醇并且通过使用Beckmann Coulter临床分析器和商业上可获得的试剂来测量。

相对于PBS注射的小鼠测量甘油三酯水平并且表示为“％PBS”。结果呈现于表20中。如所说明的，这两种反义化合物使甘油三酯水平降低。此外，缀合至GalNAc

表20

ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响

通过HPLC分析血浆样品来测定总胆固醇和不同级分的胆固醇(HDL和LDL)的量。结果呈现于表21和22中。如所说明的，这两种反义化合物使总胆固醇水平降低；均使LDL降低；并且均使HDL升高。此外，缀合至GalNAc

表21

ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响

表22

ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响

药物代谢动力学分析(PK)

还评价了ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏和肾样品。在MSDl上利用IP-HPLC-MS分析样品。测量全长ISIS 304801和647535的组织水平(μg/g)并且结果提供于表23中。如所说明的，对于两种反义化合物，总全长反义化合物的肝脏浓度类似。因此，即使GalNAc

结果还显示GalNAc

表23

转基因小鼠中ASO处理的PK分析

还鉴定了ISIS 647535的代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。以下示出所观察到的代谢物的裂解位点和结构。使用标准工序计算全长ASO的相对％并且结果呈现于表23a中。ISIS 647535的主要代谢物为缺乏整个缀合物的全长ASO(即ISIS304801)，其由在以下示出的裂解位点A处裂解产生。此外，还观察到由其它裂解位点产生的另外代谢物。这些结果表明在GalNAc

表23a

所观察到的ISIS 647535的全长代谢物

实施例21：单一施用研究中人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的反义抑制

在单一施用研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且描述于表17中的ISIS 304801、647535和647536进行进一步评价。

处理

将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。

在以下示出的剂量下，用ISIS 304801、647535或647536(以上所述)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠一次。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。

收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III mRNA和蛋白质水平；血浆甘油三酯；以及胆固醇，包括如上所述(实施例20)评估的HDL和LDL级分。来自那些分析的数据呈现于以下表24-28中。使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。ALT和AST水平显示反义化合物在所有施用的剂量下为耐受良好的。

这些结果显示了与缺乏GalNAc

表24

ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响

表25

ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响

表26

ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响

表27

ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响

表28

ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响

这些结果证实GalNAc

硫代磷酸酯键联为反义化合物提供若干性质。例如，它们抗核酸酶消化并且它们结合导致化合物在肝脏中积累而不是在肾/尿液中积累的蛋白质。这些为希望的性质，特别是当治疗肝脏中的适应症时。然而，硫代磷酸酯键联还与炎症性应答相关。因此，减少化合物中硫代磷酸酯键联的数目预期会减小炎症的风险，但是也降低化合物在肝脏中的浓度，增加在肾和尿液中的浓度，减小在核酸酶存在下的稳定性并且降低总体效力。本结果显示其中某些硫代磷酸酯键联已被磷酸二酯键联替代的GalNAc

实施例22：靶向SRB-1的GalNAc

在剂量依赖性研究中，针对其抑制Balb/

处理

在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和

如表29中所说明的，这两种反义化合物使SRB-1 mRNA水平降低。此外，包含GalNAc

表29

ASO处理对Balb/c小鼠中SRB-1mRNA水平的影响

实施例23：人外周血单核细胞(hPBMC)测定方案

使用BD Vautainer CPT管法进行hPBMC测定。从在美国健康工作诊所(Faraday&ElCamino Real，Carlsbad)具有知情同意书的志愿供体中获得全血样品并且收集在4-15个BDVacutainer CPT 8ml管中(VWR Cat.#BD362753)。使用PBMC测定数据表记录每个供体的CPT管中的大约起始总全血体积。

通过将管轻轻倒置8-10次在离心之前立即重新混合血液样品。将CPT管在具有制动的1500-1800RCF(2700 RPM Beckman Allegra 6R)下、在水平(摆动)转子中在室温(18-25℃)下离心30min。从血沉棕黄层界面(在Ficoll与聚合物凝胶层之间)取回细胞；转移至无菌50ml圆锥管并且汇集至5个CPT管/50ml圆锥管/供体。然后用PBS(无Ca

将细胞以5x10

实施例24：在hPBMC测定中评价GalNAc

使用实施例23中描述的方案，在hPBMC测定中评价列于表30中的反义寡核苷酸(ASO)的促炎性作用。ISIS 353512为已知为测定中的IL-6释放的高响应者的内标物。从新鲜志愿供体中分离hPBMC并且用0μM、0.0128μM、0.064μM、0.32μM、1.6μM、8μM、40μM和200μM浓度下的ASO处理。在24小时处理之后，测量细胞因子水平。

IL-6的水平用作原始读出。使用标准工序计算EC

对于测试化合物，促炎性最小的化合物为PS/PO连接的ASO(ISIS 616468)。GalNAc

总之，这些结果表明GalNAc

表30

修饰ASO

下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH

表31

靶向ApoC III的ASO在hPBMC测定中的促炎性作用

实施例25：靶向人ApoC III的GalNAc

在体外测试以上所述的ISIS 304801和647535。用0.03μM、0.08μM、0.24μM、0.74μM、2.22μM、6.67μM和20μM浓度的修饰寡核苷酸处理密度为25,000个细胞/孔的来自转基因小鼠的原代肝细胞。在大约16小时的处理期后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过RIBOGREEN所测量，根据总RNA含量调节hApoC III mRNA水平。

使用标准方法计算IC

表32

靶向原代肝细胞中的人ApoC III的修饰ASO

在本实验中，在体外没有观察到在体内所观察到的GalNAc

实施例26：PO/PS键联对ApoC III ASO活性的影响

每周一次以25mg/kg的ISIS 304801或ISIS 616468(上述两者)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。

如上所述收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III蛋白水平(实施例20)。来自那些分析的数据呈现于以下表33中。

这些结果表明相对于全部PS(ISIS 304801)，在翼中具有PO/PS的反义化合物(ISIS 616468)效力减小。

表33

ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III蛋白水平的影响

实施例27：化合物56

化合物56可从Glen Research商业上获得或可根据由Shchepinov等，NucleicAcids Research，1997，25(22)，4447-4454所报道的已公布工序制备。

实施例28：化合物60的制备

根据实施例2中说明的工序制备化合物4。化合物57为商业上可获得的。通过结构分析来证实化合物60。

化合物57意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它单保护的取代或未取代的烷基二醇包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备具有预先确定的组成的亚磷酰胺。

实施例29：化合物63的制备

使用类似于由Tober等，Eur.J.Org.Chem.，2013，3，566-577；和Jiang等，Tetrahedron，2007，63(19)，3982-3988所报道的那些的工序制备化合物61和62。

或者，使用类似于由Kim等，Synlett，2003，12，1838-1840；和Kim等，已公布的PCT国际申请WO 2004063208的科学和专利文献中所报道的那些的工序制备化合物63。实施例30：化合物63b的制备

使用类似于由Hanessian等，Canadian Journal of Chemistry，1996，74(9)，1731-1737所报道的那些的工序制备化合物63a。

实施例31：化合物63d的制备

使用类似于由Chen等，Chinese ChemicalLetters，1998，9(5)，451-453所报道的那些的工序制备化合物63c。

实施例32：化合物67的制备

根据实施例2中说明的工序制备化合物64。使用类似于由Or等，已公布的PCT国际申请WO 2009003009所报道的那些的工序制备化合物65。用于化合物65的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。

实施例33：化合物70的制备

根据实施例2中说明的工序制备化合物64。化合物68为商业上可获得的。用于化合物68的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。

实施例34：化合物75a的制备

根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research，1997，25(22)，4447-4454所报道的公布的工序制备化合物75。

实施例35：化合物79的制备

根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research，1997，25(22)，4447-4454所报道的公布的工序制备化合物76。

实施例36：化合物79a的制备

根据实施例35中说明的工序制备化合物77。

实施例37：用于通过固体载体制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc

其中GalNAc

缀合物基团GalNAc

使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Iht.Ed.，2006，45，3623-3627)。分别根据实施例27和28中说明的工序制备亚磷酰胺化合物56和60。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯连接的缀合物基团的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。

实施例38：用于制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc

使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Iht.Ed.，2006，45，3623-3627)。根据实施例35中说明的工序制备GalNAc

实施例39：用于通过固体载体制备在5’末端包含GalNAc

根据实施例4中说明的工序制备化合物18。化合物83a和83b为商业上可获得的。使用标准寡核苷酸合成工序制备包含磷酸二酯连接的己胺的低聚化合物83e。用氨水处理受保护的低聚化合物提供5′-GalNAc

其中GalNAc

缀合物基团GalNAc

实施例40：用于通过固体载体制备在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc

其中GalNAc

其中CM为可裂解部分。在某些实施方案中，可裂解部分为：

缀合物基团GalNAc

受保护的Unylinker官能团化的固体载体化合物30为商业上可获得的。使用类似于文献中所报道的那些的工序制备化合物84(参见Shchepinov等，Nucleic AcidsResearch，1997，25(22)，4447-4454；Shchepinov等，Nucleic Acids Research，1999，27，3035-3041；以及Hornet等，Nucleic Acids Research，1997，25，4842-4849)。

根据实施例28和36中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物60和79a。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其它亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的在3’末端具有磷酸二酯连接的缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。

实施例41：用于通过固相技术制备在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc

除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G和

在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscience

在装配希望的序列之后，使用20％甲苯中的二乙胺(v/v)将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28wt％-30wt％)中并且在55℃下加热6h。

然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。残余物通过高压液相色谱法在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source30Q，30μm，2.54x8cm，A＝30％水性CH

表34

靶向SRB-1的在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc

下标：“e”指示2'-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH

实施例42：用于通过固相技术制备在5’位上包含GalNAc

使用如实施例39和41中所说明的类似工序进行ISIS 661166的合成。

ISIS 661166为5-10-5MOE缺口聚物，其中5’位包含GalNAc

表34a

靶向Malat-1的通过己基氨基磷酸二酯键联在5’位上包含GalNAc

下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“5’-GalNAc

实施例43：靶向SRB-1的5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc

在剂量依赖性研究中，测试在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc

处理

在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900、661134或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和

如表35中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc

表35

靶向SRB-1的含有GalNAc

先前在实施例9和37中描述了3’GalNAc

药物代谢动力学分析(PK)

如实施例20中所说明，以相同方式检验和评价来自高剂量组(7mg/kg)的ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏样品。鉴定了661134(5’GalNAc

实施例44：PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc

在单一施用研究中，针对其抑制小鼠中SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc

ASO为5-10-5MOE缺口聚物，其中缺口区包含十个2’-脱氧核糖核苷并且每个翼区包含五个2'-MOE修饰核苷。使用如先前在实施例19中所说明的类似方法制备ASO并且在以下表36中描述。

表36

靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc

下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc

处理

在以下示出的剂量下，用ISIS 353382、655861、655862或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和

如表37中所说明，与PBS处理的对照相比，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在3’末端包含GalNAc

表37

PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了器官重量。结果展示相比于PBS对照，在用ASO处理的小鼠中没有观察到转氨酶水平(表38)或器官重量(数据未示出)上升。此外，与全部PS(ISIS 655861)相比，具有混合的PS/PO键联的ASO(ISIS 655862)显示出类似的转氨酶水平。

表38

PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc

实施例45：PFP酯化合物110a的制备

单独用化合物103a或103b(38毫摩尔)和TMSOTf(0.5当量)以及二氯甲烷(200mL)中的分子筛处理化合物4(9.5g，28.8毫摩尔)，并且在室温下搅拌16小时。这时使有机层过滤通过硅藻土，然后用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减。通过硅胶色谱法(2％--＞10％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到＞80％产率的化合物104a和104b。LCMS和质子NMR与结构一致。

将化合物104a和104b处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到＞90％产率的化合物105a和105b。LCMS和质子NMR与结构一致。

在与对于化合物901a-d相同的条件下单独用化合物90处理化合物105a和105b，得到化合物106a(80％)和106b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。

将化合物106a和106b处理至与对于化合物96a-d(实施例47)相同的条件，得到107a(60％)和107b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。

将化合物107a和107b处理至与对于化合物97a-d(实施例47)相同的条件，得到40％-60％产率的化合物108a和108b。LCMS和质子NMR与结构一致。

将化合物108a(60％)和108b(40％)处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到＞80％产率的化合物109a和109b。LCMS和质子NMR与结构一致。

将化合物109a处理至与对于化合物101a-d(实施例47)相同的条件，得到30％-60％产率的化合物110a。LCMS和质子NMR与结构一致。或者，可以类似方式用化合物109b起始制备化合物110b。

实施例46：用于与PFP酯(寡核苷酸111)缀合的一般工序；ISIS 666881(GalNAc

使用标准固相寡核苷酸工序合成并纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸。将5’-己基氨基修饰的寡核苷酸溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量的溶解于DMSO(50μL)中的所选的PFP酯化GalNAc

将寡核苷酸111与GalNAc

根据此一般工序制备ISIS 666881。使用标准固相寡核苷酸工序合成并且纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸ISIS 660254。将ISIS 660254(40mg，5.2μmol)溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量溶解于DMSO(50μL)中的PFP酯(化合物110a)。在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，则需要另外的DMSO(600μL)来完全溶解PFP酯。在室温下混合16h之后反应完全。用水将溶液稀释至12mL总体积，并且在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，同时在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合的寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干，得到90重量％产率的ISIS 666881(42mg，4.7μmol)。

GalNAc

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

实施例47：包含GalNAc

将三元酸90(4g，14.43mmol)溶解于DMF(120mL)和N，N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(8.9mL，52毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。连同N，N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)一起添加Boc-二胺91a或91b(68.87mmol)，并且使反应物在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减＞75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％--＞10％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物92a和92b。LCMS和质子NMR与结构一致。

在室温下用20mL二氯甲烷和20mL三氟乙酸将化合物92a或92b(6.7毫摩尔)处理16小时。蒸发所得到的溶液，然后溶解于甲醇中，并且用DOWEX-OH树脂处理30分钟。过滤所得到的溶液并且在减压下缩减至油状物，得到85％-90％产率的化合物93a和93b。

将化合物7或64(9.6毫摩尔)在DMF(20mL)中用HBTU(3.7g，9.6毫摩尔)和N，N-二异丙基乙胺(5mL)处理15分钟。向其中添加化合物93a或93b(3毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF减少＞75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％--＞20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到20％-40％产率的化合物96a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。

在乙醇(75mL)中通过雷尼镍单独地将化合物96a-d(0.75毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除乙醇，得到80％-90％产率的化合物97a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。

将化合物23(0.32g，0.53毫摩尔)在DMF(30mL)中用HBTU(0.2g，0.53毫摩尔)和N，N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.14毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.38毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF减少＞75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％--＞20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到30％-40％产率的化合物98a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。

将化合物99(0.17g，0.76毫摩尔)在DMF(50mL)中用HBTU(0.29g，0.76毫摩尔)和N，N-二异丙基乙胺(0.35mL，2.0毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.51毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF减少＞75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％--＞20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到40％-60％产率的化合物100a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。

单独地在甲醇/乙酸乙酯(1∶1，50mL)中通过10％Pd(OH)

单独地将化合物101a-d(0.15毫摩尔)溶解于DMF(15mL)和吡啶(0.016mL，0.2毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(0.034mL，0.2毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。这时在减压下使DMF减少＞75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％--＞5％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物102a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。

使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc

GalNAc

实施例48：包含GalNAc

根据文献中描述的工序合成化合物112(J.Med.Chem.2004，47，5798-5808)。

将化合物112(5g，8.6mmol)溶解于1∶1 甲醇/乙酸乙酯(22mL/22mL)中。添加碳上氢氧化钯(0.5g)。将反应混合物在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤通过硅藻土垫并且用1∶1 甲醇/乙酸乙酯洗涤该垫。合并滤液和洗涤物并且浓缩至干燥，得到化合物105a(定量的)。通过LCMS证实结构。

将化合物113(1.25g，2.7mmol)、HBTU(3.2g，8.4mmol)和DIEA(2.8mL，16.2mmol)溶解于无水DMF(17mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。向其中添加化合物105a(3.77g，8.4mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂以得到油状物。将残余物溶解于CH

将化合物114(1.43g，0.8mmol)溶解于1∶1 甲醇/乙酸乙酯(4mL/4mL)中。添加钯碳(湿润，0.14g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤通过硅藻土垫。用甲醇/乙酸乙酯(1∶1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物115(定量的)。通过LCMS和

将化合物83a(0.17g，0.75mmol)、HBTU(0.31g，0.83mmol)和DIEA(0.26mL，1.5mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。向其中添加化合物115(1.22g，0.75mmol)在无水DMF中的溶液并且将反应物在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CH

将化合物116(0.74g，0.4mmol)溶解于1∶1 甲醇/乙酸乙酯(5mL/5mL)中。添加钯碳(湿润，0.074g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物过滤通过硅藻土垫。用甲醇/乙酸乙酯(1∶1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物117(0.73g，98％)。通过LCMS和

将化合物117(0.63g，0.36mmol)溶解于无水DMF(3mL)中。向此溶液中添加N，N-二异丙基乙胺(70μL，0.4mmol)和三氟乙酸五氟苯基酯(72μL，0.42mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h并且倾入到饱和NaHCO

使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc

GalNAc

实施例49：包含GalNAc

将化合物120(14.01g，40mmol)和HBTU(14.06g，37mmol)溶解于无水DMF(80mL)中。添加三乙胺(11.2mL，80.35mmol)并且搅拌5min。在冰浴中冷却反应混合物并且添加化合物121(10g，mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。添加另外的三乙胺(4.5mL，32.28mmol)并且将反应混合物在氩气气氛下搅拌18h。通过TLC(乙酸乙酯∶己烷；1∶1；Rf＝0.47)监测反应。在减压下去除溶剂。将残余物吸收于EtOAc(300mL)中并且用1M NaHSO

将LiOH(92.15mmol)在水(20mL)和THF(10mL)中的溶液添加至溶解于甲醇(15mL)中的化合物122(7.75g，13.16mmol)的冷却溶液中。将反应混合物在室温下搅拌45min并且通过TLC(EtOAc∶己烷；1∶1)监测。在减压下将反应混合物浓缩至一半体积。在冰浴中冷却剩余的溶液并且通过添加浓HCl来中和。将反应混合物稀释，用EtOAc(120mL)萃取并且用盐水洗涤(100mL)。当静置过夜时形成乳液并且澄清。将有机层分离、干燥(Na

根据文献中描述的工序合成化合物126(J.Am.Chem.Soc.2011，133，958-963)。

将化合物123(7.419g，12.91mmol)、HOBt(3.49g，25.82mmol)和化合物126(6.33g，16.14mmol)溶解于DMF(40mL)中，并且在冰浴中冷却所得到的反应混合物。在氩气气氛下，向其中添加N，N-二异丙基乙胺(4.42mL，25.82mmol)、PyBop(8.7g，16.7mmol)，接着添加Bop偶联试剂(1.17g，2.66mmol)。去除冰浴并且使溶液升温至室温。在1h后反应完成，如通过TLC(DCM∶MeOH∶AA；89∶10∶1)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中并且用1M NaHSO

将三氟乙酸(12mL)添加至化合物127(1.57g，2.02mmol)在二氯甲烷(12mL)中的溶液中，并且在室温下搅拌1h。在减压下使反应混合物与甲苯(30mL)共蒸发至干燥。使所获得的残余物与乙腈(30mL)和甲苯(40mL)共蒸发两次，得到呈三氟乙酸盐的化合物128(1.67g)并且无需进一步纯化即用于下一步。LCMS和

将化合物7(0.43g，0.963mmol)、HATU(0.35g，0.91mmol)和HOAt(0.035g，0.26mmol)合并在一起并且在圆底烧瓶中在减压下通过P

在20mL闪烁瓶中将化合物129(0.09g，0.051mmol)溶解于甲醇(5mL)中。向其中添加少量的10％Pd/C(0.015mg)并且用H

向10mL刻度的圆底烧瓶中添加化合物130(75.8mg，0.046mmol)、0.37M吡啶/DMF(200μL)和搅拌棒。在搅拌的情况下向此溶液中逐滴添加0.7M三氟乙酸五氟苯基酯/DMF(100μL)。在1h后反应完成，如通过LC MS所测定的。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CHCl

使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc

GalNAc

实施例50：包含GalNAc

化合物134的合成。向Merrifield烧瓶中添加用乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙腈洗涤的氨甲基VIMAD树脂(2.5g，450μmol/g)。树脂在乙腈(4mL)中溶胀。通过添加20(1.0mmol，0.747g)、TBTU(1.0mmol，0.321g)、乙腈(5mL)和DIEA(3.0mmol，0.5mL)将化合物133在100mL圆底烧瓶中预先活化。使此溶液搅拌5min，然后在振荡的情况下添加至Merrifield烧瓶。使悬浮液振荡3h。排出反应混合物并且用乙腈、DMF和DCM洗涤树脂。通过测量DCM中的DMT阳离子在500nm(消光系数＝76000)处的吸光度来定量新树脂负载量并且测定为238μmol/g。通过悬浮于乙酸酐溶液中持续十分钟，进行三次，来将树脂加帽。

使用反复基于Fmoc(iterative Fmoc-based)的固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物141。取出少量固体载体并且悬浮于氨水(28wt％-30wt％)中持续6h。通过LC-MS分析裂解的化合物并且所观察到的质量与结构一致。质量m/z 1063.8[M+2H]

使用固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物142。

在DNA合成器上使用标准固相合成来合成固体载体结合的化合物143。

将固体载体结合的化合物143悬浮于氨水(28wt％-30wt％)中并且在55℃下加热16h。冷却溶液并且过滤固体载体。浓缩滤液，将残余物溶解于水中并且通过HPLC在强阴离子交换柱上纯化。将含有全长化合物144的级分汇集在一起并且脱盐。通过LC-MS分析所得到的GalNAc

缀合物基团GalNAc

GalNAc

实施例51：包含GalNAc

如文献中所描述来合成化合物146(Analytical Biochemistry 1995，229，54-60)。

将化合物4(15g，45.55mmol)和化合物35b(14.3克，57mmol)溶解于CH

将化合物112(4.27g，7.35mmol)溶解于1∶1 MeOH/EtOAc(40ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯，400mg)，并且使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的CH

将化合物147(2.31g，11mmol)溶解于无水DMF(100mL)中。添加N，N-二异丙基乙胺(DIEA，3.9mL，22mmol)，接着添加HBTU(4g，10.5mmol)。使反应混合物在氮气下搅拌大约15分钟。向其中添加化合物105a(3.3g，7.4mmol)在干燥DMF中的溶液并且在氮气气氛下搅拌2h。将反应物用EtOAc稀释并且用饱和NaHCO

将化合物148(3.3g，5.2mmol)溶解于1∶1 MeOH/EtOAc(75ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(350mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物149(2.6g)。LCMS与希望的产物一致。将残余物溶解于干燥DMF(10ml)中，其立即用于下一步。

将化合物146(0.68g，1.73mmol)溶解于干燥DMF(20ml)中。向其中添加DIEA(450μL，2.6mmol，1.5当量)和HBTU(1.96g，0.5.2mmol)。使反应混合物在氮气下在室温下搅拌15分钟。添加化合物149(2.6g)在无水DMF(10mL)中的溶液。通过添加DIEA(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。使反应物在氮气下在室温下搅拌2h。在完成时，将反应物用EtOAc(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO

将化合物150(0.62g)溶解于1∶1 MeOH/EtOAc(5L)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(60mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物151(0.57g)。LCMS与希望的产物一致。将产物溶解于4mL干燥DMF中并且立即用于下一步。

将化合物83a(0.11g，0.33mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且添加N，N-二异丙基乙胺(75μL，1mmol)和PFP-TFA(90μL，0.76mmol)。当接触时反应混合物变为洋红色，并且在接下来的30分钟里逐渐变为橙色。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时(形成PFP酯)，添加化合物151(0.57g，0.33mmol)在DMF中的溶液。通过添加N，N-二异丙基乙胺(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH

将化合物152(0.35g，0.182mmol)溶解于1∶1 MeOH/EtOAc(10mL)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(35mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物153(0.33g，定量的)。LCMS与希望的产物一致。

在氮气下搅拌的情况下，将化合物153(0.33g，0.18mmol)溶解于无水DMF(5mL)中。向其中添加N，N-二异丙基乙胺(65μL，0.37mmol)和PFP-TFA(35μL，0.28mmol)。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。在接触时反应混合物变为洋红色，并且逐渐变为橙色。通过添加更多的N，-二异丙基乙胺将反应混合物的pH维持在pH＝9-10。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH

使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc

GalNAc

实施例52：包含GalNAc

根据文献中描述的工序合成化合物156(J.Med.Chem.2004，47，5798-5808)。

将化合物156(18.60g，29.28mmol)溶解于甲醇(200mL)中。添加钯碳(6.15g，10wt％，负载量(干基)，基质碳粉，湿润)。将反应混合物在氢气下在室温下搅拌18h。将反应混合物过滤通过硅藻土垫并且用甲醇彻底洗涤硅藻土垫。洗涤合并的滤液并且浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用5％-10％的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物157(14.26g，89％)。质量m/z 544.1[M-H]

将化合物157(5g，9.17mmol)溶解于无水DMF(30mL)中。添加HBTU(3.65g，9.61mmol)和N，N-二异丙基乙胺(13.73mL，78.81mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌5分钟。向其中添加化合物47(2.96g，7.04mmol)的溶液。将反应物在室温下搅拌8h。将反应混合物倾入到饱和NaHCO

在减压下通过P

使用标准寡核苷酸合成工序制备包含GalNAc

实施例53：用于制备化合物18(GalNAc

使内酯161与二氨基丙烷(3-5当量)或单-Boc保护的二氨基丙烷(1当量)反应，以提供醇162a或162b。当未受保护的丙二胺用于上述反应时，通过在高真空下蒸发来去除过量的二胺并且使用CbzCl保护162a中的游离氨基，以在通过柱色谱法纯化之后提供呈白色固体的162b。在TMSOTf的存在下，使醇162b与化合物4进一步反应，以提供163a，所述163a通过使用催化氢化去除Cbz基团而转化为163b。通过使三元酸113(参见实施例48)与DMF(0.1M至0.5M)中的PFPTFA(3.5当量)和吡啶(3.5当量)反应来制备五氟苯基(PFP)酯164。使三酯164与胺163b(3-4当量)和DIPEA(3-4当量)直接反应，以提供化合物18。以上方法极大地促进中间体的纯化并且使副产物的形成最小化，所述副产物使用实施例4中描述的工序形成。

实施例54：用于制备化合物18(GalNAc

使用实施例53中概述的工序由酸113制备三PFP酯164并且使其与单-Boc保护的二胺反应，以提供基本上定量产率的165。用盐酸或三氟乙酸去除Boc基团以提供三胺，所述三胺在合适的碱如DIPEA的存在下与PFP活化的酸166反应，以提供化合物18。

通过用DMF中的PFPTFA(1-1.2当量)和吡啶(1-1.2当量)处理来由对应的酸制备PFP保护的Gal-NAc酸166。继而通过使用乙腈和水中的TEMPO(0.2当量)和BAIB的氧化来由对应的醇制备前体酸。使用先前在实施例47中描述的条件，通过与1，6-己二醇(或1，5-戊二醇或对于其它n值的其它二元醇)(2-4当量)和TMSOTf反应来由糖中间体4制备前体醇。

实施例55：靶向SRB-1的包含3′-缀合物基团或5′-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc

表39

靶向SRB-1的修饰ASO

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664078、661161、665001或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和

如表40中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc

表40

靶向SRB-1的含有GalNAc

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。

表41

实施例56：靶向SRB-1的包含3′-缀合物基团或5′-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc

表42

靶向SRB-1的修饰ASO

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664507、661161、666224、666961、666981、666881或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和

如表43中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，缀合反义寡核苷酸与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。5′缀合的反义寡核苷酸与3′缀合的反义寡核苷酸相比显示出效力稍微增加。

表43

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表44中示出。

表44

实施例57：靶向ApoC III的包含3′-缀合物基团的寡核苷酸的体内作用持续时间研究

用以下指示的剂量注射小鼠一次并且经过42天的过程监测ApoC-III和血浆甘油三酯(血浆TG)水平。在每个组中使用3只表达人APOC-III的转基因小鼠进行研究。

表45

靶向ApoC III的修饰ASO

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

表46

ApoC III mRNA(第1天时的％盐水)和血浆TG水平(第1天时的％盐水)

如上表中可看出，与未缀合寡核苷酸相比，作用持续时间随着3′-缀合物基团的添加而增加。与缀合的全部PS寡核苷酸647535相比，对于缀合的混合PO/PS寡核苷酸647536存在作用持续时间的进一步增加。

实施例58：靶向SRB-1的包含3′-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 440762作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2′-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3′末端处。

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用ISIS 440762、651900、663748或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和

如表47中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc

表47

靶向SRB-1的修饰ASO

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表48中示出。

表48

实施例59：靶向FXI的GalNAc

在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的FXI的反义抑制。包括ISIS404071作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2′-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3′末端处。

表49

靶向FXI的修饰ASo

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用ISIS 404071、656172、656173或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)，一周两次，持续3周。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和

表50

因子XI mRNA(％盐水)

如表50中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI mRNA水平。包含3′-GalNAc

如表50a中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI蛋白水平。包含3′-GalNAc

表50a

因子XI蛋白(％盐水)

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素、总白蛋白、CRE和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。

表51

实施例60：靶向SRB-1的缀合ASO的体外作用

在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对原代小鼠肝细胞中的SRB-1的反义抑制。包括ISIS 353382作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2′-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3′或5′末端处。

表52

靶向SRB-1的修饰ASO

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

处理

在体外在小鼠原代肝细胞中测试以上列出的寡核苷酸，所述小鼠原代肝细胞以25,000个细胞/孔的密度涂布并且用0.03nM、0.08nM、0.24nM、0.74nM、2.22nM、6.67nM或20nM修饰寡核苷酸处理。在大约16小时的处理期之后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过

使用标准方法计算IC

表53

实施例61：包含GalNAc

化合物169为商业上可获得的。通过向化合物171添加苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯来制备化合物172。通过向DMF中的5-(苯甲氧基)-5-氧戊酸添加PFP-TFA和DIEA来制备苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯。使用实施例46中说明的一般工序由化合物174制备包含GalNAc

实施例62：包含GalNAc

使用实施例2中示出的一般工序制备化合物176。使用实施例49中说明的一般工序由化合物177制备包含GalNAc

实施例63：包含GalNAc

化合物181和185为商业上可获得的。使用实施例46中说明的一般工序由化合物187制备包含GalNAc

实施例64：包含GalNAc

化合物189为商业上可获得的。使用实施例31中示出的一般工序制备化合物195。使用标准寡核苷酸合成工序由化合物194和195制备包含GalNAc

实施例65：靶向SRB-1的包含5’-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。GalNAc

表54

靶向SRB-1的修饰ASO

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用ISIS 353382、661161、671144、670061、671261、671262或用盐水皮下注射六至八周龄C57b16小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次或两次。给药两次的小鼠在第一次剂量之后三天接受第二次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和

如表55中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。在接受单一剂量的动物与接受两次剂量的动物之间没有观察到靶敲除的显著差异(参见ISIS 353382剂量30mg/kg和2x15mg/kg；以及ISIS 661161剂量5mg/kg和2x2.5mg/kg)。包含磷酸二酯连接的GalNAc

表55

SRB-1 mRNA(％盐水)

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表56中示出。

表56

实施例66：各种可裂解部分对通过包含5'-GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc

表57

靶向SRB-1的修饰ASO

大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用ISIS 661161、670699、670700、670701、671165或用盐水皮下注射六至八周龄C57b16小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和

如表58中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。包含各种可裂解部分的反义寡核苷酸均显示出类似的效力。

表58

SRB-1 mRNA(％盐水)

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表59中示出。

表59

实施例67：包含GalNAc

使用实施例7和9中说明的一般工序制备包含GalNAc

实施例68：包含GalNAc

使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc

实施例69：包含GalNAc

使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc

实施例70：包含GalNAc

使用实施例52中说明的一般工序由化合物64制备包含GalNAc

实施例71：包含GalNAc

通过将PFP-TFA和DIEA添加至乙腈中的6-(2，2，2-三氟乙酰氨基)己酸来制备化合物205，所述乙腈中的6-(2，2，2-三氟乙酰氨基)己酸通过将三氟甲磺酸酐添加至6-氨基己酸来制备。将反应混合物加热至80℃，然后降低至室温。使用实施例52中说明的一般工序由化合物208制备包含GalNAc

实施例72：包含GalNAc

化合物211为商业上可获得的。使用实施例52中说明的一般工序由化合物213制备包含GalNAc

实施例73：包含GalNAc

使用二异丙基铵四唑由化合物219制备化合物220。使用实施例52中说明的一般工序由化合物220制备包含GalNAc

实施例74：各种可裂解部分对通过包含5'-GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc

表60

靶向SRB-1的修饰ASO

在所有表格中，大写字母指示每个核苷的核碱基并且

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用列于表60中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和

如表61中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸显示出类似的效力并且比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。

表61

SRB-1 mRNA(％盐水)

使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表62中示出。

表62

实施例75：包含5’-缀合物基团的寡核苷酸的药物代谢动力学分析

使用根据实施例65、66和74中描述的处理工序所获得的肝脏样品来评价以上表54、57和60中的ASO的PK。使用标准方案切碎并提取肝脏样品并且与内标物一起通过IP-HPLC-MS进行分析。通过对适当的UV峰进行积分来测量所有代谢物的组合的组织水平(μg/g)，并且使用适当的萃取离子色谱图(EIC)测量缺少缀合物的全长ASO(“母体”，在这种情况下为Isis No.353382)的组织水平。

表63

肝脏中的PK分析

以上表63中的结果显示，在寡核苷酸施用之后72小时，尤其当考虑到具有与不具有GalNAc

实施例76：包含GalNAc

化合物222为商业上可获得的。将44.48ml(0.33mol)的化合物222用吡啶(500mL)中的甲苯磺酰氯(25.39g，0.13mol)处理16小时。然后将反应物蒸发至油状物，溶解于EtOAc中并且用水、饱和NaHCO

为了生成化合物227，用五氟三氟乙酸酯(9.05ml，52.65mmol)逐滴处理硝基甲烷三丙酸(4.17g，15.04mmol)和Hunig氏碱(10.3ml，60.17mmol)在DMF(100mL)中的溶液。在30分钟之后，将反应物倾倒在冰水上并且用EtOAc萃取。将有机层用水、盐水洗涤，并且通过Na

使用实施例46中说明的一般工序由化合物229制备包含GalNAc

实施例77：通过包含GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。

表64

靶向SRB-1的修饰ASO

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用列于表64中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和

如表65中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。

表65

SRB-1 mRNA(％盐水)

使用标准方案，还测量了血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表66中示出。

表66

实施例78：通过包含GalNAc

在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对血压正常的斯普拉道来大鼠中的血管紧张素原(AGT)的反义抑制。

表67

靶向AGT的修饰ASO

GalNAc

处理

在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表67中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性斯普拉道来大鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将大鼠处死。使用实时PCR和

如表68中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。

表68

AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平

使用标准方案，在处死时还测量了血浆中的肝脏转氨酶水平(即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST))和体重。结果在以下表69中示出。

表69

肝脏转氨酶水平和大鼠体重

实施例79：包含GalNAc

在单一剂量研究中测试列于以下表70中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。

表70

靶向APOC-III的修饰ASO

GalNAc

处理

用列于表70中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的六至八周龄转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后72小时、1周、2周、3周、4周、5周和6周时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现，表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出比不具有缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 304801)更长的作用持续时间，即使母体剂量为包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸剂量的三倍也是如此。

表71

转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平

实施例80：通过包含GalNAc

在研究中测试列于以下表72中的寡核苷酸对小鼠中的A1AT的剂量依赖性抑制。

表72

靶向A1AT的修饰ASO

GalNAc

处理

在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR和

如表73中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低A1AT肝脏mRNA和A1AT血浆蛋白水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比母体(ISIS 476366)显著更有效。

表73

A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平

使用标准方案在处死时测量血浆中的肝脏转氨酶和BUN水平。还测量了体重和器官重量。结果在以下表74中示出。体重以相对于基线的％示出。器官重量以相对于PBS对照组的体重的％示出。

表74

实施例81：包含GalNAc

在单一剂量研究中测试列于表72中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。

处理

用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定基线并且在剂量之后5天、12天、19天和25天时抽血。通过ELISA测量血浆A1AT蛋白水平(参见实施例80)。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆A1AT蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸更有效并且比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 476366)具有更长的作用持续时间。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 678381、678382、678383和678384)通常比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656326)甚至更有效并且作用持续时间甚至更长。

表75

小鼠中的血浆A1AT蛋白水平

实施例82：通过包含GalNAc

在处理之前2小时，以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝脏肝细胞接种于96孔平板中。以2nM、10nM、50nM或250nM在Williams E培养基中添加列于表76中的寡核苷酸，并且将细胞在37℃下在5％CO

表76

SRB-1表达的体外抑制

GalNAc

实施例83：通过包含GalNAc

在研究中测试列于以下表77中的寡核苷酸对小鼠中的因子XI的剂量依赖性抑制。

表77

靶向因子XI的修饰寡核苷酸

GalNAc

处理

在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用以下列出的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将小鼠处死。根据标准方案使用实时PCR测量因子XI肝脏mRNA水平并且归一化为亲环蛋白。还测量了肝脏转氨酶、BUN和胆红素。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的平均百分比呈现。

如表78中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子XI肝脏mRNA。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效。

表78

因子XI肝脏mRNA、肝脏转氨酶、BUN和胆红素水平

实施例84：包含GalNAc

在单一剂量研究中测试列于表77中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。

处理

用列于表77中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天通过尾部放血抽血以确定基线并且在剂量之后3天、10天和17天时抽血。使用来自R&D Systems，Minneapolis，MN的因子XI捕获和生物素化的检测抗体(分别为目录号AF2460和BAF2460)和OptEIA Reagent Set B(目录号550534，BDBiosciences，San Jose，CA)通过ELISA测量血浆因子XI蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆因子XI蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效且作用持续时间更长。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效并且作用持续时间甚至更长。

表79

小鼠中的血浆因子XI蛋白水平

实施例85：通过包含GalNAc

在剂量依赖性研究中测试列于表76中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。

处理

在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表76中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和

如表80和81中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。

表80

肝脏中的SRB-1 mRNA

表81

肝脏中的SRB-1 mRNA

还使用标准方案测量了肝脏转氨酶水平、总胆红素、BUN和体重。每个处理组的平均值在以下表82中示出。

表82

实施例86：通过包含GalNAc

在剂量依赖性研究中测试列于以下表83中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。

处理

每周一次用列于下表中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射八周龄TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。在整个实验的各个时间点进行尾部放血，测量血浆TTR蛋白、ALT和AST水平并且报道于表85-87中。在将动物处死之后，测量血浆ALT、AST和人TTR水平以及体重、器官重量和肝脏人TTR mRNA水平。使用临床分析器(AU480，Beckman Coulter，CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和

在表84-87中，“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表84和85中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 420915)更有效。此外，包含GalNAc缀合物和混合的PS/PO核苷间键联的寡核苷酸甚至比包含GalNAc缀合物和全部PS键联的寡核苷酸更有效。

表83

靶向人TTR的寡核苷酸

表85的图例可见于实施例74。GalNAc

表84

人TTR的体内反义抑制

表85

人TTR的体内反义抑制

表86

转氨酶水平、体重变化和相对器官重量

表87

转氨酶水平、体重变化和相对器官重量

实施例87：单一剂量的包含GalNAc

在单一剂量研究中测试ISIS号420915和660261(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。在单一剂量研究中还测试ISIS号420915、682883和682885(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。

处理

用100mg/kg ISIS No.420915或13.5mg/kg ISIS No.660261各自皮下注射表达人TTR的八周龄雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。

表88

血浆TTR蛋白水平

处理

用100mg/kg ISIS No.420915、10.0mg/kg ISIS No.682883或10.0mg/kg 682885各自皮下注射表达人TTR的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。

表89

血浆TTR蛋白水平

表88和89中的结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 420915)更有效并且作用持续时间更长。

实施例88：通过包含GalNAc

测试列于表90中的寡核苷酸对小鼠中的人存活运动神经元(SMN)的剪接调节。

表90

靶向SMN的修饰ASO

GalNAc

ISIS号703421和703422为吗啉代寡核苷酸，其中两个寡核苷酸中的每个核苷酸为吗啉代核苷酸。

处理

用列于表91中的寡核苷酸或用盐水皮下注射表达人SMN的六周龄转基因小鼠一次。每个处理组由2只雄性和2只雌性组成。在剂量之后3天将小鼠处死，以根据标准方案使用实时PCR测定具有和不具有外显子7的肝脏人SMN mRNA水平。使用Ribogreen试剂测量总RNA。将SMN mRNA水平归一化为总mRNA，并且进一步归一化为盐水处理组的平均值。包括外显子7的SMN mRNA与缺失外显子7的SMN mRNA的所得平均比率在表91中示出。结果显示，调节剪接并包含GalNAc缀合物的完全修饰的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸在改变肝脏中的剪接上显著更有效。此外，对于多种修饰化学包括2'-MOE和吗啉代修饰的寡核苷酸，将维持这个趋势。

表91

靶向人SMN的寡核苷酸的体内作用

实施例89：通过包含GalNAc

在研究中测试列于以下表92中的寡核苷酸对转基因小鼠中的Apo(a)的剂量依赖性抑制。

表92

靶向Apo(a)的修饰ASO

GalNAc

处理

在以下示出的剂量(总共六次剂量)下，每周一次用列于表92中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射八周龄雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。每个处理组由3-4只动物组成。在第一次剂量前一天进行尾部放血并且每周在每次剂量之后进行尾部放血以测定血浆Apo(a)蛋白水平。在最后施用之后两天将小鼠处死。使用实时PCR和

如表93中所说明，用寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平。此外，包含GalNA

表93

Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平

表94

实施例90：通过包含GalNAc

在剂量依赖性研究中测试列于以下表95中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。

处理

每周一次用列于表96中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在第一次剂量之前，进行尾部放血以测定基线(BL)处的血浆TTR蛋白水平。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用临床分析器(AU480，Beckman Coulter，CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和

表95

靶向人TTR的寡核苷酸

表95的图例可见于实施例74。GalNAc

表96

人TTR的体内反义抑制

实施例91：通过包含GalNAc

在非终止的剂量递增研究(non-terminal，dose escalation study)中测试列于以下表97中的寡核苷酸对猴子中的因子VII的反义抑制。

处理

用递增剂量的列于表97中的寡核苷酸或用PBS在第0天、第15天和第29天时各自皮下注射非首次用于实验的猴子。每个处理组由4只雄性和1只雌性组成。在第一次剂量之前并且在此后的各个时间点进行抽血以测定血浆因子VII蛋白水平。通过ELISA测量因子VII蛋白水平。呈现于表98中的结果为相对于基线(BL)处的PBS组的平均值(刚好在第一次剂量之前取得的测量结果)的每个处理组的平均值。如表98中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子VII表达水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸与缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸相比在猴子中显著更有效。

表97

靶向因子VII的寡核苷酸

表97的图例可见于实施例74。GalNAc

表98

因子VII血浆蛋白水平

实施例92：通过包含GalNAc

以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝细胞接种于96孔平板中，并且以0.46nM、1.37nM、4.12nM或12.35nM、37.04nM、111.11nM或333.33nM或1.00μM添加靶向小鼠ApoC-III的列于表99中的寡核苷酸。在用寡核苷酸孵育24小时之后，使细胞裂解并且使用RNeasy(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和

表99

小鼠原代肝细胞中小鼠APOC-III表达的抑制

GalNAc

实施例93：通过包含混合翼和5’-GalNAc

在剂量依赖性研究中测试列于表100中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。

表100

靶向SRB-1的修饰ASO

GalNAc

处理

在以下示出的剂量下用列于表100中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。如表101中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平，并且包含GalNAc缀合物并具有为全部cEt或混合糖修饰的翼的缺口聚物寡核苷酸比缺乏缀合物并包含全部cEt修饰的翼的母体寡核苷酸显著更有效。

还测量了体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN，并且每个处理组的平均值在表101中示出。体重以相对于刚好在寡核苷酸剂量之前测量的基线体重的体重平均百分比(％BL)示出。

表101

SRB-1 mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重

实施例94：通过包含2’-糖修饰和5'-GalNAc

在剂量依赖性研究中测试列于表102中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。

表102

靶向SRB-1的修饰ASO

下标“m”指示2'-O-甲基修饰的核苷。对于完整的表格图例参见实施例74。GalNAc

处理

使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表103中示出并且显示包含GalNAc缀合物的2'-MOE和2'-OMe修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物的相应母体寡核苷酸显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。

表103

SRB-1 mRNA

实施例95：通过包含双环核苷和5'-GalNAc

SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制

在剂量依赖性研究中测试列于表104中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。

表104

靶向SRB-1的修饰ASO

下标“g”指示氟-HNA核苷，下标“l”指示包含2'-O-CH

处理

使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表105中示出并且显示包含GalNAc缀合物和各种双环核苷修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含双环核苷修饰的母体寡核苷酸显著更有效。此外，包含GalNAc缀合物和氟-HNA修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含氟-HNA修饰的母体显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。

表105

SRB-1mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重

实施例96：包含GalNAc

在超滤测定中测试靶向ApoC-III的列于表70中的寡核苷酸和靶向Apo(a)的列于表106中的寡核苷酸以便评估血浆蛋白结合。

表106

靶向Apo(a)的修饰寡核苷酸

对于表格图例参见实施例74。GalNAc

将Ultrafree-MC超滤单元(30,000NMWL，低结合再生的纤维素膜，Millipore，Bedford，MA)用300μL的0.5％Tween 80预调节并且在2000g下离心10分钟，然后用300μL的对照寡核苷酸在H

收集于K3-EDTA中的来自正常的无药物人志愿者、食蟹猴和CD-1小鼠的冷冻全血浆样品购自Bioreclamation LLC(Westbury，NY)。在两种浓度(5μg/mL和150μg/mL)下将测试寡核苷酸添加至1.2mL血浆等分试样中。将每个掺加的血浆样品的等分试样(300μL)放置于预调节的过滤器单元中并且在37℃下孵育30分钟，接着立即在2000g下离心16分钟。通过ELISA分析过滤和未过滤的掺加的血浆样品的等分试样，以测定每个样品中的寡核苷酸浓度。每个浓度使用三次重复，以确定每个样品中结合和未结合的寡核苷酸的平均百分数。使用相对于未过滤样品的浓度的过滤样品的平均浓度来确定血浆中未结合至血浆蛋白的寡核苷酸的百分比(％未结合)。通过将每个寡核苷酸的％未结合除以％回收来校正非特异性结合的最终未结合寡核苷酸值。通过从100中扣除最终％未结合值来确定最终％结合寡核苷酸值。对于在每种血浆中测试的两种浓度的寡核苷酸(5μg/mL和150μg/mL)，结果在表107中示出。结果显示GalNAc缀合物基团对血浆蛋白结合不具有显著影响。此外，具有全部PS核苷间键联的寡核苷酸和具有混合PO/PS键联的寡核苷酸均结合血浆蛋白，并且具有全部PS键联的那些寡核苷酸比具有混合PO/PS键联的那些寡核苷酸结合血浆蛋白的程度略微更大。

表107

结合至血浆蛋白的修饰寡核苷酸的百分比

实施例97：包含GalNAc

将包含GalNAc缀合物的示于表108中的寡核苷酸设计成靶向TTR。

表108

靶向TTR的修饰寡核苷酸

表108的图例可见于实施例74。GalNAc

实施例98：在hPMBC测定中评价包含GalNAc缀合物的寡核苷酸的促炎性作用

在如实施例23和24中所描述的hPMBC测定中测试列于表109中的寡核苷酸的促炎性作用。(对于寡核苷酸的描述参见表30、83、95和108。)ISIS 353512为用作阳性对照的高响应者，并且其它寡核苷酸描述于表83、95和108中。使用来自一位志愿者供体的血液获得示于表109中的结果。结果显示，与具有全部PS键联的相同寡核苷酸相比，包含混合PO/PS核苷间键联的寡核苷酸产生显著较低的促炎性反应。此外，GalNAc缀合物基团在此测定中不具有显著作用。

表109

实施例99：包含GalNAc缀合物的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力

在竞争性受体结合测定中测试列于表110中的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力(对于寡核苷酸的描述，参见表76)。将竞争配体α1-酸糖蛋白(AGP)在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中用1U神经氨酸酶-琼脂糖在37℃下孵育16小时，并且通过唾液酸测定或尺寸排阻色谱法(SEC)来证实＞90％的去唾液酸化。根据Atsma等的工序使用一氯化碘来碘化AGP(参见J Lipid Res.1991年1月；32(1)：173-81。)。在此方法中，将去唾液酸化的α1-酸糖蛋白(de-AGP)添加至0.25M NaOH中的10mM氯化碘、Na

从在五个不同日子进行的实验中获得表110中的结果。用上标“a”标志的寡核苷酸的结果为在两个不同日子进行的实验的平均值。结果显示，在5’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以比在3’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸大1.5倍至16倍的亲和力结合人HepG2细胞上的去唾液酸糖蛋白受体。

表110

去唾液酸糖蛋白受体结合测定结果

实施例100：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制

在单一剂量研究中测试列于以下表111a中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。

表111a

靶向APO(a)的修饰ASO

GalNAc

处理

每周一次用列于表111b中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雌性转基因小鼠，总共6次剂量。每个处理组由3只动物组成。在给药前一天抽血以测定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后72小时、1周和2周时抽血。在第一次剂量之后3周、4周、5周和6周时将发生另外的抽血。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表111b中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比(％BL)呈现。结果显示包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出Apo(a)表达的有效减少。对于包含全部PS核苷间键联的寡核苷酸和包含混合PO和PS键联的寡核苷酸观察到这种有效作用。

表111b

Apo(a)血浆蛋白水平

实施例101：通过包含经由稳定部分连接的GalNAc聚簇的寡核苷酸进行的反义抑制

测试列于表112中的寡核苷酸对小鼠APOC-III表达的体内抑制。用列于表112中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射C57Bl/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。用ISIS440670处理的每只小鼠接受2mg/kg、6mg/kg、20mg/kg或60mg/kg的剂量。用ISIS 680772或696847处理的每只小鼠接受0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg。ISIS 696847的GalNAc缀合物基团经由稳定部分连接，所述稳定部分为硫代磷酸酯键联而不是能够易于裂解的含磷酸二酯的键联。在剂量之后72小时将动物处死。使用实时PCR测量肝脏APOC-III mRNA水平。根据标准方案将APOC-III mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的APOC-III mRNA水平的平均百分比呈现于表112中。结果显示包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸比缺乏缀合物基团的寡核苷酸显著更有效。此外，包含经由可裂解部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 680772)甚至比包含经由稳定部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 696847)更有效。

表112

靶向小鼠APOC-III的修饰寡核苷酸

GalNAc

实施例102：包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸在肝脏中的分布

评价了不包含GalNAc缀合物的ISIS 353382(参见表36)和包含GalNAc缀合物的ISIS 655861(参见表36)的肝脏分布。以列于表113中的剂量用ISIS 353382或655861皮下注射雄性balb/c小鼠一次。每个处理组由3只动物组成，除了ISIS 655861的18mg/kg组，所述组由2只动物组成。在剂量之后48小时将动物处死以确定寡核苷酸的肝脏分布。为了测量每个细胞的反义寡核苷酸分子的数量，将钌(II)三-联吡啶标签(MSD TAG，Meso ScaleDiscovery)缀合至用来检测反义寡核苷酸的寡核苷酸探针。呈现于表113中的结果为以百万个寡核苷酸分子/细胞单位计的每个处理组的寡核苷酸的平均浓度。结果显示，在等效剂量下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更高的浓度存在于总肝脏和肝细胞中。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更低的浓度存在于非实质肝脏细胞中。虽然ISIS 655861在肝细胞和非实质肝脏细胞中的浓度为每个细胞类似的，但是肝脏大约为80％体积肝细胞。因此，存在于肝脏中的大多数ISIS 655861寡核苷酸见于肝细胞中，而存在于肝脏中的大多数ISIS 353382寡核苷酸见于非实质肝脏细胞中。

表113

实施例103：包含GalNAc

在单一剂量研究中测试列于以下表114中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。

表114

靶向APOC-III的修饰ASO

GalNAc

处理

用列于表114中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后3天、7天、14天、21天、28天、35天和42天时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。表115中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现。实施例79的表71中的结果与以下表115中的结果的比较显示，包含磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间键联的混合物的寡核苷酸表现出比仅包含硫代磷酸酯核苷间键联的相当(equivalent)寡核苷酸增加的作用持续时间。

表115

转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平

实施例104：包含5'-GalNAc

化合物120为商业上可获得的，并且化合物126的合成描述于实施例49中。将化合物120(1g，2.89mmol)、HBTU(0.39g，2.89mmol)和HOBt(1.64g，4.33mmol)溶解于DMF(10mL中，并且添加N，N-二异丙基乙胺(1.75mL，10.1mmol)。在约5min之后，将氨基己酸苄基酯(1.36g，3.46mmol)添加至反应物中。在3h之后，将反应混合物倾入100mL的1M NaHSO4中并且用2x50mL乙酸乙酯萃取。合并有机层并且用3x40mL饱和NaHCO

实施例105：包含GalNAc

化合物166的合成描述于实施例54中。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸236。

或者，使用以下示出的方案合成寡核苷酸236，并且使用实施例10中描述的工序使用化合物238来形成寡核苷酸236。

缀合物基团GalNAc

实施例106：通过包含5'-GalNAc

在剂量依赖性研究中测试列于表116和117中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。

处理

用2mg/kg、7mg/kg或20mg/kg的ISIS No.440762，或用0.2mg/kg、0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg的ISIS No.686221、686222或708561，或用盐水皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。反义寡核苷酸以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平，并且ED

表116

靶向SRB-1的修饰寡核苷酸

对于表格图例，参见实施例93。GalNAc

表117

靶向SRB-1的修饰寡核苷酸

对于表格图例，参见实施例93。GalNAc

使用实施例75中描述的工序，还评价了表116和117中的寡核苷酸在肝脏中的浓度。如通过UV以μg寡核苷酸/克肝脏组织的单位所测量，示于以下表117a和117b中的结果为每个处理组的平均总反义寡核苷酸组织水平。结果显示，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以显著高于相同剂量的缺乏GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的水平在肝脏中积累。此外，在其相应缀合物基团中包含一个、两个或三个GalNAc配体的反义寡核苷酸均以类似水平在肝脏中积累。由以上引用的Khorev等参考文献来看此结果为令人惊奇的并且与示于以上表116和117中的活性数据一致。

表117a

包含GalNAc

表117b

包含GalNAc

实施例107：包含GalNAc

通过使用DMF中的HBTU和DIEA将化合物47(参见实施例15)偶联至酸64(参见实施例32)来合成寡核苷酸239。将所得到的含酰胺化合物亚磷酸酯化，然后使用实施例10中描述的工序添加至寡核苷酸的5’-末端。缀合物基团GalNAc

为了将GalNAc

缀合物基团GalNAc

实施例108：通过靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸进行的体内反义抑制

在单一剂量研究中在小鼠中测试列于以下表118中的寡核苷酸。

表118

靶向APO(a)的修饰ASO

GalNAc

处理

用列于表119中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后1周时抽血。另外的抽血将每周发生，持续大约8周。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表119中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比(％BL)呈现。结果显示反义寡核苷酸减少Apo(a)蛋白表达。此外，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出甚至比不包含缀合物基团的寡核苷酸更有效的Apo(a)表达减少。

表119

Apo(a)血浆蛋白水平

实施例109：包含GalNAc

使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成亚磷酰胺中间体，接着使用实施例10中描述的工序合成寡核苷酸来合成寡核苷酸241。缀合物基团GalNAc

为了将GalNAc

缀合物基团GalNAc

实施例110：包含GalNAc

如上所示，合成包含GalNAc

实施例111：包含GalNAc

如上所示，合成包含GalNAc

以下示出包含GalNAc

如上所示，合成包含GalNAc

实施例112：包含GalNAc

用GalNAc

表120

实施例113：人原代肝细胞中的人载脂蛋白(a)(apo(a))的剂量依赖性反义抑制

在人原代肝细胞中的单剂量测定中测试所选择的来自先前公开案(WO2005/000201，其内容整体以引用的方式并入本文)的缺口聚物反义寡核苷酸。细胞获自TissueTransformation Technologies(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)并且用150nM反义寡核苷酸进行处理。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA并且通过定量实时PCR测量apo(a)mRNA水平。使用人apo(a)引物探针组hAPO(a)3’(正向序列ACAGCAATCAAACGAAGACACTG，本文指定为SEQ ID NO：5；反向序列AGCTTATACACAAAAATACCAAAAATGC，本文指定为SEQ ID NO：6；探针序列TCCCAGCTACCAGCTATGCCAAACCTT，本文指定为SEQ ID NO：7)来测量mRNA水平。另外，使用人apo(a)引物探针组hAPO(a)12kB(正向序列CCACAGTGGCCCCGGT，本文指定为SEQ ID NO：8；反向序列ACAGGGCTTTTCTCAGGTGGT，本文指定为SEQ ID NO：9；探针序列CCAAGCACAGAGGCTCCTTCTGAACAAG，本文指定为SEQ ID NO：10)来测量mRNA水平。将Apo(a)mRNA水平归一化为GAPDH mRNA表达。结果在下表中呈现为相对于未处理对照细胞的apo(a)的抑制百分比。

表121

人原代肝细胞中的人apo(a)的反义抑制

选择了若干反义寡核苷酸用于在剂量反应测定中的进一步测试。

所选择的反义寡核苷酸在人原代肝细胞中以下表中规定的25nM、50nM、150nM或300nM浓度的反义寡核苷酸进行测试。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA并且通过定量实时PCR测量apo(a)mRNA水平。使用人apo(a)引物探针组hAPO(a)3’测量mRNA水平。将Apo(a)mRNA水平归一化为GAPDH mRNA表达。结果呈现为相对于未处理对照细胞的apo(a)的抑制百分比。

表122

采用hAPO(a)3’所测量的在人原代肝细胞中的人apo(a)的剂量依赖性反义抑制

ISIS 144367证明了比其它反义寡核苷酸更好的功效和剂量依赖性。因此，将ISIS144367视作基准反义寡核苷酸来比较本文公开的新设计反义寡核苷酸的效力。

实施例114：转基因小鼠原代肝细胞中的人apo(a)的反义抑制

新设计了靶向apo(a)核酸的反义寡核苷酸并且体外测试其对apo(a)mRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列平行实验中测试反义寡核苷酸的效力。在此研究中使用来自人apo(a)转基因小鼠的原代肝细胞(Frazer，K.A.等，Nat.Genet.1995.9：424-431)。使用电穿孔，以1,000nM反义寡核苷酸转染密度为35,000细胞每孔的肝细胞。在约24小时的处理期之后，从细胞分离RNA并且通过定量实时PCR测量apo(a)mRNA水平。使用人引物探针组hAPO(a)12kB测量mRNA水平。根据如

新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5 MOE缺口聚物。缺口聚物长为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2'-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

apo(a)靶序列含有多个Kringle重复序列，因此反义寡核苷酸可靶向apo(a)的一个或多个区域，这取决于寡核苷酸是否靶向Kringle序列。“起始位点”表示人序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示人序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷。apo(a)反义寡核苷酸可具有多于一个“起始位点”或“终止位点”，这取决于它是否靶向Kringle重复。

表格中列出的大多数缺口聚物以100％互补性靶向于在本文指定为SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_005577.2)的人apo(a)mRNA或在本文指定为SEQ ID NO：2(从核苷酸3230000至3380000截短的GENBANK登录号NT_007422.12)的人apo(a)的基因组序列或两者的一个或多个区域。‘n/a'表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定序列。

表123

表124

表125

表126

表127

表128

表129

表130

表131

表132

表133

实施例115：转基因小鼠原代肝细胞中的apo(a)的剂量依赖性反义抑制

选择来自上述研究的展现对apo(a)mRNA的显著体外抑制的缺口聚物，并且在具有类似培养条件的一系列平行研究中，在转基因小鼠原代肝细胞中以不同剂量进行测试。将细胞以35,000每孔的密度铺板并且使用电穿孔，以0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.500μM或1.000μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA并且通过定量实时PCR测量apo(a)mRNA水平。使用Apo(a)引物探针组hAPO(a)12kB测量mRNA水平。根据如

每个研究的结果描绘在以下呈现的表格中，每个表代表单独的实验。表中还呈现了每个寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC

表134

表135

表136

表137

表138

表139

表140

表141

表142

如上表中所呈现，ISIS 494157(SEQ ID NO：12)、ISIS 494158(SEQ ID NO：13)、ISIS 494159(SEQ ID NO：14)、ISIS 494160(SEQ ID NO：15)、ISIS 494161(SEQ ID NO：16)、ISIS 494162(SEQ ID NO：17)、ISIS 494163(SEQ ID NO：18)、ISIS 494164(SEQ IDNO：19)、ISIS 494165(SEQ ID NO：20)、ISIS 494167(SEQ ID NO：22)、ISIS 494168(SEQ IDNO：23)、ISIS 494169(SEQ ID NO：24)、ISIS 494170(SEQ ID NO：25)、ISIS 494230(SEQ IDNO：105)、ISIS 494243(SEQ ID NO：106)、ISIS 494244(SEQ ID NO：107)、ISIS 494283(SEQID NO：26)、ISIS 494284(SEQ ID NO：27)、ISIS 494285(SEQ ID NO：28)、ISIS 494286(SEQID NO：29)、ISIS 494287(SEQ ID NO：30)、ISIS 494288(SEQ ID NO：31)、ISIS 494290(SEQID NO：32)、ISIS 494291(SEQ ID NO：33)、ISIS 494292(SEQ ID NO：35)、ISIS 494294(SEQID NO：36)、ISIS 494299(SEQ ID NO：37)、ISIS 494300(SEQ ID NO：38)、ISIS 494301(SEQID NO：39)、ISIS 494302(SEQ ID NO：40)、ISIS 494303(SEQ ID NO：41)、ISIS 494304(SEQID NO：42)、ISIS 494305(SEQ ID NO：43)、ISIS 494306(SEQ ID NO：44)、ISIS 494311(SEQID NO：47)、ISIS 494334(SEQ ID NO：48)、ISIS 494336(SEQ ID NO：49)、ISIS 494337(SEQID NO：50)、ISIS 494338(SEQ ID NO：133)、ISIS 494371(SEQ ID NO：57)、ISIS 494372(SEQ ID NO：58)、ISIS 494373(SEQ ID NO：59)、ISIS 494374(SEQ ID NO：60)、ISIS494375(SEQ ID NO：61)、ISIS 494386(SEQ ID NO：62)、ISIS 494389(SEQ ID NO：65)、ISIS494390(SEQ ID NO：66)、ISIS 494392(SEQ ID NO：68)、ISIS 494466(SEQ ID NO：108)、ISIS 494470(SEQ ID NO：109)、ISIS 494472(SEQ ID NO：110)、ISIS 494521(SEQ ID NO：51)、ISIS 494530(SEQ ID NO：53)、ISIS 498229(SEQ ID NO：75)、ISIS 498238(SEQ IDNO：76)、ISIS 498239(SEQ ID NO：77)、ISIS 498240(SEQ ID NO：78)、ISIS 498241(SEQ IDNO：79)、ISIS 498243(SEQ ID NO：81)、ISIS 498379(SEQ ID NO：70)、ISIS 498408(SEQ IDNO：71)、ISIS 498433(SEQ ID NO：72)、ISIS 498434(SEQ ID NO：73)、ISIS 498435(SEQ IDNO：74)、ISIS 498517(SEQ ID NO：85)、ISIS 498523(SEQ ID NO：92)、ISIS 498524(SEQ IDNO：93)、ISIS 498525(SEQ ID NO：94)、ISIS 498550(SEQ ID NO：97)、ISIS 498580(SEQ IDNO：103)、ISIS 498581(SEQ ID NO：104)、ISIS 498721(ATGCCTCGATAACTCCGTCC；SEQ IDNO：134)、ISIS 498833(SEQ ID NO：86)、ISIS 498875(SEQ ID NO：89)和ISIS 499020(SEQID NO：90)的效力高于ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。

实施例116：转基因小鼠原代肝细胞中的apo(a)的剂量依赖性反义抑制

进一步选择来自上述研究的有效力的缺口聚物，并且在具有类似培养条件的一系列研究中，在转基因小鼠原代肝细胞中以不同剂量进行测试。将细胞以35,000每孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.049μM、0.148μM、0.444μM、1.333μM或4.000μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA并且通过定量实时PCR测量apo(a)mRNA水平。使用Apo(a)引物探针组hAPO(a)12kB测量mRNA水平。根据如

每个研究的结果描绘在以下呈现的表格中，每个表代表单独的实验。表中还呈现了每个寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC

表143

表144

表145

表146

表147

实施例117：转基因小鼠原代肝细胞中的人apo(a)的反义抑制

新设计了靶向apo(a)核酸的另外的反义寡核苷酸并且体外测试其对apo(a)mRNA的作用。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。在此研究中使用来自人apo(a)转基因小鼠的原代肝细胞。使用电穿孔，以1,000nM反义寡核苷酸转染密度为35,000细胞每孔的肝细胞。在约24小时的处理期之后，从细胞分离RNA并且通过定量实时PCR测量apo(a)mRNA水平。使用人引物探针组hAPO(a)12kB测量mRNA水平。根据如

新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为3-10-4 MOE缺口聚物。缺口聚物长为17个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含三个核苷和四个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯(P＝S)键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

apo(a)靶序列含有多个Kringle重复序列，因此反义寡核苷酸可靶向apo(a)的一个或多个区域，这取决于寡核苷酸是否靶向Kringle序列。“起始位点”表示人序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷。“终止位点”表示人序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷。apo(a)反义寡核苷酸可具有多于一个“起始位点”或“终止位点”，这取决于它是否靶向Kringle重复。

表格中列出的大多数缺口聚物以100％互补性靶向于在本文指定为SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_005577.2)的人apo(a)mRNA或在本文指定为SEQ ID NO：2(从核苷酸3230000至3380000截短的GENBANK登录号NT_007422.12)的人apo(a)基因组序列或两者的多个区域。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定序列。

表148

表149

表150

实施例118：转基因小鼠原代肝细胞中的apo(a)的剂量依赖性反义抑制

进一步选择来自上述研究的有效力的缺口聚物，并且在具有类似培养条件的一系列研究中，在转基因小鼠原代肝细胞中以不同剂量进行测试。将细胞以35,000每孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.156μM、0.313μM、0.625μM、1.250μM、2.500μM或5.000μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA并且通过定量实时PCR测量apo(a)mRNA水平。使用Apo(a)引物探针组hAPO(a)12kB测量mRNA水平。根据如

每个研究的结果描绘在以下呈现的表格中，每个研究在单独的表中呈现。表中还呈现了每个寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC

表151

表152

表153

表154

在反义寡核苷酸处理的细胞中，Apo(a)mRNA水平以剂量依赖性反式显著降低。将新设计寡核苷酸的效力与基准寡核苷酸ISIS 144367进行比较。如上表中所呈现，ISIS510542(SEQ ID NO：111))、ISIS 510545(SEQ ID NO：114))、ISIS 510546(SEQ ID NO：115))、ISIS 510547(SEQ ID NO：116))、ISIS 510548(SEQ ID NO：117))、ISIS 510549(SEQID NO：118))、ISIS 510595(SEQ ID NO：119))、ISIS 510597(SEQ ID NO：120))、ISIS510598(SEQ ID NO：121))、ISIS 510701(SEQ ID NO：127))、ISIS 510702(SEQ ID NO：128))、ISIS 510704(SEQ ID NO：129))、ISIS 512944(SEQ ID NO：123))、ISIS 512947(SEQID NO：124))、ISIS 512958(SEQ ID NO：125)和ISIS 512959(SEQ ID NO：126)的效力高于ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。

实施例119：人apo(a)转基因小鼠中的人apo(a)的体内反义抑制的作用

在如下所述的研究中使用具有人apo(a)基因的转基因小鼠(Frazer，K.A.等，Nat.Genet.1995.9：424-431)。在此模型中进一步评价如上所述证明了对apo(a)mRNA的体外统计显著抑制的ISIS反义寡核苷酸。

将雌性人apo(a)转基因小鼠保持在12小时明/暗循环中，并自由进食正常实验室食物。将小鼠分成治疗组，每组4只小鼠。所述组以25mg/kg的剂量接受腹膜内注射ISIS494159、ISIS 494160、ISIS 494161、ISIS 494162、ISIS 494163、ISIS 494230、ISIS494243、ISIS 494244、ISIS 494283、ISIS 494284、ISIS 494285、ISIS 494286、ISIS494301、ISIS 494302、ISIS 494304、ISIS 494466、ISIS 494470、ISIS 494472、ISIS498239、ISIS 498408、ISIS 498517、ISIS 494158、ISIS 494311、ISIS 494337、ISIS494372、ISIS 498238、ISIS 498523、ISIS 498525、ISIS 510548、ISIS 512944、ISIS512947或ISIS 512958，每周两次，持续2周。一组小鼠接受腹膜内注射PBS，每周两次，持续2周。PBS组充当对照组。最后一次剂量两天后，使小鼠安乐死，收获器官并且进行分析。

人apo(a)mRNA的抑制

从一些治疗组的肝脏提取总RNA，并且通过RT-PCR量化人apo(a)mRNA。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比。

表155

转基因小鼠中人apo(a)mRNA的抑制百分比

数据证明了若干ISIS寡核苷酸对apo(a)mRNA的显著抑制。ISIS 494159(SEQ IDNO：14)、ISIS 494162(SEQ ID NO：17)、ISIS 494163(SEQ ID NO：18)、ISIS 494243(SEQ IDNO：106)、ISIS 494244(SEQ ID NO：107)、ISIS 494283(SEQ ID NO：26)、ISIS 494284(SEQID NO：27)、ISIS 494285(SEQ ID NO：28)、ISIS 494301(SEQ ID NO：39)和ISIS 498408(SEQ ID NO：71)的效力高于基准ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。

人human apo(a)蛋白的抑制

使用Apo(a)ELISA试剂盒(Mercodia 10-1106-01，Uppsala，Sweden)，从所有治疗组测量血浆人apo(a)蛋白。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比。

表156

转基因小鼠中人apo(a)蛋白的抑制百分比

数据证明了若干ISIS寡核苷酸对apo(a)mRNA的显著抑制。ISIS 494159(SEQ IDNO：14)、ISIS 494244(SEQ ID NO：82)、ISIS 494283(SEQ ID NO：26)、ISIS 494284(SEQ IDNO：27)、ISIS 494285(SEQ ID NO：28)、ISIS 494286(SEQ ID NO：29)、ISIS 494301(SEQ IDNO：39)和ISIS 494302(SEQ ID NO：40)的效力等于或高于基准ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。

在此转基因模型中进一步对ISIS 494159、ISIS 494161、ISIS 494162、ISIS494163和ISIS 494243进行评价。将ISIS 144367包括在内用于比较。

治疗

将雌性人apo(a)转基因小鼠分成治疗组，每组4只小鼠。所述组以1.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg或50mg/kg的剂量接受腹膜内注射ISIS 144367、ISIS 494159、ISIS 494161、ISIS 494162、ISIS 494163或ISIS 494243，每周两次，持续2周。一组小鼠接受腹膜内注射PBS，每周两次，持续2周。PBS组充当对照组。最后一次剂量两天后，使小鼠安乐死，收获器官并且进行分析。

人apo(a)mRNA的抑制

从治疗组的肝脏提取总RNA，并且通过RT-PCR量化人apo(a)mRNA。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比。

表157

转基因小鼠中人apo(a)mRNA的剂量依赖性抑制

数据证明了若干ISIS寡核苷酸对apo(a)mRNA的显著抑制。ISIS 494159(SEQ IDNO：14)、ISIS 494161(SEQ ID NO：16)、494162(SEQ ID NO：17)和ISIS 94163(SEQ ID NO：18)的效力高于基准ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。人apo(a)蛋白水平的降低

从治疗组采集血液，并且通过Apo(a)ELISA试剂盒(Mercodia 10-1106-01，Uppsala，Sweden)量化人apo(a)蛋白水平。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)蛋白水平的降低百分比。

表158

转基因小鼠中人apo(a)蛋白的剂量依赖性抑制

数据证明了若干ISIS寡核苷酸对apo(a)血浆蛋白水平的显著降低。ISIS 494159(SEQ ID NO：14)、ISIS 494161(SEQ ID NO：16)、ISIS 494162(SEQ ID NO：17)和ISIS494163(SEQ ID NO：18)的效力高于基准ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。

在此模型中进一步对ISIS 494244、ISIS 494283和ISIS 494284进行评价。将ISIS144367包括在内用于比较。

治疗

将雌性人apo(a)转基因小鼠分成治疗组，每组4只小鼠。所述组以0.75mg/kg、2.5mg/kg、7.5mg/kg或25mg/kg的剂量接受腹膜内注射ISIS 144367、ISIS 494244、ISIS494283或ISIS 494284，每周两次，持续2周。一组小鼠接受腹膜内注射PBS，每周两次，持续2周。PBS组充当对照组。最后一次剂量两天后，使小鼠安乐死，收获器官

并且进行分析。

人apo(a)mRNA的抑制

从治疗组的肝脏提取总RNA，并且通过RT-PCR量化人apo(a)mRNA。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比。

表159

转基因小鼠中人apo(a)mRNA的剂量依赖性抑制

数据证明了若干ISIS寡核苷酸对apo(a)mRNA的显著抑制。ISIS 494244(SEQ IDNO：107)、ISIS 494283(SEQ ID NO：26)和ISIS 494284(SEQ ID NO：27)的效力高于基准ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。

人apo(a)蛋白水平的降低

从治疗组采集血液，并且通过Apo(a)ELISA试剂盒(Mercodia 10-1106-01，Uppsala，Sweden)量化人apo(a)蛋白水平。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)蛋白水平的降低百分比。

表160

转基因小鼠中人apo(a)血浆蛋白的剂量依赖性抑制

数据证明了若干ISIS寡核苷酸对apo(a)血浆蛋白水平的显著降低。ISIS 494244(SEQ ID NO：107)、ISIS 494283(SEQ ID NO：26)和ISIS 494284(SEQ ID NO：27)的效力高于基准ISIS 144367(SEQ ID NO：11)。

在此模型中进一步对ISIS 494285、ISIS 494286、ISIS 494301、ISIS 494302和ISIS 494311进行评价。

治疗

将雄性人apo(a)转基因小鼠分成治疗组，每组4只小鼠。每个所述组以5mg/kg、15mg/kg或50mg/kg的剂量接受腹膜内注射ISIS 494285、ISIS 494286、ISIS 494301、ISIS494302或ISIS 494311，每周一次，持续2周。一个包括3只小鼠的组接受腹膜内注射PBS，每周一次，持续2周。PBS组充当对照组。最后一次剂量两天后，使小鼠安乐死，收获器官并且进行分析。

人apo(a)mRNA的抑制

从治疗组的肝脏提取总RNA，并且通过RT-PCR量化人apo(a)mRNA。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比。数据证明了ISIS 494285(SEQ IDNO：28)、ISIS 494286(SEQ ID NO：29)、ISIS 494301(SEQ ID NO：39)、ISIS 494302(SEQ IDNO：40)和ISIS 494311(SEQ ID NO：47)对apo(a)mRNA的显著抑制。

表161

转基因小鼠中人Apo(a)mRNA的剂量依赖性抑制

人apo(a)蛋白水平的降低

从治疗组采集血液，并且通过Apo(a)ELISA试剂盒(Mercodia 10-1106-01，Uppsala，Sweden)量化人apo(a)蛋白水平。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)蛋白水平的降低百分比。数据证明了ISIS 494285、ISIS 494286、ISIS 494301、ISIS494302和ISIS 494311对apo(a)血浆蛋白水平的显著降低。

表162

转基因小鼠中人apo(a)蛋白的剂量依赖性抑制

在此模型中进一步对ISIS 494372、ISIS 498524、ISIS 498581、ISIS 498721和ISIS 498833进行评价。

治疗

将雌性人apo(a)转基因小鼠分成治疗组，每组4只小鼠。所述组以5mg/kg、15mg/kg或50mg/kg的剂量接受腹膜内注射ISIS 494372、ISIS 498524、ISIS 498581、ISIS 498721或ISIS 498833，每周一次，持续2周。一个包括3只小鼠的组接受腹膜内注射PBS，每周一次，持续2周。PBS组充当对照组。最后一次剂量两天后，使小鼠安乐死，收获器官并且进行分析。

人apo(a)mRNA的抑制

从治疗组的肝脏提取总RNA，并且通过RT-PCR量化人apo(a)mRNA。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比。数据证明了ISIS 494372(SEQ IDNO：28)、ISIS 498524(SEQ ID NO：93)、ISIS 498581(SEQ ID NO：104)和ISIS 498721(ATGCCTCGATAACTCCGTCC；SEQ ID NO：134)对apo(a)mRNA的显著抑制。

表163

转基因小鼠中人Apo(a)mRNA的剂量依赖性抑制

人apo(a)蛋白水平的降低

从治疗组采集血液，并且通过Apo(a)ELISA试剂盒(Mercodia 10-1106-01，Uppsala，Sweden)量化人apo(a)蛋白水平。结果在下表中呈现，表达为相比于PBS对照组的apo(a)蛋白水平的降低百分比。数据证明了ISIS 494372(SEQ ID NO：28)、ISIS 498581(SEQ ID NO：104)和ISIS 498721(ATGCCTCGATAACTCCGTCC；SEQ ID NO：134)对apo(a)血浆蛋白水平的显著降低。

表164

转基因小鼠中人apo(a)蛋白的剂量依赖性抑制

实施例120：啮齿动物模型中靶向人apo(a)的反义寡核苷酸的耐受性

从上述研究中选择靶向人apo(a)的缺口聚物反义寡核苷酸以用于在CD1小鼠和在Sprague Dawley大鼠中的耐受性研究。啮齿动物不表达内源性apo(a)，因此这些研究测试了每个人反义寡核苷酸在动物中的耐受性，而非在动物中可能因抑制apo(a)所引起的任何表型改变。

治疗

对包括雄性CD1小鼠的组皮下注射50mg/kg的ISIS 494159、ISIS 494161、ISIS494162、ISIS 494244、ISIS 494283、ISIS 494284、ISIS 494285、ISIS 494286、ISIS494301、ISIS 494302、ISIS 494311、ISIS 494337、ISIS 494372和ISIS 510548，每周两次，持续6周。一个包括六周大的雄性CD1小鼠的组皮下注射PBS，每周两次，持续6周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。

血浆化学标志物

为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，Melville，NY)测量转氨酶、胆红素、白蛋白、肌酸酐和BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起肝脏或肾脏功能标志物中的任一者的水平改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。

表165

CD1小鼠的血浆化学标志物

器官重量

在研究结束时测量肝、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。

表166

CD1小鼠的器官重量(g)

Sprague-Dawley大鼠是用于安全性和功效评价的多用途模型。将大鼠用选自上述研究的ISIS反义寡核苷酸处理，并且评价各种血浆化学标志物水平的改变。

治疗

对包括雄性Sprague Dawley大鼠的组皮下注射30mg/kg的ISIS 494159、ISIS494161、ISIS 494162、ISIS 494244、ISIS 494283、ISIS 494284、ISIS 494285、ISIS494286、ISIS 494301、ISIS 494302、ISIS 494311、ISIS 494337、ISIS 494372和ISIS510548，每周两次，持续8周。一个包括六只雄性Sprague Dawley大鼠的组皮下注射PBS，每周两次，持续8周。最后一次剂量48小时后使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。

为了评价ISIS寡核苷酸对肝脏和肾脏功能的作用，使用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，Melville，NY)测量转氨酶、胆红素、白蛋白、肌酸酐和BUN的血浆水平。结果在下表中呈现。引起肝脏或肾脏功能标志物的水平改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。

表167

Sprague Dawley大鼠的血浆化学标志物

肾功能

为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的作用，使用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量总蛋白和肌酸酐的尿液水平。结果呈现在下表中，表达为mg/dL。

表168

Sprague-Dawley大鼠中的肾功能标志物(mg/dL)

器官重量

在研究结束时测量肝、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。引起器官重量的任何改变而超出反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸被排除在进一步的研究之外。

表169

Sprague Dawley大鼠的器官重量(g)

来自啮齿动物耐受性研究的发现显示，总体而言，考虑到所筛选的所有耐受性标志物，ISIS 494372是CD1小鼠模型和Sprague Dawley大鼠模型两者中耐受性最好的反义化合物。

实施例121：CD1小鼠中反义寡核苷酸的药代动力学

将CD1小鼠用ISIS寡核苷酸处理并且评估肝和肾中的寡核苷酸浓度。

治疗

对包括四只CD1小鼠的组各自皮下注射50mg/kg的ISIS 494283、ISIS 494284、ISIS 494286、ISIS 494301、ISIS 494302或ISIS 494372，每周两次，持续6周。最后一次剂量2天后牺牲小鼠。收获肝进行分析。

寡核苷酸浓度的测量

测量总寡核苷酸浓度。所使用的方法是先前公开的方法(Leeds等，1996；Geary等，1999)的改进版本，其由苯酚-氯仿(液-液)萃取、然后是固相萃取组成。在萃取之前添加内标物(ISIS 355868，27-mer 2'-O-甲氧基乙基修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本文指定为SEQ ID NO：131)。使用校准曲线计算组织样品的浓度，检测下限(LLOQ)为约1.14μg/g。使用WinNonlin software(PHARSIGHT)计算半衰期。

结果呈现在下表中，表达为μg/g肝或肾组织。数据表明ISIS494372在肝和肾中处于可接受的浓度。

表170

CD1小鼠中ISIS寡核苷酸的寡核苷酸浓度(μg/g组织)

实施例122：Sprague Dawley大鼠中反义寡核苷酸的药代动力学

将雄性Sprague Dawley大鼠用ISIS寡核苷酸处理并且评估肝和肾中的寡核苷酸浓度。

治疗

对包括四只大鼠的组各自皮下注射10mg/kg的ISIS 494283、ISIS 494284、ISIS494286、ISIS 494301、ISIS 494302或ISIS 494372，每周两次，持续3周。最后一次剂量2天后牺牲大鼠。收获肝进行分析。

寡核苷酸浓度的测量

测量总寡核苷酸浓度。所使用的方法是先前公开的方法(Leeds等，1996；Geary等，1999)的改进版本，其由苯酚-氯仿(液-液)萃取、然后是固相萃取组成。在萃取之前添加内标物(ISIS 355868，27-mer 2'-O-甲氧基乙基修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本文指定为SEQ ID NO：131)。使用校准曲线计算组织样品的浓度，检测下限(LLOQ)为约1.14μg/g。使用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。

结果呈现在下表中，表达为μg/g肝或肾组织。数据表明ISIS 494372在肝和肾中处于可接受的浓度。

表171

Sprague Dawley大鼠中ISIS寡核苷酸的寡核苷酸浓度(μg/g组织)

实施例123：食蟹猴中靶向人apo(a)的ISIS反义寡核苷酸的作用

将食蟹猴用选自以上研究的ISIS反义寡核苷酸处理。在进行此研究时，食蟹猴基因组序列在National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中是不可用的；因此，不能确认与食蟹猴基因序列的交叉反应性。取而代之，将食蟹猴中所用的ISIS反义寡核苷酸的序列与恒河猴序列针对同源性进行比较。预期与恒河猴序列具有同源性的ISIS寡核苷酸也与食蟹猴序列完全交叉反应。

所测试的人反义寡核苷酸也与恒河猴mRNA序列(XM_001098061.1；本文指定为SEQID NO：132)交叉反应。人寡核苷酸与恒河猴序列之间的互补性越高，人寡核苷酸与恒河猴序列交叉反应的可能性越大。每个寡核苷酸对SEQ ID NO：132的起始位点和终止位点呈现在下表中。每个反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO：132中的超过一个区域并且具有多个起始位点。“起始位点”表示恒河猴序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“错配”指示人寡核苷酸序列与恒河猴序列之间错配的核苷酸的数目。

评估反义寡核苷酸耐受性以及它们在肝和肾中的药代动力学特征。

表172

与SEQ ID NO：132互补的反义寡核苷酸

治疗

在研究之前，将猴子保持隔离至少30天的时间，在此期间，每天观察动物的一般健康状况。猴子是2-4岁并且重量在2至4kg之间。每组包括四只随即指派的雄性食蟹猴的七个组皮下注射ISIS寡核苷酸或PBS，注射使用适当尺寸的不锈钢给药针头和注射器，注射到猴子背上的四个部位之一中。注射以顺时针旋转给予；每次给药一个部位。使用40mg/kg的ISIS 494283、ISIS 494284、ISIS 494286、ISIS 494301、ISIS 494302或ISIS 494372，对猴子在第一周每周四次给药(第1、3、5和7天)以作为负荷剂量，并且随后每周一次持续2-12周。包括8只食蟹猴的对照组皮下注射PBS，第一周每周四次(第1、3、5和7天)，并且随后每周一次持续2-12周。

在研究期期间，每天至少一次观察猴子的生病或不适的迹象。在与实验负责人协商后，由兽医用得到批准的止痛剂或缓解疼痛的试剂处理经历因治疗、损伤或生病所引起的超过瞬时或轻微的疼痛或不适的任何动物。鉴定出任何处于不良健康状况或处于可能的濒死状况的动物以供进一步监测以及可能的安乐死。例如，发现ISIS 494302治疗组的一只动物在第56天是濒死的，因而被安乐死。在第86和87天在深度麻醉下通过放血法对动物进行预先安排的安乐死。实施例中所述的实验方案得到了Institutional Animal Care andUse Committee(IACUC)的批准。

RNA分析

在第86天，从肝组织提取RNA，以便使用人引物探针组ABI Hs00916691_m1(Applied Biosystems，Carlsbad CA)对apo(a)进行实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比。如下表中所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照组相比，apo(a)mRNA的显著减少。

还测量了另一个含kringle蛋白纤溶酶原的mRNA水平。用ISIS 494372处理未改变纤溶酶原的mRNA水平。

表173

食蟹猴肝中相对于PBS对照组的apo(a)mRNA的抑制百分比

蛋白质分析

在不同的天数，从所有研究猴子的头、隐或股静脉采集1毫升血液。将血液样品放入含有K2-EDTA的试管中进行血浆分离。将试管在室温以3,000rpm离心10min以获得血浆。通过Apo(a)ELISA试剂盒(Mercodia 10-1106-01，Uppsala，Sweden)分析Apo(a)蛋白水平。结果呈现为与基线相比的水平变化百分比。如下表中所示，用若干ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照组相比，apo(a)蛋白水平的显著减少。确切地说，ISIS 494372处理减少了apo(a)的食蟹猴血浆蛋白水平。

还在研究组中测量了apoB的蛋白水平。apo(a)的反义抑制对apoB水平无影响。

表174

食蟹猴中的Apo(a)血浆蛋白水平(与基线值相比的％抑制)

体重和器官重量测量

为了评估ISIS寡核苷酸对动物总体健康的影响，在第86天测量体重和器官重量。测量体重并呈现在下表中。测量器官重量并将数据呈现在下表中。结果表明用ISIS 494372处理就猴子的体重和器官重量而言耐受良好。

表175

食蟹猴中的体重(g)

表176

食蟹猴中的器官重量(％体重)

肝功能

为了评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使猴子在采血之前禁食过夜。从每只动物采集约1.5mL血液并且放入没有抗凝血剂的试管中进行血清分离。使试管在室温保持最少90min，然后在室温以3,000rpm离心10min以获得血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.，Japan)测量各种肝功能标志物的水平。测量ALT和AST的血浆水平并且将结果呈现在下表中，表达为IU/L。类似地测量肝功能标志物胆红素并且呈现在下表中，表达为mg/dL。结果表明用ISIS 494372处理就猴子的肝功能而言耐受良好。

表177

食蟹猴血浆中的肝功能标志物

C反应蛋白水平分析

为了评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中的任何炎性效应，采集血样进行分析。采血前使猴子禁食过夜。从每只动物采集约1.5mL血液并且放入没有抗凝血剂的试管中进行血清分离。使试管在室温保持最少90min，然后在室温以3,000rpm离心10min以获得血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.，Japan)测量C反应蛋白(CRP)，这种蛋白是在肝中合成的并且充当炎症标志物。结果表明用ISIS 494372处理未引起猴子中的任何炎症。

表178

食蟹猴血浆中的C反应蛋白水平(mg/L)

补体C3分析

为了评估ISIS寡核苷酸对食蟹猴中补体路径的任何影响，在第84天(给药前)和第85天(给药后24小时)采集血样进行分析。从每只动物采集约0.5mL血液并且放入没有抗凝血剂的试管中进行血清分离。使试管在室温保持最少90min，然后在室温以3,000rpm离心10min以获得血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.，Japan)测量C3。结果表明用ISIS 494372处理未对猴子中的补体路径产生任何影响。

表179

食蟹猴血浆中的补体C3水平(mg/dL)

血液学

为了评估ISIS寡核苷酸对食蟹猴中血液学参数的任何影响，在第87天从每只可用的研究动物采集大约0.5mL的血样，置于含有K

数据表明用ISIS 494372处理就猴子的血液学参数而言耐受良好。

表180

食蟹猴中的血细胞计数

实施例124：食蟹猴中ISIS 494372的药理活性的表征

通过测量被施用化合物13周并使其恢复另外13周的猴子中的肝apo(a)mRNA和血浆apo(a)水平来表征ISIS 494372的药理活性。

治疗

每组包括14只随即指派的雄性和雌性食蟹猴的五个组皮下注射ISIS寡核苷酸或PBS，注射使用适当尺寸的不锈钢给药针头和注射器，注射到猴子背上的四个部位(肩胛区域)之一中。如下表所示，猴子在第一周每周四次给药(第1、3、5和7)以作为负荷剂量，并且随后每周一次持续2-13周以作为维持剂量。第一周期间的负荷剂量表达为mg/kg/剂，而第2-13周的维持剂量表达为mg/kg/周。

表181

食蟹猴中的给药组

在研究的临时、终点和恢复期获取动物的肝样品以进行apo(a)mRNA分析。另外，在不同的天数收集血浆样品以测量apo(a)蛋白水平。根据美国食品药品管理局(FDA)良好实验室规范(GLP)法规21CFR第58部分进行这个非临床研究。

RNA分析

在第30、93和182天从猴子收集肝样品并且冷冻。简而言之，将一片(0.2g)冷冻肝在2mL的RLT溶液(Qiagen)中匀化。将所得裂解液施加到Qiagen RNeasy迷你柱上。纯化和量化后，对组织进行RT-PCR分析。使用采用实时荧光RT-PCR检测法的Perkin-Elmer ABIPrism 7700序列检测系统来量化apo(a)mRNA。测定是基于在相反两端用荧光报道分子和猝灭剂染料标记的靶特异性探针。探针通过Taq DNA聚合酶的5’-核酸外切酶活性水解，从而导致在反应期间可检测到的报道分子染料的增加的荧光发射。使用靶向恒河猴apo(a)mRNA转录物GENBANK登录号XM_001098061.2(SEQ ID NO：132)序列的位置1512的探针组(ABIRhesus LPA探针组ID Rh02789275_m1，Applied Biosystems，Carlsbad CA)来测量食蟹猴肝apo(a)mRNA表达水平。使用

如下表中所示，用ISIS 494372处理导致与PBS对照组相比，apo(a)mRNA的剂量依赖性减少。在第30天，在12mg/kg/周和40mg/kg/周给药组中，肝apo(a)mRNA表达分别以剂量依赖性方式减少74％和99％。单因素方差分析(one-way ANOVA)(Dunnett's多重比较检验，P＜0.05)显示，这些降低是统计学显著的。

还在恢复期期间测量了Apo(a)mRNA水平。在12mg/kg/周和40mg/kg/周给药组中，在最后一次剂量后第88天，肝表达水平仍分别降低49％和69％。

表182

在用ISIS 494372处理的食蟹猴中的给药期内肝apo(a)mRNA的抑制

水平百分比

蛋白质分析

使用可商购获得的apo(a)ELISA试剂盒(Mercodia 10-1106-01，Uppsala，Sweden)分析约20μl的血浆。按制造商说明执行测定方案。结果在下表中呈现为从第1天给药前apo(a)血浆蛋白浓度变化的百分比。使用Dunnett's多重比较检验显示从第1天基线血浆apo(a)的统计显著差异用星号标出。

到第93天，在所有给药组中观察到血浆apo(a)蛋白的最大减少。在恢复期，4和13周(第121和182天)的恢复后，40mg/kg/周给药组中的apo(a)血浆蛋白水平分别为22％和93％。12mg/kg/周给药组中的恢复率与40mg/kg/周给药组中见到的恢复率相似。

表183

在用ISIS 494372治疗的食蟹猴中的给药期内作为第1天水平的百分比的Apo(a)血浆蛋白水平

表184

在用ISIS 494372治疗的食蟹猴中的恢复期内作为第1天水平的百分比的Apo(a)血浆蛋白水平

实施例125：靶向人Apo(a)的ISIS反义寡核苷酸的粘度的测量

测量从上述研究中选择的反义寡核苷酸的粘度，以便将粘度大于40厘泊(cP)的反义寡核苷酸筛出。粘度大于40cP的寡核苷酸将具有不是最佳的粘度。

将ISIS寡核苷酸(32-35mg)称取到玻璃小瓶中，添加120μL水并且通过在50℃加热小瓶来使反义寡核苷酸溶解到溶液中。将一部分(75μL)预加热样品用吸液管吸入到测微粘度仪(Cambridge)中。将测微粘度仪的温度设定为25℃并且测量样品的粘度。将另一部分(20μL)预加热样品用吸液管吸入到10mL水中，以便在85℃下以260nM进行UV读取(Cary UVinstrument)。结果呈现在下表中并且表明大多数反义寡核苷酸在上述标准条件下在粘度上是最佳的。非最佳的那些标出“粘稠的”。确切地说，ISIS 494372在上述标准条件下在其粘度上是最佳的。

表185

靶向人Apo(a)的ISIS反义寡核苷酸的粘度和浓度

实施方案：

1.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO：1的核碱基3901至3920的等长度部分互补的至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQID NO：1至少80％互补。

2.如实施方案1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含含有与SEQ ID NO：1的等长度部分互补的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的部分的核碱基序列。

3.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含含有与SEQ ID NO：1的核碱基3900至3923的等长度部分互补的至少8、至少10、至少12、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的部分的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO：1至少80％互补。

4.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO：1至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。

5.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：58的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。

6.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO：12-130、133、134的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或20个连续核碱基的核碱基序列。

7.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸为单链的。

8.如实施方案1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸为双链的。

9.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。

10.如实施方案9所述的化合物，其中所述修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

11.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷间键联。

12.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少2个磷酸二酯核苷间键联。

13.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少3个磷酸二酯核苷间键联。

14.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少4个磷酸二酯核苷间键联。

15.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个磷酸二酯核苷间键联。

16.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少6个磷酸二酯核苷间键联。

17.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少7个磷酸二酯核苷间键联。

18.如实施方案11至17中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。

19.如实施方案1至8中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

20.一种化合物，其由ISIS 494372和缀合物基团组成。

21.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的糖。

22.如实施方案21所述的化合物，其中至少一个修饰的糖为双环糖。

23.如实施方案21所述的化合物，其中至少一个修饰的糖包含2'-O-甲氧基乙基、受限的乙基、3’-氟-HNA或4’-(CH

24.如任一前述实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。

25.如实施方案24所述的化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。

26.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且包含：

由连接脱氧核苷组成的缺口区段；

由连接核苷组成的5’翼区段；

由连接核苷组成的3’翼区段；

其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。

27.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由15至30、18至24、19至22、13至25、14至25、15至25、16或20个连接核苷组成。

28.一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有包含与SEQ ID NO：58的等长度部分互补的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰寡核苷酸包含：

由十个连接脱氧核苷组成的缺口区段；

由五个连接核苷组成的5’翼区段；

由五个连接核苷组成的3’翼区段；

其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联并且其中每个胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。

29.如实施方案1至28中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的5’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。

30.如实施方案1至28中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的3’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。

31.如实施方案1-30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好一个配体。

32.如实施方案1-30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好两个配体。

33.如实施方案1-30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含三个或更多个配体。

34.如实施方案1-30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好三个配体。

35.如实施方案31-34中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4，6-二脱氧-4-甲酰胺基-2，3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2，3，4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3，4，6，7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1，5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2，5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。

36.如实施方案35所述的化合物，其中每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。

37.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

38.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

39.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

40.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

41.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

42.如实施方案30至36中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。

43.如实施方案1至42中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的结构：

其中n为1至12；并且

其中m为1至12。

44.如实施方案30至36中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：

其中L为磷连接基团或中性连接基团；

Z

Z

R

每个m

45.如实施方案44所述的化合物，其中缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：

其中Z

每个m

46.如实施方案30至36中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：

其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

47.如实施方案1至46中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团共价连接至所述修饰寡核苷酸。

48.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

49.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中：

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分

C为缀合物接头

D为支链基团

每个E为系链；

每个F为配体；

每个n独立地为0或1；并且

q为1与5之间的整数。

50.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

51.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

52.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

C为缀合物接头；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

53.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

54.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

B为可裂解部分；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

55.如实施方案1至47中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：

其中

A为所述修饰寡核苷酸；

D为支链基团；

每个E为系链；

每个F为配体；并且

q为1与5之间的整数。

56.如实施方案48至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且

每个n独立地为1至20。

57.如实施方案48至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

58.如实施方案48至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：

59.如实施方案48至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

60.如实施方案48至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

61.如实施方案48至55中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

62.如实施方案48至61中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含吡咯烷。

63.如实施方案48至61中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含吡咯烷。

64.如实施方案48至63中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含PEG。

65.如实施方案48至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含酰胺。

66.如实施方案48至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含至少两个酰胺。

67.如实施方案48至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含酰胺。

68.如实施方案48至67中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含聚酰胺。

69.如实施方案48至68中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含胺。

70.如实施方案48至69中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含一个或多个二硫键。

71.如实施方案48至70中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含蛋白质结合部分。

72.如实施方案71所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分包含脂质。

73.如实施方案71所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂草配基、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。

74.如实施方案71所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。

75.如实施方案48至74中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。

76.如实施方案48至75中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为1至20。

77.如实施方案48至75中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

78.如实施方案48至75中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

其中n为1至20。

79.如实施方案48至75中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

80.如实施方案48至75中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：

其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。

81.如实施方案48至75中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：

82.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：

其中每个A

每个n独立地为1至20。

83.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：

其中每个A

每个n独立地为1至20。

84.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

85.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

86.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

87.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

88.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含醚。

89.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

每个n独立地为1至20；并且

m为2至6。

90.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

91.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：

92.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：

其中每个j为1至3的整数；并且

其中每个n为1至20的整数。

93.如实施方案48至81中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：

94.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：

其中L选自磷连接基团和中性连接基团；

Z

Z

R

每个m

95.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：

其中Z

每个m

96.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：

其中n为1至12，并且

其中m为1至12。

97.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含乙二醇。

98如实施方案48至93或95中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含酰胺。

99.如实施方案48至93或95中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含聚酰胺。

100.如实施方案48至93或95中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含胺。

101.如实施方案48至93或95中任一项所述的化合物，其中至少两个系链彼此不同。

102.如实施方案48至93或95中任一项所述的化合物，其中所有系链彼此相同。

103.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：

其中每个n独立地为1至20；并且

每个p为1至约6。

104.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：

105.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20。

106.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：

107.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：

108.如实施方案48至93中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：

109.如实施方案47至108中任一项所述的化合物，其中所述配体为半乳糖。

110.如实施方案47至108中任一项所述的化合物，其中所述配体为甘露糖-6-磷酸。

111.如实施方案47至108中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：

其中每个R

112.如实施方案47至108中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：

113.如实施方案47至108中任一项所述的化合物，其中每个配体具有以下结构：

114.如实施方案47至108中任一项所述的缀合反义化合物，其中每个配体具有以下结构：

115.如实施方案1至30或56至81中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含细胞靶向部分。

116.如实施方案116所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：

其中每个n独立地为1至20。

117.如实施方案116中任一项所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

118.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20。

119.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：

120.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

121.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

122.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

123.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

124.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

125.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

126.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

127.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

128.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

129.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

130.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

131.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

132.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

133.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

134.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

135.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

136.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

137.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

138.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

139.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

140.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

141.如实施方案116所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：

其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C

142.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C

143.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C

144.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

145.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

146.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

147.如实施方案117所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

148.如实施方案1至147中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺或酯。

149.如实施方案1至147中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。

150.如实施方案1至147中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中所述缀合物基团包含处于所述缀合物基团与所述寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。

151.如实施方案1至150中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酰胺可裂解部分。

152.如实施方案1至150中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酯可裂解部分。

153.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

154.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

155.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

156.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中每个n独立地为1至20；

Q

A为所述修饰寡核苷酸；

Z为H或连接的固体载体；并且

Bx为杂环碱基部分。

157.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

158.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

159.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

160.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

161.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

162.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

163.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

164.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

165.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

166.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

167.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

168.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

169.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

170.如实施方案1至30中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：

其中Q

A为所述修饰寡核苷酸；并且

Bx为杂环碱基部分。

171.如实施方案153至170中任一项所述的化合物，其中B

172.如实施方案153至170中任一项所述的化合物，其中B

173.如实施方案153至170中任一项所述的化合物，其中B

174.如实施方案153至170中任一项所述的化合物，其中Q

175.如实施方案153至170中任一项所述的化合物，其中Q

176.一种化合物，其具有下式：

其中x为包含GalNAc的缀合物基团。

177.一种化合物，其具有下式：

178.一种化合物，其具有下式：

179.一种化合物，其具有下式：

其中R

并且对于同一环上的每一对R

并且R

并且Z选自S

180.一种组合物，其包含根据实施方案1-179中任一项所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。

181.一种前药，其包含如实施方案1至180中任一项所述的化合物。

182.一种方法，其包括向动物施用如实施方案1-181中任一项所述的化合物或组合物。

183.如实施方案181所述的方法，其中所述动物为人。

184.如实施方案181所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善心血管、代谢和/或炎性疾病或减慢其进展。

185.如实施方案182所述的方法，其包括共同施用所述化合物或组合物与第二药剂。

186.如实施方案185所述的方法，其中所述化合物或组合物与所述第二药剂是伴随施用的。

187.如实施方案176所述的方法，其中所述施用是肠胃外的。

188.如实施方案176所述的方法，其中所述施用是皮下的。

189.一种降低动物中的apo(a)mRNA或蛋白质表达的方法，其包括对所述动物施用如实施方案1-181中任一项所述的化合物或组合物，以降低所述动物中的apo(a)mRNA或蛋白质表达。

190.一种降低动物中的Lp(a)水平的方法，其包括对所述动物施用如实施方案1-181中任一项所述的化合物或组合物，以降低所述动物中的apo(a)mRNA或蛋白质表达。

191.一种用于疗法中的组合物，其包含根据任一前述实施方案所述的化合物。

192.如实施方案191所述的化合物，其用于治疗、预防与升高的apo(a)和/或升高的Lp(a)相关的疾病或减慢其进展。

193.如实施方案191所述的化合物，其中所述疾病为炎性、心血管或代谢疾病、病症或病状。

序列表

<110> IONIS制药公司

<120> 用于调节载脂蛋白(a)表达的组合物和方法

<130> BIOL0250WO

<150> 61/818,442

<151> 2013-05-01

<150> 61/823,826

<151> 2013-05-15

<150> 61/843,887

<151> 2013-07-08

<150> 61/871,673

<151> 2013-08-29

<150> 61/880,790

<151> 2013-09-20

<150> 61/976,991

<151> 2014-04-08

<150> 61/986,867

<151> 2014-04-30

<160> 167

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 6489

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

aggtaccttt ggggctggct ttctcaagga agcccagctc cctgtgattg agaatgaagt 60

gtgcaatcgc tatgactggg attgggacac actttctggg cactgctggc cagtcccaaa 120

atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagc agcacctgag 180

caaagccatg tggtccagga ttgctaccat ggtgatggac agagttatcg aggcacgtac 240

tccaccactg tcacaggaag gacctgccaa gcttggtcat ctatgacacc acatcaacat 300

aataggacca cagaaaacta cccaaatgct ggcttgatca tgaactactg caggaatcca 360

gatgctgtgg cagctcctta ttgttatacg agggatcccg gtgtcaggtg ggagtactgc 420

aacctgacgc aatgctcaga cgcagaaggg actgccgtcg cgcctccgac tgttaccccg 480

gttccaagcc tagaggctcc ttccgaacaa gcaccgactg agcaaaggcc tggggtgcag 540

gagtgctacc atggtaatgg acagagttat cgaggcacat actccaccac tgtcacagga 600

agaacctgcc aagcttggtc atctatgaca ccacactcgc atagtcggac cccagaatac 660

tacccaaatg ctggcttgat catgaactac tgcaggaatc cagatgctgt ggcagctcct 720

tattgttata cgagggatcc cggtgtcagg tgggagtact gcaacctgac gcaatgctca 780

gacgcagaag ggactgccgt cgcgcctccg actgttaccc cggttccaag cctagaggct 840

ccttccgaac aagcaccgac tgagcaaagg cctggggtgc aggagtgcta ccatggtaat 900

ggacagagtt atcgaggcac atactccacc actgtcacag gaagaacctg ccaagcttgg 960

tcatctatga caccacactc gcatagtcgg accccagaat actacccaaa tgctggcttg 1020

atcatgaact actgcaggaa tccagatgct gtggcagctc cttattgtta tacgagggat 1080

cccggtgtca ggtgggagta ctgcaacctg acgcaatgct cagacgcaga agggactgcc 1140

gtcgcgcctc cgactgttac cccggttcca agcctagagg ctccttccga acaagcaccg 1200

actgagcaga ggcctggggt gcaggagtgc taccacggta atggacagag ttatcgaggc 1260

acatactcca ccactgtcac tggaagaacc tgccaagctt ggtcatctat gacaccacac 1320

tcgcatagtc ggaccccaga atactaccca aatgctggct tgatcatgaa ctactgcagg 1380

aatccagatg ctgtggcagc tccttattgt tatacgaggg atcccggtgt caggtgggag 1440

tactgcaacc tgacgcaatg ctcagacgca gaagggactg ccgtcgcgcc tccgactgtt 1500

accccggttc caagcctaga ggctccttcc gaacaagcac cgactgagca aaggcctggg 1560

gtgcaggagt gctaccatgg taatggacag agttatcgag gcacatactc caccactgtc 1620

acaggaagaa cctgccaagc ttggtcatct atgacaccac actcgcatag tcggacccca 1680

gaatactacc caaatgctgg cttgatcatg aactactgca ggaatccaga tgctgtggca 1740

gctccttatt gttatacgag ggatcccggt gtcaggtggg agtactgcaa cctgacgcaa 1800

tgctcagacg cagaagggac tgccgtcgcg cctccgactg ttaccccggt tccaagccta 1860

gaggctcctt ccgaacaagc accgactgag caaaggcctg gggtgcagga gtgctaccat 1920

ggtaatggac agagttatcg aggcacatac tccaccactg tcacaggaag aacctgccaa 1980

gcttggtcat ctatgacacc acactcgcat agtcggaccc cagaatacta cccaaatgct 2040

ggcttgatca tgaactactg caggaatcca gatgctgtgg cagctcctta ttgttatacg 2100

agggatcccg gtgtcaggtg ggagtactgc aacctgacgc aatgctcaga cgcagaaggg 2160

actgccgtcg cgcctccgac tgttaccccg gttccaagcc tagaggctcc ttccgaacaa 2220

gcaccgactg agcaaaggcc tggggtgcag gagtgctacc atggtaatgg acagagttat 2280

cgaggcacat actccaccac tgtcacagga agaacctgcc aagcttggtc atctatgaca 2340

ccacactcgc atagtcggac cccagaatac tacccaaatg ctggcttgat catgaactac 2400

tgcaggaatc cagatgctgt ggcagctcct tattgttata cgagggatcc cggtgtcagg 2460

tgggagtact gcaacctgac gcaatgctca gacgcagaag ggactgccgt cgcgcctccg 2520

actgttaccc cggttccaag cctagaggct ccttccgaac aagcaccgac tgagcagagg 2580

cctggggtgc aggagtgcta ccacggtaat ggacagagtt atcgaggcac atactccacc 2640

actgtcactg gaagaacctg ccaagcttgg tcatctatga caccacactc gcatagtcgg 2700

accccagaat actacccaaa tgctggcttg atcatgaact actgcaggaa tccagatcct 2760

gtggcagccc cttattgtta tacgagggat cccagtgtca ggtgggagta ctgcaacctg 2820

acacaatgct cagacgcaga agggactgcc gtcgcgcctc caactattac cccgattcca 2880

agcctagagg ctccttctga acaagcacca actgagcaaa ggcctggggt gcaggagtgc 2940

taccacggaa atggacagag ttatcaaggc acatacttca ttactgtcac aggaagaacc 3000

tgccaagctt ggtcatctat gacaccacac tcgcatagtc ggaccccagc atactaccca 3060

aatgctggct tgatcaagaa ctactgccga aatccagatc ctgtggcagc cccttggtgt 3120

tatacaacag atcccagtgt caggtgggag tactgcaacc tgacacgatg ctcagatgca 3180

gaatggactg ccttcgtccc tccgaatgtt attctggctc caagcctaga ggcttttttt 3240

gaacaagcac tgactgagga aacccccggg gtacaggact gctactacca ttatggacag 3300

agttaccgag gcacatactc caccactgtc acaggaagaa cttgccaagc ttggtcatct 3360

atgacaccac accagcatag tcggacccca gaaaactacc caaatgctgg cctgaccagg 3420

aactactgca ggaatccaga tgctgagatt cgcccttggt gttacaccat ggatcccagt 3480

gtcaggtggg agtactgcaa cctgacacaa tgcctggtga cagaatcaag tgtccttgca 3540

actctcacgg tggtcccaga tccaagcaca gaggcttctt ctgaagaagc accaacggag 3600

caaagccccg gggtccagga ttgctaccat ggtgatggac agagttatcg aggctcattc 3660

tctaccactg tcacaggaag gacatgtcag tcttggtcct ctatgacacc acactggcat 3720

cagaggacaa cagaatatta tccaaatggt ggcctgacca ggaactactg caggaatcca 3780

gatgctgaga ttagtccttg gtgttatacc atggatccca atgtcagatg ggagtactgc 3840

aacctgacac aatgtccagt gacagaatca agtgtccttg cgacgtccac ggctgtttct 3900

gaacaagcac caacggagca aagccccaca gtccaggact gctaccatgg tgatggacag 3960

agttatcgag gctcattctc caccactgtt acaggaagga catgtcagtc ttggtcctct 4020

atgacaccac actggcatca gagaaccaca gaatactacc caaatggtgg cctgaccagg 4080

aactactgca ggaatccaga tgctgagatt cgcccttggt gttataccat ggatcccagt 4140

gtcagatggg agtactgcaa cctgacgcaa tgtccagtga tggaatcaac tctcctcaca 4200

actcccacgg tggtcccagt tccaagcaca gagcttcctt ctgaagaagc accaactgaa 4260

aacagcactg gggtccagga ctgctaccga ggtgatggac agagttatcg aggcacactc 4320

tccaccacta tcacaggaag aacatgtcag tcttggtcgt ctatgacacc acattggcat 4380

cggaggatcc cattatacta tccaaatgct ggcctgacca ggaactactg caggaatcca 4440

gatgctgaga ttcgcccttg gtgttacacc atggatccca gtgtcaggtg ggagtactgc 4500

aacctgacac gatgtccagt gacagaatcg agtgtcctca caactcccac agtggccccg 4560

gttccaagca cagaggctcc ttctgaacaa gcaccacctg agaaaagccc tgtggtccag 4620

gattgctacc atggtgatgg acggagttat cgaggcatat cctccaccac tgtcacagga 4680

aggacctgtc aatcttggtc atctatgata ccacactggc atcagaggac cccagaaaac 4740

tacccaaatg ctggcctgac cgagaactac tgcaggaatc cagattctgg gaaacaaccc 4800

tggtgttaca caaccgatcc gtgtgtgagg tgggagtact gcaatctgac acaatgctca 4860

gaaacagaat caggtgtcct agagactccc actgttgttc cagttccaag catggaggct 4920

cattctgaag cagcaccaac tgagcaaacc cctgtggtcc ggcagtgcta ccatggtaat 4980

ggccagagtt atcgaggcac attctccacc actgtcacag gaaggacatg tcaatcttgg 5040

tcatccatga caccacaccg gcatcagagg accccagaaa actacccaaa tgatggcctg 5100

acaatgaact actgcaggaa tccagatgcc gatacaggcc cttggtgttt taccatggac 5160

cccagcatca ggtgggagta ctgcaacctg acgcgatgct cagacacaga agggactgtg 5220

gtcgctcctc cgactgtcat ccaggttcca agcctagggc ctccttctga acaagactgt 5280

atgtttggga atgggaaagg ataccggggc aagaaggcaa ccactgttac tgggacgcca 5340

tgccaggaat gggctgccca ggagccccat agacacagca cgttcattcc agggacaaat 5400

aaatgggcag gtctggaaaa aaattactgc cgtaaccctg atggtgacat caatggtccc 5460

tggtgctaca caatgaatcc aagaaaactt tttgactact gtgatatccc tctctgtgca 5520

tcctcttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagcatt 5580

gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct cagaacaagg 5640

tttggaaagc acttctgtgg aggcacctta atatccccag agtgggtgct gactgctgct 5700

cactgcttga agaagtcctc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 5760

gaagtgaacc tcgaatctca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 5820

acacaagcag atattgcctt gctaaagcta agcaggcctg ccgtcatcac tgacaaagta 5880

atgccagctt gtctgccatc cccagactac atggtcaccg ccaggactga atgttacatc 5940

actggctggg gagaaaccca aggtaccttt gggactggcc ttctcaagga agcccagctc 6000

cttgttattg agaatgaagt gtgcaatcac tataagtata tttgtgctga gcatttggcc 6060

agaggcactg acagttgcca gggtgacagt ggagggcctc tggtttgctt cgagaaggac 6120

aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct 6180

ggtgtctatg ctcgtgtttc aaggtttgtt acttggattg agggaatgat gagaaataat 6240

taattggacg ggagacagag tgaagcatca acctacttag aagctgaaac gtgggtaagg 6300

atttagcatg ctggaaataa tagacagcaa tcaaacgaag acactgttcc cagctaccag 6360

ctatgccaaa ccttggcatt tttggtattt ttgtgtataa gcttttaagg tctgactgac 6420

aaattctgta ttaaggtgtc atagctatga catttgttaa aaataaactc tgcacttatt 6480

ttgatttga 6489

<210> 2

<211> 150001

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atctttcagc ctctatatta ttttattgtg atttttaatt tccttgaatt ggattttgcc 60

attgtgctaa atcttgatga tcttcatttg tatccgtagt ctgaattata tttctgtcat 120

ttgagttagc tcagtcttgt taagaaccct tgttggaaaa ctggtgcagt tgtttggagg 180

acatatgacc ttctggccat ttgatttatt ggagttctta cgttggttct ttctcatgtc 240

tctgtgtggg tgtttcttta actgcagtgt agattgagta cagccaatag acttcttctt 300

tggaggtttt cacagggcca aggccttgta cagggtcttt atttgtagct gacttcttgt 360

ctttggtttc atagtggggc atgttagcaa aatagttttg ctgttgaagt tttggggtgt 420

gatccatttt ttattttaat gattgtgtat ttcctttata cctaaaacaa gcagaaaacc 480

agtaaaggtc tttgagtctc tgaattcata actccagcat tcatattgct tcctcaggta 540

agtggggttt tcacccagcc cttaagggtg ttagattatt ttttatgtga aattagccag 600

attgtatttc taaacatgat gtaaaacaat aatgacaaaa gttataataa actagccttc 660

ttaccaaatc cacatgtcta atgtgtgtgg gagggtgtta ggcaggggac ctgcagctaa 720

gggagaggca gacaggcccc atggccccaa atctaggata gtatttggta ttggttgatg 780

ggtgagagaa agagagggaa catctgtgca ggatgtggta tcagcacctg gactacatct 840

tagggattcc ttcttcattt ttcagtatgc cctgacaata attatatcta tcagacttac 900

ccccttgacc actggaacac taagactgtt ttgggatctc tgcctgactt tctcagaggt 960

gctggtgagg acattatgag tctggaacct agaaaagcgt tctgactctg ctgactttct 1020

cagaggtgct ggtgaggaca ttatgagtct ggagccctag aaaagcgttc tgactctgcc 1080

actagccaga cagacctgga ctaggcacgt taactctttg tatgacttga ctccaacccc 1140

tcatttgtaa aaccagcatt ttcaagtggt gttttccaca tcagcctttt gcataagctg 1200

tcatttgaag aaaggttttt gtttgtttgt tttttgttta acaaaaaggt taaaaaccac 1260

tggtctagat aattgcaaag tttgctttcc tttttctgtg ctttttctac tatttttaaa 1320

atgtcatcct ccttggtttc ttgatccccc tttctgcact cctgagtctg ggaacactga 1380

ggccaactaa aaggaaactt ggcaaaagag gaacaccttt gggtgtgcca ggctgctccc 1440

agtgttttgc acttataaaa atttaaatgc tgcaaacctc taagacttag atattattgt 1500

tcctatttta caagtgagga acctgaggct cagagaaggt gcaggatggc acagggagac 1560

ctgaattgga accctggttc ccacttactg gctgtcggga cttagaaaag tcatgaactc 1620

tcattgattg ttttcttata tgaaatgggg gctgcagggt tgtcggggga gaaacaataa 1680

gaatgtgcat caagtgtcga gcacgtgcta cgcactccat catggcagct cctactaata 1740

tacagaatag agttgtatct aacatgactc tttcttgcaa gtgacagaaa atccaactta 1800

agatggatta agcaaaaaag gggaattctt gttgagctga aaagtcttta ggctcacatg 1860

atggccccag ggcccaggcc ctgtccagcc atgcagtagg catcatcctt gggcacaaag 1920

gtgagattct tgtggtggca gatgctgtgg cagctcttgc tttgccagga aagactgagg 1980

aaggccactg tccccattaa gtgaacaata gttggccagg tctgagaggt tgaacttggg 2040

tcacaggcct gtccctgaac ccatcactga ttggctccaa cctgcatcag ctattacatg 2100

ctagaggtgg aggcaggacc ccactcatac ccagaagggc aaagggtgga tccctcaaca 2160

ggattatggg atgtagggtg atagactgct gggcagccag aaagcaaaca gatcctctcc 2220

aatacctcaa ctgatgaaag caccaagcta aaatcataag gatctgggtg tgaattctgg 2280

ctctaccatc ttccatgtga cattgggcag ttatttaatc tcttttagcc ttggctttct 2340

tacctgtact aacatataag gtgattgtga tgagcatcat catcgtcaac atcatcatca 2400

ccatccacat tgccaccacc actcccatta tcatcttcat caacatcatc accaccgcca 2460

ccatcaccat tatcattacc accaccgcta tcactattat catcaccctc aacatcatca 2520

ccatcatcac tatcatcacc accaccatca tcgttactac cactaccacc accatcatca 2580

ccacagccac caccaccatc accatcatta ctactcagca ccaccatcat cattccacca 2640

ccatcaccat cattccacca tcaccattat cattaccacc accactgtca ctattatcat 2700

caccctcaac atcatcacca ccaccatcat cattactacc accaccacca ccatcaccat 2760

catcatcatt ctaccaccat caccattatc atcaccatca ccatcaccac cgctatcatc 2820

atgataatca ttatcattac caccaccatt agcattatca ttaccaccac catcactatc 2880

actatcacca tcaccacgac cactaccacc atcaccaaca ccatcattac tacccaccac 2940

caccatcatc atcattccac caccatcaca attattacca ccaccaccat caccaccacc 3000

accaccatca ctatcatcat cagtagacat catataacca gtttgtagct ggcccagagc 3060

ctacttgctg tttcttctgc cccacaacca tccacacatt tctaaccacc atcccccact 3120

aggcttctgc ctcgcctggt ctcacctgca ggtccactga gaaaatgatt ctcagaacac 3180

taactagacc atgaggtgcc acaaaacata actcaggcct gttcatcaat tttctacatg 3240

tcaataatga catcaggtca attggcgttc tcagcctctg agagggaggt caaagttttc 3300

ctgctctccc cttcatgttt ccaggtgttc cctgacttgg atcaaatgca gagtttggag 3360

gtgttgaggc caaggggatt ttccaggtca gtcgtcatcc acaatcaatg gactgatcct 3420

gccgctggac ttaccctgct gccctctccc caaggcccca tcagggaggg cttcaatcct 3480

cttgtcacct gtggcctacc tgccctcaga gatgacatct ctatgtcggc cactggatgg 3540

cagcacctac tcgcagacca catcaacttt cctggcaact tgcggtaggt tttcaccatt 3600

atcaggatgt ttgccttgct caaatagcag attctagaga acggtgctcc ctcacacaac 3660

tatgtagtcc aggtgatgca ccctctgccc gatgcttggt agtcagaaac ttccatcatg 3720

cagctctgcc cagattgagc tgagctggcc tctggagtga ggtgctggga caaacatctt 3780

ccatgctgct catgtcaact ccagatgcag tcaggtttct gaaccaaagt caatgatcta 3840

agtgcagtca aaggctctgg gggaagaaag agagagtgcc tcatctcttg cctgtgccat 3900

gctcgcaaag caaggatttt tgcaaaattc taatgaaagc tgggcttgca aaattagaaa 3960

actggattat ttgtgagaac actgaaacat ccctgggtgt gtccatctgg aaaaacagca 4020

tttcctctgg caattttgca accgttctat ttgaatttgg caaagaaaat aaagcagttt 4080

ttcacaaaag aataaacaca accaggagaa tcttcactct cccaaattgt caaagaagta 4140

taaattagaa aatgaatcag gacaatttca acctgttaga ttagctaata tttaaaaatt 4200

gaacactcat acaagtgtgg tgaagtgatt gttttctagt gacattttac actgtcataa 4260

ccttctagaa aataaattgg cagtgttatt gggagacaga aatatgtcta tataatttat 4320

gggaacttag gctcagaaaa tattaaggaa taagaatgaa ctttatgaac aaagatgtgg 4380

agggttggaa gcaagagggg ggccaacgcg cacggggagg aagcatttgg gcagtgactc 4440

cgcagaccca ggctcaggtt gaactagaca acctccttac acctcagttt ccttaactgt 4500

agagcaggag tgatggaact gcctgtttca taggactgtt gtgaggatga agtgagatac 4560

accacattat aagcttgtgc ctggaaagga taatgcttag taaatgatga ctattctttt 4620

ttattgcaat aaaatgtaca cagcgtaaga gttactattt taaccatttt tgcagggtac 4680

caccaagtgg catttagtac attcacagtg gtgtgcaacc atcatcatat ttccagaata 4740

ttttcctcat ccccaaagga aacctcatgc tcattaatca gtagctctcc tttaaaatat 4800

tagttatgaa gatcatagca ctatacaaaa ctcattatgt aatgttgagt gaaaaaatca 4860

gggtgtgaaa ttttgtgata tgatgtaatt agtgaaagaa gcatacaaaa agtctgaaaa 4920

tataaaaaca atagcaattg catttctcag actctacatt taaacattat tctttatggt 4980

tttaaaagca aagaaaaagg taaagaaaca acaaccaacc gcaaagcacc atgacaaagc 5040

tcagattgtt aaatccaggt ttttggaaca tagactctta tatgacgttt acactctcca 5100

gggttcagag agtctggcag cattgggagc tgccttgtgt tctacagcct cacggacaga 5160

caggaggtcc atcaccactg ctctgttctt ctggagtttc cttgtgaaca tgttgtggac 5220

gtagttacca tttctttcat ctttttaaac acaggtacct ttggggctgg ctttctcaag 5280

gaagcccagc tccctgtgat tgagaatgaa gtgtgcaatc gctatgagtt tctgaatgga 5340

agagtcaaat ccactgagct ctgtgctggg catttggctg gaggcattga cagttgcaag 5400

gtaagaaaag atcaagagac caaagttagt cttgtgctct cctgtctcag tctcagtccc 5460

ttagacttga gtcccaaagt agcgaattca agtaggattt aatcaatgga agaccccagt 5520

ctaagtgttg ctcagaaact ccctagatct gtcccaaatg tatattcaga tcatccaagg 5580

ggacttcttg gggcttgagt tccagatcag cagcaaggga gccataagtg ccataactac 5640

ctcagaccac tcaccctcct ggggtgtccc ggtggccagg gactaaagtg gtgatttttc 5700

tggtagggaa ggaggtagag ggtacaggac agagactaac tgcacacaat atctgagact 5760

ggagctcaga tattgctgat gatcagagtt ggcgtgtctc cccaattgat ttacaactgg 5820

ggcttggata ctgttttaaa cgggaggagc ctcctaacca tcttgacaca accactgacg 5880

tgactacact agagatagac tctttccact taattctacc actcttgctt tacttcatga 5940

gaacgaaaat gtaagattgc accatgaatt catttgcgga aagattgata ctatgctttt 6000

attttatttt attttatttt attttatttt attttatttt attgagactc tcaccccggt 6060

tgaagtgcac tgacgtgatt ttggctcact gcaacttcca cctcctgggt tcaagtgaat 6120

actccagcct ccctagtagc tgggattaca ggtgcccacc accacgcctg gctaattttt 6180

gtatttttag tagagatggg gtttcaccac attggcctgg ctggtctcaa actcctgacc 6240

ttgtgatcca cctgtcttgg cctcccaaag tgctgggatt acagagttga gccaccgcac 6300

tcgaccctat gttttatttt taaaaatatt tatttattta tttaagccac aactactaga 6360

ataggaagga ttgatatttt attaatttta tttggtattt attatttttt tttctttcct 6420

gagacattct tgctctgtca cccaggctgg agtgcagtgg cacattcttg gctcactgca 6480

acctccatct cctgtgttca agcaattcta gtgcctcagc ctacttagta gctgggatga 6540

ctggcatgtg cctccacacc cagctaattt ttgtattttt tgtagagaca gggttttggc 6600

atgttgccca ggcttgtctc aaactcctgg cctcaggtga tccatctgcc gtggcctccc 6660

aaaatgctgg gattataggc atgagccacc accccctcct ggaaggattg atatcttata 6720

acataattta taattacaga aaacatgtga gttcactagg aataaataaa ttttgaagat 6780

aataaaagat tttcacttat gttgtcattt cggcacagtt tggtatagga tgtggagatg 6840

ttaacattta tacctagctt gctcgtaaac taagacctga aagggttgtg tctatcagct 6900

gcacccctgg gtagcgacac aacctcggga aggcctcagc cccctcctcg tacagcactg 6960

cctgttggaa agcttgaggg aggctatgga tgtgcagcac ttggcagagg gtctggtcat 7020

ggaagttacc agcaaatatg agctactttt atgattttat tttatccaaa agaaagagaa 7080

tgaaagaaga ggggaggaaa caagactaat caggaaagat gaaggtctag gggtgaggga 7140

aggagtaagg agacataaag gcaatgtgga gcagctgagg ggggaaatgg ctttcaccac 7200

ttcccagcat ctattgacat tgcactctca aatattttat aagactctat attcaaggta 7260

atgtttgaac cctgctgagc cagtggcatg ggtctctgag agaatcatta acttaatttg 7320

actatctggt ttgtgggtgc gtttactctc atgtaagtca acaatgtcct gggattggga 7380

cacactttct gggcactgct ggccagtccc aaaatggaac ataaggaagt ggttcttcta 7440

cttcttttat ttctgaaatc aggtaagaca tagttttttt aaattataag aattattttt 7500

tctcccacaa tgtagtaaaa atacatatgc catggcttta tgtgcaattc atttaatttt 7560

tgattcatga aattcccagt tcaaaatctt gtatatgatt gaaaaattct taaaaaaata 7620

agtttaattt ccccgtgaag actgtcacgg tgctggaatg aatgggcaga aaaaataatg 7680

gttgattttt ctaatctaaa agagtgtgcc tacatgatgg ccagtctggc tgaaaaataa 7740

atagccattg tagctaacta tgcaaaggat ggctaagctc ttcgcttggt tctcagtttc 7800

attaatttat atcatctctg ttcaggtgcc atgctcccct cactagcaag ttgaaacaat 7860

gaaataactc tttgaatatg tttggttcct tgacctgttc atggagtggg actcagcatt 7920

tctctctttg ttatggcctg agtaaggctt tccatcggta tacatttgct tcttatccct 7980

ggagaaatta tacacatcca tttgccagat gatatacgca tataatgatt caacaaatac 8040

tcagggtatt tgttgagtgg gttaggtccc cacattttta tacatacata cacacataca 8100

caccgtgtgt gattgtgaat gtaagtgtgt gtcctttaca aatactagct tatttagctc 8160

atggtatagg tagggtagca tagtcatccc cattttataa acaaagaaat ctagacttag 8220

gaaaatcatg ttatttgtct cgtgaccaaa ttcccaaatc aaggaaataa agaaacctgg 8280

atttaagcca gatttccaag aaaaaatcta gggctcttct cactttttca tctttgttcc 8340

aacatttgaa aaaataaatc taaacacatt ccaatgtaac tgaagagcag gttaattgtt 8400

tgccacttgc agaatccaat taagaagaga gaagtctggt ataaagaaag tgatttgctt 8460

ccaaagctag cttaggggaa gaaatgcagc agtcctgccg tactacttca ctttaggagc 8520

agaaagtggc acttttaaaa ggcaacagag gaggcgagca aggattcagg ggtccatgct 8580

agcttgggca ccttatccac caggtagttg agcagttgcc tgctggtgcc tttgtgagca 8640

gggtgttgtc ccttgaggca aatctctgga gggtgagagt tttgtagtgg gcatgctttg 8700

gtttataaat cacctgtgaa ctcaggagtt ccatcttgaa gcacatacat agttagatga 8760

acttgccctg cagggagagt ctgatgaaag ggaggtagat gcttgcaatt taatctataa 8820

attaccagat aaaattttac aagttgactt taaagtcaaa cacatttgaa tttagtggaa 8880

gccattcaag aaaatatcaa agaaaataca gagcaggaga agattaagca aagagttttt 8940

tggggaaatt ggtgtctatg tctgtgtgtg tagggagtgc aggggatatg aatattctat 9000

ttcagcccat ggaaactagg atgtagatca ctgtgaactt attcagcagg ctacacccaa 9060

aggctagaac aaacttctct gccacaggat taacatatgt tttaatcgac ctggggggca 9120

cattctctga taagctcttt tggaaagcca ggctttctgt ggacgtgtta tctttccaat 9180

gtgtgctgga atgcccgggg agaggaaaaa gtttctttta cagccatgct cagtgagaag 9240

cggagaaaca tcttctattc acaaattgct aagtctttta cacatgcaaa tatgcataca 9300

cattcacaca ccacagtgag gaagaaattc tcacaccatt aataaaatac atttacttca 9360

gtagcaatat acatctacat tttgcctata atataaaagt atttttccta ttaaaagatt 9420

tgtttaatgt ttcttcacca acaaataaac cctattaaat ccccattgcc atatgagccc 9480

tggaggtgaa tcagagaaac aaaaggattg tggaaaaatc atcaggttaa aaaaagaaaa 9540

attgattctg ttttgggata tttcctagca acatgagctg gggaggggat ctcagcagtg 9600

atgctctatg aagcataata aaatgacaca gttacaggta acttagttaa agggggaaat 9660

aaatggaagt ttcctctttt tgaatatcaa ttgtagcctg ctctgctaca tttcaaaaac 9720

actcttcaaa atgtttaact gaactcactg taggaagcac cttattaatt tattgtgtgt 9780

tttgaagtca cactgtgagc tatagaattt acccaagcac aactcttcct ggaaaagaga 9840

gttcaaatga gaaacagtgc ggggtgaaga catggatatg ggcctaaaat atctatttct 9900

caatgatatt ttgatatatc tatcaagtgc tttttagtgg attaggttca gaatgcatca 9960

gccaatgcct gttcaataat ccagttttcc agcatagagc atattaaatt gaggaaggac 10020

aaagtcacag aggtggggag caggtggact gtggccaagg actttgcatg aaacagtgag 10080

cgtgcatcct cctccttgcc ctgccctcat ggtctgtgta ctctcaggag gtcaggacag 10140

gcctttctga gaatgagaat ctgttcatct gcctttctac tggatacttg tcatcggcat 10200

acaaacacat gttctctgca gtgtgtcatc tttcagaacc tcccctgacc ctgtattccc 10260

tagaagtctc gctgctttca gagccaggct tctctcctgc tgccaccccc actgctcttc 10320

tagtcactct ttaacccact ccatctgcat gtggccccca ccacacccct caaagtggtc 10380

aaggttgtcc tgttgcttaa ttccatggaa gcttggctat cttcatttta ttagcctctt 10440

ttggcctctc accctgtgaa aatcactaca ttttgtgcca gagatggagc tggcatctcc 10500

aggcttggaa gagggctgct gaagctcagc caggtgtcct aaggagcctc aggacagggg 10560

atgctcagta gccttgcaat gggaacacag ctgagcccca cttggccacc ctttgccaca 10620

accaggcaga aagcagcttt tgaacagatt tgttgcctca gatttgatct caaagaaaaa 10680

tcgtgggcag tattggtccc aggttctgct tttttacaat ttcctctgaa atctggatgc 10740

ctatcaacac cttggaaaaa ctgaattctc cccaactaat agtggtgtgt cactgtagta 10800

agcctagtac aaaaatggcc ttctttgtgg aggagcttca tatcctccat tttttttttg 10860

cttaattttt gcccaagatg agaacataat ttagttcact ttttatttat tcccaacatc 10920

atccatgcac caacattttt gtaactaaag gagggaccat tcagaagatg cttatcaact 10980

gtcaaagtga cagtgttaca accaatgcac atattgtaag aaatcaaaca atggcctcca 11040

aggttcattt ctacacaggg attagcagat caacatcaat cttggcaaca cagttgccac 11100

tgatggtgtc ttattttttt tatcatgaca tggcaatcaa gagcaaacat gatttattct 11160

tatttaagat tttatggtta gactaggcag atagctagat atgagcagga ggtggaagcc 11220

cctgagagaa tggaggtctg gagaatctga aaccccagag attacccaag tcctgcatgc 11280

tagacatgag tggaggaggg ggaataccta ggtagaaaag aatgcccctt aagatgccca 11340

gcagtcgctc actgtgcagt taacttttca gaatgctgct agatacatgc tgatagggag 11400

ggaagagggc aaaggagaaa ttcctaagag atacacggtt gcagttagta tacatctgag 11460

tgctatacaa ccttctttgg gtggtggcaa gaagcaatgc agccattacg tagaattcat 11520

atcaaacacc tgtatcacag gtgttaaaga aacaagaaac attgtacttc ttgtattctt 11580

aataatgatt tgcaatattg tctttagtat cactgcaaac ctctataaat atgattttta 11640

aaaagtattt ctttaggttg gaattacttc tacgcattga cttatcttcc tgggtttcat 11700

tagccgtacc cgttgtactt tcttccttac cactgtttat ctcaaactct tgagattaaa 11760

gtatgggctc aggagggagc gaggagcttc aggactctca cggacctcca gcacagtgta 11820

gctgccttat ggaaaagtgg ccacactgtt ttctgcactg gtccctgccc ctactattcc 11880

tcactgggca gagcacagcc accctggccc tgcctgaaca ttttagtcag tgttggctct 11940

gtgcttctct ggggaggaaa tccaagagac aacccacagc ccctctgcca tttcagctgc 12000

agcagtacca ccgttaatgc ccttgggctt gagaaagaag ggacctggcc acttccctga 12060

cacctccagc acacagcagg gaaagaattc cagtttctct ttcttgtgag ctttcacctg 12120

ctactcttca ccaggcaagg ctcctggctt gggcccacag tgcaggcacc tcgaactcag 12180

ttgaacattt ccactggctg cactctgtgt ttttgtgggg tgaagctccc agaggtgact 12240

gaaagtcctt ctgccactaa cactgcagtc atactgccct tgctgtactt ggactaggga 12300

aggaaaaaag atcctgagtg ctttactcac accccagtgt gccccagcca ccctatggaa 12360

aagaggccag tgtgtcatcc ctgcaagcac cctgaggccc ctgcccctgc tgcccccaag 12420

ctgtagagcc agaatataaa gctggcagaa aaatgtaaaa aggctagact ggcttagcct 12480

cccagcctac atctttctcc tgtgctggat ccttcctgct cttgaacatc ggactccaag 12540

ttcttcagct gtgggacttg gactgtcttc cttgctcctc agattgcagg tggcctatta 12600

tgggaccttg taatcttgtg agttaatacc acttaataag ctcccctttg tgtgagtata 12660

tctatatcta tagatagata taggtatact cactatatat acacatatat acatatactc 12720

tctctctctc tctctcatat atatatatat ataatctcct attagttctg tccctctaga 12780

gaaccccgac taatacagat tttcatacca gaagtggttc ttgaggaaca gaatattaag 12840

gatggaattc tttcattggt tttgggactt ctggtgttgg ctgattaata tgattagacc 12900

aaaaaatgct aaggactcta cttctaatag tatggagaac actgatagta cttggcctga 12960

attgtttaga gagttatgca aaataaatgc atttgacact actgattcat cacttatgag 13020

aggcaaggag tttagtgact ctatacataa tacctttgac tatatgtgga gaaccaagga 13080

acataatgaa gttggttgat tgctcctaag ttctctggag aaagagatga aagaaaatga 13140

tgatctcagg ggatctgtct cccaccttca gaagcagata ctgagccaca aatctgctaa 13200

gattgccctg aatgagagtt ttaactcctg tagagaaaga gttgaaattg tgaaaaaaca 13260

gagacaagct gttatcatgc gagtagctga tctgcaacaa gaggtgcatg cacagccttg 13320

ccaggtgttt actgttaaag tgagggcatt gactggaaaa aaatgggacc ctggaacttg 13380

gagtggggat gtgtgggaga accctgatga agctgaggac actgagtttg tgaactctga 13440

tgaaactttt ttgccagaag aaacagtttc cccatcccca gtagtggtaa catcccctcc 13500

ctgacccgtg ctgccattag cctttccacc tttgtctgag gatgtaaacc ctgcactgct 13560

tgaggcaaca gtgatggcct tccctgaggc agctgccagg caagataatg ttgattctcc 13620

tcaagaggca cccctaatgc ccctgaatgc ttctagacct ataactaggc taaattcctt 13680

gcgggcccca gaggtgaggt tcagagtgtg acccatgagg aggtgcatta tactctaaaa 13740

gaactgctta agctttctaa tttatattgg cagaaatctg gagaacaggc atgggaatgg 13800

atattaaggg taagggataa tggtggaagg gacatagagt tggatcaagc tgaatttatt 13860

ggtttggccc tactaagtag ggattctgca tttaatgttg cagctcgggg acttagaaaa 13920

ggttctgata gggccgggag cagtggctca cgcctgtaat cccagcacct tgggaggcgg 13980

gggcgggcag atcacgagat caggagattg agacaattct ggctaaaatg gtgaaacccc 14040

atctctgcta aaaatacaaa aattagctgg gcatggtgat gcgtaactgt aatctcatct 14100

acttgggagg ctgaggcaag agaactgctt gaacctgtga ggcagagatt gcagtgagcc 14160

aagatcgccc cactgcattc cagcctggta acagagcaag actccatttc caaaaaaaaa 14220

aaaaaaaaag ttataatagt ttatttgctt ggttagctga aatatggatt aaaagatggt 14280

ccaatgttag tgagctggaa atgccttggt ttaatgtaga ggaagtgatc caaaggctta 14340

gggagattag gatggtggag tggattagtc actttagacc tactcatccc agctgggagg 14400

gtccagaaga tacacccttg gccgaagctt tgtgaaatag atttgtgaga gcagcacctg 14460

tatttttgaa gagcccgtaa ttgctcttct ctgtatgtca gatctaacag taggaaccac 14520

agtcactcaa ctacaaaatt taaatacaat gggaataatt ggatcctgag gtggcagggg 14580

ccaagtgttg gcactgaacc atcaaaggca aggtgggcat aactaccata atagacagca 14640

gaggcaaagc agccatcaga atagtctgac tcatgtagag ctctggcatt ggctaattaa 14700

tcatggtgtt cctagaagtg aaattgatgg gaaacctact gtattcctac ttgatttata 14760

taaacaaaaa actgccaggt agaatggact aaagactaat ctgaattata aaaacagaga 14820

atcatgggcc ctcaatcaat ttccagactc gaacctgtta cagttccaga acccactgaa 14880

tgaaggggag gctggatccc cttgaggaag gacaccacta ggctactgac aacttatgct 14940

gttactcttt ctcccatcct tccctaagga gacctctggc cttttaccag ggtaactgtg 15000

tgtactggag aaagggaagt aatgagacat ttcagaaagt actggacact ggctctgagc 15060

tgacgttgat tccagggtac ccaaaacgtt attgtggttc cccagttaaa gtaggggctt 15120

atggaggtta ggtaattaat ggagttttag ctcatttctg acttacagtg gttccagtgg 15180

gtccctggac ttatcctctg gtcattttcc cagtgccaaa atgcataatt tgtatagaca 15240

tacttattag ctggcagaaa tgccacattg gctccctgac tggtaggatg agggctatta 15300

tggtgggaaa ggccaaacag aagccattag agctgtctct acctagaaaa ataaaaaaat 15360

caaaaacaat atcccatccc tggagggact gaagtgatta gtgtcaccat caaggacttg 15420

aaagacgcag gggtggtgat tcccaccaca tccctgttca actctcccat ttgacctgtg 15480

cagaggacag atggatcttg gaaaatgatg gtggattatt ttaagcttaa ccaagtggtg 15540

actccaattg cagctgctct accagttgtg gttttgttgc ttgagcaaat taacacatct 15600

cctggtgcct ggtatgcagc cattggcttg gcaagtggct ttttctccat tcctgtccat 15660

aagacccacc agaagcaatt tgccttcagc tgacaaggcc agcattatac ctttaccacc 15720

ctacctcagg ggtgtatcaa ctctccagct ttgtgtcata atcttatttg gagagacctt 15780

gctcgctttt cacttccacg agatataaca ctggtccatt acattcatga cattatgatg 15840

attggataca gtgagcaaga agtagcaaac acactgaact tattggtgag acatttgtat 15900

gccagaggat gggaaataaa tccagctaaa atttagggac tttctacctc ggtaaaattt 15960

ctagggttcc agtggcatga gacctatgga gatattcctt ctaaggtgaa gcataacttg 16020

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tgaaaggctg ccagatttaa gtgcagtcta gaacaaaaga aggctctgaa acaggtccag 16200

gctgctgtga aagctgctct gccatttggg ccacatgacc ccgcagatcc aatggtgctt 16260

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tcacagtgga gacctctagg attttggagc aaggccctgc cacttctgca gataactact 16380

ctccttttga gagacagcta ttggtctgtt attgggcttt ggtggtaact gaacgtttga 16440

ctgtgggtca taaagtcacc atgctacctg aacctgccta tcatgaactg gttgctttct 16500

gacccatcta gccatgaagt gggtcagcac agcggcattt catcatcaaa ttgaagtggt 16560

gtgtatgtga tcgggcttga gcaggtcctg aaggcacaag taagttacat aaggaagtgg 16620

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tcatagatgg ttctgcacga tatgcaggca ccacccgaaa gtggacagct gcagcactat 16800

atccactttc taaatgcatg tgtacacttg tgctaagaaa atatctttat tttatttcct 16860

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taagtgttgt tcatatcagc atttaaatat tgttaacctt atgtaataac ttttggtttg 16980

gggattggtg cgtttctggt tgtatgagga tagttgtatt atattaggca taattatgac 17040

cttattattg tctttatttg aagattatgt atgatttcag gatgtgtgta tgggttcaag 17100

ttgacaagga gttggacttg tgatggttaa tactgtcaac ttgattggat tgaaagatgc 17160

aaagtattaa tctcggttat gtctgtgagg gtgtggcaaa aggagattaa catttgagtc 17220

agtgggctgg gaaggcagac ccacccttaa tctgggtaca caccatctaa tcaagttcca 17280

gtgtggccag attgtaaagc agggagaaaa atgtgaaaag actagactga attagcttcc 17340

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cttcagcgtt gggagttgga ctggctttct tgctcctcag cttgcagagg gcctgttgtg 17460

gaaccttgtg atccgctgag ttaatactac ttaataagat cccctttata tacatataat 17520

atattatatt atatataata tatataatat atattatata taatatatat aatatattat 17580

atattatata taatatatat tatatattat atataatata tattatatat aatatatatt 17640

atatattata tattatatat aatatatatt atatataata tatataaaat atatatatat 17700

cctattagtt ctgtccctct agagaaccct gactaataca atttatgtca ttaatctcat 17760

ttattgattt gtatacattg aaccaacctt atatcccagg aataaaacct acttgattgt 17820

ggtggattag ctttttgatg tactcttgga ttcaattgct ggtattttat tgagaatttt 17880

tgcatctgtg ttcatcaagg atattggctt gaagttttct ttttttgttg ttccatatca 17940

gaatgatgac gacctcatag aatgagttag tctgtcctct tttatctttt ggaattgttt 18000

caggaggctt gatatcagct cttctttata tgactggtat actttggcta ggaatctctc 18060

tggtccaggg gtttttctgg tgtaggtttt taattactga ttcaacttca gaactcatta 18120

ctcattattg agttctaaaa ctcactttca tgtactcttc aaaagactgt cttcttctgt 18180

tgttgagcgg ggtgttctct caaggtcgtt taggtgaagg tggttgctgg tgttcttctg 18240

tatccttact gcttgtcttt ctcttttttt attgactact gaggattaat ggtgatgtgt 18300

ccaactttaa ctctagatta gtctatttct cttttagatt gtaactctgt tttatatatt 18360

ttgaagctct gttgttaggc atgtgtattt ggattgttag gtcttcttga tgatgacctt 18420

tatcattatg taatgtttct tcttatctct ggaagtattc gttgttctga agtctatttg 18480

tgctgatatg aatacagcct tcacagctct attttcacta gtatttgtat atctttttct 18540

cagcttttaa attgagatgt tcagaccatt tgcattaaag tagttgttaa taggattaaa 18600

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tcatattttt ctgccttcat ttatattgag tttatctcca cgacttactt attaaattaa 18720

tttttaatgg ttttagtatt ttccacaatg tttataatat atactttgat tttttcacat 18780

tccaccttca aatgacagaa ttatactgga tatatagaaa tcttacatca ttgcacttct 18840

ccttcctccc tctcaaaatg ttgtgctatt gctctttgta atagaggctt acttctatta 18900

tgttatagct ctcataatac attgacacta tttttaccct gaataatcag ttgtttttta 18960

aagtgattat gactacaaat attttgaata atttctttat tttaccattt ctggtgctcc 19020

ttatctttta cagtagatcc caatttccat ctggagtcac attctttctg tgaaaaacaa 19080

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ctgaagaagt ctttattttg ccttcagttt ttaaaagtga ttttgctgag tatagatact 19200

gggttgagag tttcattcct tgtatcattt taacaatgat gttccattat attccgtttt 19260

gaatagtttc tgactagaaa tctgatcttt gtttctttgt attcaatagt tcctttttct 19320

ctgactgcct ttaagatatt ctcatctttg tttttcaaca gtttgactat aatttgttta 19380

ttattaactt tttgtattta ttctgcttga ggtttcctga gctccttgga tttgcagatt 19440

gttgattttt attgtttttg taaaattcat agccattatc tattctactg ttttgttttt 19500

tttttcactt ctctctctct gtattcttct ttttggactg taagtattca aatgttagat 19560

cattcatatt gcttcataaa ccttatatgc ttcttctgct tttttttttt tgtcaggaac 19620

tctttttttg tatctgtgtt ggtttggata agttctagta gactatgttc aagtttatgg 19680

attattttgt tagttgtgtc taattgactc ctcagtgcat tcagagaatt cttcatctct 19740

gatattataa atctcttcct agcattttca tgttactctt ttctatagtt tccatctctt 19800

tgctgaaatt ctccccctat ccatggatat tgtccacctt taccacaaga ttctttaaca 19860

tattaacata ggtatcatac aaacccaaac tgatagtttc cagatggtgt cttttctgag 19920

tctgtctgtc ttgattgctt tattatttaa cagtgactta tcttccctct tcagcttttg 19980

gtgtgtcttg taattgttta atcaaacact gggtatcata aatggaggaa cagtagagat 20040

tgcagtaaat attatttatg ctttgaaatg ggcacccatc ttctgttgaa aatatgtttt 20100

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attctcagta ttcttgtgcc ttatttggat ggaacttgaa cctgtggtgg gtttggagag 20520

aaagagtagc agacgtctgc tatgttgcaa tgcaggatgc tgggcacaag aaaatttcca 20580

gtctctcctc caaggaaata agatttgatc atctacctat ccctgagaag tgaagggctt 20640

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gtggtcctca tgaacattaa gaagagattt ctaaaaaaga gcttgcacat gagcatagtt 20880

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agaattaaat aaagttctag aatgatatga atctattcct ttggtttttt gcacgtctgt 21000

ctgcctgcta atcaagagaa gagaatggtc gtaattctca gagacttttt cctgtttgtg 21060

tcataaatga cttcacattt ttttctgttc taagaactat tcagcttgat ttcttctgtt 21120

ttaattttag cagcacctga gcaaagccat gtggtccagg attgctacca tggtgatgga 21180

cagagttatc gaggcacgta ctccaccact gtcacaggaa ggacctgcca agcttggtca 21240

tctatgacac cacatcaaca taataggacc acagaaaact acccaaatgc gtatgtcatt 21300

aatcttacag taagcaaaac aaggtccaag taaaatttgt cttagaaaag gtgtgcgtca 21360

agctaacttc ttatgattaa atttttctca cacatagaat gcatggcaaa atgtctgaga 21420

aacattactt tgagcaaaga gtatgataga agagaaatgt taagctggct ctctttcctg 21480

agagtttgat aaaatcagga gaatatctgg cggtggtgag gccacaataa tggaaaatca 21540

gaatgtttag acagagtcag cttcaacaac actcactaaa ggtcaatgtg atctttaccc 21600

cttgaaattc tataattcta atctccaatt cctgaagtga aggttgtgtt ggccttttct 21660

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tatatctatg tctattccaa cgggtagaaa caccctgggt cctgagcacc agtggtctga 21780

aggaatacgg gttgccagga agagagaagc aaaggcagga aggcagatga aagtaagaaa 21840

tgagacagat gctaaacaat aaaaagtgcg ggaagataga cagaagctgg ggtctgacca 21900

caccatggcc agtctttcac acataagtga ctaccaaaga caagaaaaaa tgatttccgc 21960

ttgttggaca atagatggta gaggaccaag ggaattgcga gagagagaac aatgagatca 22020

actcaacaga tgcactggtt ttcttcctgg agacccttcc tgcactgaag ggcaggagat 22080

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gagccacaca gacataaagg aaaacataaa aagatttcct acatgtggga agcaagtcac 23160

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ttccaaatat aaagaagatt aaaaaatcac ggactcaaga agctcaatgg atcagaaaaa 23280

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agcaagagaa gatccaagga aggaaggcag atgagagtca gcacagagag ggatgctgaa 27360

aagtaaaagg gatgggtgga tggagagaag cccgggtctg accacccaat ggccaatatt 27420

ttggccacaa gcgactacca gagacatgga aaaatggttt ctacatgtgg gacaacagat 27480

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tgagagttga ctacttgaaa caaaatgata gcaagatatt taacttcagc atatgtagag 29400

gtaagaattt gaaatggtag cataaatcac gaagggatta attcgaagtg taccgttgta 29460

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tactgtgcgg gttcgaaggg atattgcaaa tcctagagca atcacaaagg tttgaactct 57300

gaggtttttg gtataataag aatagtccat gcattcaaaa gagggaagcc aaggaagaac 57360

tagaagtctt tcaagagctc aggctcttat acatccagtt gctcattgaa ccagcttcct 57420

ggaatggagg gtctggggtt gagactaggc cacaagtcta gagtctctag agagacagtg 57480

ttggaacccc atggcccata atacatttcc cattttctca ggcagccaga ggtcatgaat 57540

gtgaggatac tgggaggttg gagcaacgtt cttgggaggc ataaggaaga gcgaatgctt 57600

caagatcccc gcagcccaaa ctactcgcct gctttgcccc ctaatgcatt tttctctgct 57660

gctccgtagc tgtccgacct cttcagatct cttagtccac cctgccgtct tcctttatgc 57720

catgggtccc actgttcttt caactcatcc ccctttccct cagtcccgga gtagctgcgg 57780

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tactgcatcc tgcctgggag caagttttcc agggcagctt tgagaagtct tggagaaaca 57900

aacctactaa acctgacaga cagtaatact atttgcacaa tgcttttctg tgggaaaggt 57960

agagcctttt cactacgtat tgagtacata gagtgtgagg gttgacctgg aacggctatc 58020

ctcctggatg acgtgcgttt tctgaagaac tacatgttcg ttgcaactcc cacattagaa 58080

tatgaagtcc taccgagaga gatacggaga ctagacagat acagatgcat ttgcatgtga 58140

atacacaatc ccacaataca gacgtcaaaa cccataccag ttattccaga gagatggatt 58200

gggcagaagg cagaaggaga atactctgat cgtttttcgg ccacgtgtgt gtgttatctc 58260

agtgtttcta agaagcgttt gctactttag attttttatt taaaaaaaat agtaataatc 58320

tattaagtat gagagatgtg cagagacgat tagtgatcga gagccatttt tgctggtggc 58380

aatcatatgg tacttttaat gggaatatta gaaaggcacc ggtaatgacc ttgttgcagc 58440

acaaaggaga gagtgtgggg tgcccctgca tgttgtccca cctcttgtga cgtgtatcgt 58500

tttggaattt ccagtggctt gatcatgaac tactgcagga atccagatgc tgtggcagct 58560

ccttattgtt atacgaggga tcccggtgtc aggtgggagt actgcaacct gacgcaatgc 58620

tcagacgcag aagggactgc cgtcgcgcct ccgactgtta ccccggttcc aagcctagag 58680

gctccttccg aacaaggtaa ggagtctgtg gccagacatc tacacgcttc gatgctggga 58740

tgaaaagcca tggaaattcc cactgatgca gccgccttca atggtaaacg gatgctcgag 58800

tgttgcctga gttctaccat gtaggaggaa gcctccgtgc actctctggg ggagccagcg 58860

gagtgatttc tggtgcaacg tggttgggct ttgtctttag gatgggcaca aaccctccag 58920

ggggatcgac ttcaaaattc accttgttgt aaaacgggct acctcagtgt cccagccaaa 58980

atttttattg taacatgctg tcaggtgtgt cactctttcc aagccagtaa gcttttccgg 59040

ggatttcttc aagtagccag cattcagagc aatcttcagc attgcagatt ctgagaaatg 59100

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ctgggtctat ggagcagtat atgagctccc aatgctctaa ggctcttcag tcctaggctt 59220

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gggtctagag agaaaggtta gtagacttct cctttactgc aattcaggat gcagggcatg 59340

agaagattcc ctccctcctc caagggaaga aggttttggc gtgcacacat ccttgagaag 59400

caaagtgtct ttgccttcag tcagatatat aggatcgttt tctgccccat ggcctggaag 59460

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ccctttgtat gaacattcag tagagtttca tagaaaggtg ctacttcgtg agcgcacttt 59640

gcagtgagaa ggagtctgtt ctgttctgtt tttctaagga tttcaggtga aatatttcct 59700

agaacttact acagttctag attggtagga atctgtaggt ttgctgtatg ttttttggtt 59760

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actcctttct ggttgtgtca taaatggctt cacatatttc gttattctca gagatactca 59880

gtttatttct tgtgttttca tttcagcacc gactgagcag aggcctgggg tgcaggagtg 59940

ctaccacggt aatggacaga gttatcgagg cacatactcc accactgtca ctggaagaac 60000

ctgccaagct tggtcatcta tgacaccaca ctcgcatagt cggaccccag aatactaccc 60060

aaatgcgtat gtctttgttc tttaccataa gagaataaag ggccaactga agtttctgtg 60120

acaagagaca tgcttcaagc tgagttctcc gaactcaact tgtgtcagat tcagatggtg 60180

tagcaaaatg tctcaggatg atttccttgg agctaagggt ctgagagaag agaaatgtta 60240

agctgcctca ccttcctcct agttttgtgg agcagaaggg aaatgaggag gcgaggagat 60300

caccttatga agaaagtcag aatgacgaac caccaaacac ttagattacc cttgcccaac 60360

acccactaag cgtcaatgaa gactttccag ttggaattcc gttattctga cttccaattc 60420

ctgaagggaa gattgtgttt gccttttctg tctgggctca tgaggaaagt ttatgtgctt 60480

acttatggac aggtgaattg atctgtttct atttctacct gtattccaat agggagaaaa 60540

tctcttggtc ctaagtacca gtggcctgaa aggatagagg ttcccagcaa gagaagatcc 60600

aaggaaggaa ggcagatgag agtcagcaca gagagggatg ctgaaaagta aaagggatgg 60660

gtagatggat agaagccctg gtctgaccac cccatggcca atcatttggc cataatcaac 60720

aaccaaagac atggaaaaat ggtttctaca tgtgggacaa cagatggtag aggacctaga 60780

gaattgagag agggccaatg atgagctcaa ctccatagat gccttggctt tcttcctgga 60840

tacccttcct gcactgaata gcaaggagat ggagctcaag cagcctgtag ccatctagct 60900

gagcagagga gagggattgg agtttgggat gactctggta ttttctaggt ccgctacaaa 60960

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gttggcctca catgacactg catgtgcaca gaaaatggtt ctacagaaag tgtggcaaag 61080

aacatttact gagaaacagc aactacaaga gaacagcaag ctcaattaag aagatagaga 61140

tcacatagca ctctgtgtta ttggagttct taccagctag atgagagagt gctcacggaa 61200

cacattgcca attcagtgga gaccccagaa cagccataat ttcaaagtac aattagtata 61260

ttactagaat aaaggcagct gcagacaacc ccttgcacag ctgaaaagca agtgtccaag 61320

catcaaatgg gtttccaatc aatgaagtgc ctgtgagagg aaatctcaac tctcttcaga 61380

agtaaacaac aaagtcaatt gcctcagcta tgcggtatcc ccagagtgag tcctaaatta 61440

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caatacaaac aggctcagaa atgacatcga taattagaat tgcatgaaaa tttgacatat 61560

cagtatgata actgatttca gatatttaaa aaaagtgcaa caaagcaggt atcatatcaa 61620

gacaaattaa tagtatagaa tagccaaatc aaattaaaga actattatac aaaaagtatg 61680

tcttaaatga agaaattact gtatgtccgc ctgaaaaatt tagatgtttc agaagaaaaa 61740

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cacacccata cacacacaca tgcaaaaact cacaagttct aacacacaca caaacacaca 61860

cacacatgca catccctaaa gaaataggga aatataaaat taaccgaccc tcagagacat 61920

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tattaaaatg ataatgagga acaagaagag atcaaccgag aatgctgaat ccagcaataa 62340

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aactggaaag tgtaagactt tggaatcagc aggcttatgt agcaacagag gtgacccgaa 62460

agaattaggt ataagaagaa tagaagaatt gcatgaaaat ttgacatatg actaagataa 62520

ctatttcaaa tatttaaaaa aagatgaata tgtaataaaa cagataaaat atcaaaagaa 62580

agtaacagta ttgactagcc aaatcaaatt aaagacttag tgtaaaaagc tatgtcttaa 62640

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tagtgaaata gaaaaccaac cgaacctcac agacatgttg caaaatagga aaagatttcc 62880

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ggaatcaagg atggccgaaa acttttcatt gatcaagaat attaacaaaa tcgcaaaaac 63000

acgaaattca atgcatcaaa taggcgtttc gaaaaaaaga aaaaatctgg tatgatgcac 63060

ttttgtactt cacattttca cggtaagaag acaaagatat aataacaaga aacttcttat 63120

gagaaactgg ggaaaaacaa gctgtttctt gctagaagaa cagtgataca aattgctaat 63180

gcattctcgt caaaaacact ggaagccaga taccgggaat gttattaatg tggtaaacag 63240

gaacaagaag agatcaacca agaatgctaa atccagcaat aaaatgcctt gaagatcatc 63300

catgctgcat aaatgtatgt tgtgcactgc cccaaacaaa gaaaccggaa actgtaagaa 63360

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tgtagatgta aatgcaaaat attttcttga ccaaatttct atatattttt aaatgagcgt 63540

tgactactgg aaacaaaatg atagcaatat atttaatttt agcatatgta gaggtaagaa 63600

tttgaacaag tagcgtaaat catgtaggga ataattagaa gtgtaccatt gtaagtttct 63660

tacctcatgc acaatggtat gtaatattaa taaaatgtta ctgtgtgggt tcaaggagat 63720

attgcaaatc ctagagcaat cacaaagttt tgaactctga ggtatattgt ataataagaa 63780

tattccatgt attcaaaaga gagaagccaa ggaagaaaga aatttgtcac gagtttgggc 63840

tcttagtaca tcctgtagct cattgaacca gcttcctgga atggagggtc tgggattgac 63900

actaggccac atgtatagag tctctagaga gacagtgttt catccccatg gcccgtaata 63960

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tgaactactg caggaatcca gatcctgtgg cagcccctta ttgttatacg agggatccca 65040

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tggttggttg ttgcttttct caagtccatc tgcctacaaa taaagaaaca agaatgttac 66300

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ccataagtga aggaagggtc agtggaaatt tctgttagta gagtcatgct tcaagctgag 66660

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aagagagaga tcctgtaaag taaaagggtg gatagatgga cagaagccca ggtctgacca 67200

gcccatggcc aggctttagg ccataagtga caccaaagac atggaaaaat ggtttctaca 67260

tgttggacaa cagacagtag tggaccaaaa gaatagtgac agggggaaca atgagatcaa 67320

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ggagcccaga tggactgtag ccatcttcct gaatgcagga gagagattgg aatttgggac 67440

tactgtggta gctaggattt tataggcctg ctgagaatga gaatggattt gtggatgaaa 67500

ggagctccag gggcacgcat agtagtctcc tcgaatcttt ggctaaacat gacgttgcat 67560

gtgcccagaa aaaggttcca caagaaagta gagaaaagaa tatatcctga ggaatagcaa 67620

ctgcgattga acagtgagct caataaagag gacagagccc tcatagcatt ctgggatact 67680

ggagttctga ccagctggag gagagacctc actgaacctc ttgggaatac agtagagact 67740

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ttttctttaa aaaaagtgat aatatattaa gtatgagaaa tgtgcagaga ggattagaga 70380

ttgagagcca tttgtcattg tggcaattgt atggtatctc ttttgggaat atttcaaagg 70440

caccagtaat gaccttgttg tagcaaaata tacagtgttc ctgcatatgt acccattttt 70500

tgtgatgtgt attcttttgg aatttccagt ggcttgatca agaactactg ccgaaatcca 70560

gatcctgtgg cagccccttg gtgttataca acagatccca gtgtcaggtg ggagtactgc 70620

aacctgacac gatgctcaga tgcagaatgg actgccttcg tccctccgaa tgttattctg 70680

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ggaaggggtc agggaactcc ctcccctagc caaaggaagc cgtgagggac tgtgccgtga 99540

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caggagattc ccttgggtgc ctacaccacc agggccctgg atttcaagcc caaaactggg 99660

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ctaagtggtc tttctcagtg gatcccaccc ccatggagcc cagcaagcta agctccactg 99840

gcttgaaatt cttgctgcca gcacagcagt ctgaagttga cctgggacgc tcaagcttgg 99900

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gtagcaagag tgcctctcta gattcctcct ctctgggcag ggcatctctg aaagaaaggc 100080

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gattgaaaat caacttaatg aagtaaagcg tgaaaacaag attaaggaat aaagaatgaa 100560

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tggtgtacct gaaagtgatg ggagaatgga accaagttgg aaaacactct tcaggatatt 100680

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cttttttact attattatac tttaagttct agggtacatg tgcacaaggt gcaggtttgt 101040

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tccaagtctt tgctattgtg aatagtgccg caataaacat atgtgtgcat gtgtctttat 101460

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gtatttctag ttctaaatcc ttgaggaatc accgcactgt cttccacaat ggttgaacta 101580

gtttacagtc ccaccaccag tgtaaaaatg ttcctatttc tccacatcct ctctagcatc 101640

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tggggttgtt tgattttttt tcttgtaaat ttgtttatgt tctttgtaga ttctggatat 101880

tagccctttg tcagatgggt agattgtaaa aattttctcc cattctgtag cttgcctgtt 101940

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catatgaact ttaaagtagt tttttccaat tctgtgaaga aagtcattgg tagcttgatg 102540

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ctttccatgt ttagtgcttc cttcaggagc tcttgtaagg caggcctggt ggtgacaaaa 105180

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ctcttctcga ggagtatttt tgtggcattc tctgtatttc ctgaatttga atgttggcct 105480

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taagcaactt cagcaaagtc tcaggataca aaatcaatgt gcaaaaatca caagcattcc 109740

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aaaaataagc aatggggaaa ggattcccta tttaataaat ggtgttggga aaactggcta 110340

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gtcccagcta cttgggaggc tgaggcagga gaatggcatg agctgaggag gttgagcttg 110640

cagcaagcca agattgtgcc actgcactcc agcctgggca acagagtgag actccatcaa 110700

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cacaggggcc tgttggggag ttgaggctag gggagggatt ggattaggag aaatacctaa 111720

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ccaccccagg gtccttgctt tctgtgcctc ttactccatt gttttctgac tcctctgtag 112920

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gatctacctg gtatgttatt tacagtaata ctattttcat aattgctttt cactctaaaa 113220

gtagagcctt ttagctacac tgtgagtaaa taaaggggct ggcctgggaa tggtatcatg 113280

ttggatgttg tttcttccct gaagtaatat atatcagtta caatttacat gttactgcag 113340

agtcctagag agagacacag agaatgagac agataccaat acatttttat gtgcattaaa 113400

aaaatctaag gccaggcgca gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 113460

gtgggtggat cacgaggtca ggagattgag accatcctgg ctaacacggt gaaaccctgt 113520

ctctactaaa aatacaaaaa attagccagg cgtggtggcg ggcgcctgta gtcccagcta 113580

ctcaggagac tgaggcagga gaatggcttg aacccaggag gcagaccttg cagtgagccg 113640

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aaaaatctaa aatgcactct tcaaaatcta tgtcatttat tctggaggaa tgcagttggc 113760

agaaggagga agatattccg aatttttctt gtatacattt atgtatgatc tcagtttttt 113820

tatggatcat agaccaattt tgatatttta aaataaaaat tataatctat cttggaaatt 113880

tacatggttc tttagaactt gaggaccgtt tttgcttttc ggaatattat tgtacctaaa 113940

atgggaatat tacaacgtca ctttttaaca ctttgttata acaaagttta gacagcgctg 114000

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ctgaccgaga actactgcag gaatccagat tctgggaaac aaccctggtg ttacacaacc 114120

gatccgtgtg tgaggtggga gtactgcaat ctgacacaat gctcagaaac agaatcaggt 114180

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atgatattta ttccatctaa tcctggggct atttggcagt aaataccaca gaatacacta 114720

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gaagggtagt agacttctgc tttgttgcaa tgcaggatgc tggaacaaga ggattccctg 114900

tctctactgt aagggaataa gattttagcc tccatccttc tctaagaagc aatgtgtctt 114960

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tgcttgtgag tatactaaag agaacagtca taattctgaa actactgtcc tgtttgtgtc 115380

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cagcaccaac tgagcaaacc cctgtggtcc ggcagtgcta ccatggtaat ggccagagtt 115500

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cttgttagga caaatttccc ttagacccag aaggtgtgtc aaaatgtcca gacaactttg 115740

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tcaaatgatc aaatacttag agtgccattc tacaaggctc ataaaagatc aatgcactct 115920

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tatatatgtt catatatata tgttcataca gactagtatt catatatata tacatatata 116160

tatacacaca catatatata tatatatata tgttctaggg aaacatgcaa ggtttttatg 116220

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taatataata taatataata taatataata taatataata taatataatt aatatatata 116400

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gagaggaaga gcaaaagcaa gaatgtagat gagaattagg aagtaaacag atatggagat 116520

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aatgactata aaagatatta aaaaacactt tccacatgtt ggacaagaga cagtacagga 116640

ctgagataat ttagaaaagg aaatgaatga gcgcaactcc gtaactatta tgactttctt 116700

cctggagaac cttcctggac tgaagggcaa ggaattggag ccaaagccaa ccacagcagt 116760

cttgctgaac tgaggaaaga gactggagtt tgggatagct aagaaaatgt gtattttcta 116820

tgctaggtaa taatgagaaa gaatttgtgg tgaaaaggag ctgaaggaat atgcatggaa 116880

gtctaatata aactgcatat gcacagggag aaattctaca aagtgggaca gagaaccact 116940

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aaatgatctc caagtaaatt aactgcctga cagaagaaaa ctcaaccatc actggaggta 117240

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tacgtattct gccacctcca gaggaaacaa gcaaaaaaac aaaagaatgt ttccaaggca 118260

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atataaaata ctcttattta tctaattttt aaatgtattt aaaggacaat ttgtgatatt 118440

aattaaaata ataggaatat attgttgttt caacgtatgt agtagtaaaa ttcataaaaa 118500

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atccatgaag ttatataata ttaatagatg gttgaatgtg atagtttaag gtgggatatt 118620

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acagaaaata catagcatta ttgtagacac aaactgaact accttatgag tatattaaat 118800

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ctaagtgtgt tctttttaga ataaatactc tttaagtgta aagatctact ttaaacacca 118920

aaatatgaaa aaggatatat accatgaaaa cctgaatcat aaataagctg gagtggtgat 118980

taatggatgc aggcactcct aaagactaat aagtgaatgt ggtcaaattg aagaaacaaa 119040

agtatatacg tgctcaatgt gcaaaaactt tttctgtata catgctatga tcctttggaa 119100

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taaatttcac acactatgct caaggactat acaccttgca ctagaaaaca atgttgagga 119220

aagaattaaa agatctaaat atacaccatg cttatagatt aaaagactcc atatcagttc 119280

tcgtgaaatt gatctttgga tgaaacccac acccaagcac tattgcaaca gtcctttttt 119340

ggaaaaaaaa attggaggac ttatatacct taatataaag acttataaaa gtacaggaat 119400

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ggctgagtct ggaggatggc ttgagcccag atgttcaaga ccagccttag caacagagtg 119520

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gagcattgat catgcctctg cattccagcc tggatgatgg aatgagacac tgtctcaaaa 119700

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tacaaaacaa aagcagaact tgacttttgc ttttcatctc aaattatttt gatatctctt 119940

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gcatgtaatg cacattgtaa acctcagatg gccatcctag gaaatcaatg aagggtagtg 126660

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ttcttgtgtt agtttgctga gaatgatagt ttccagcttc atccatgtcc ctgcaaagga 140520

catgaactca tcctttttta tggctgcata gaattccatg gtgtatatgt gccacatttt 140580

atccaatcta acattgatgg gcaattgggt tggttccaac tctttgctat tgtgaatagt 140640

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tatataccca gtaatgggat tgcagggtca aatggtgttt ctggtgctag atctttgagg 140760

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tttaagttct ttgtagattc tggatattag ccttttgtca gatggataga tggcaaaaat 141120

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cactgtggaa aacaatttga cagttcctta aaatgctaaa catagaatta ccatgtgatc 147000

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cttattgggt actgcattgt gctttggggt catgaaaatg ttttggaact ggatggaggt 147300

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cctcaaacca gtaatctagt caaaaaagca attcccaagg catgacattc agattcatca 149880

gcactcacag agactacagt gattgctgat aacgccaact taatacctgg ccaacagcat 149940

ggatcctgac ctccactttt cttgtgtgtt tacagaacca caaaaaggtg cagtgttttc 150000

a 150001

<210> 3

<211> 138001

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

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tagattagct aatatttaaa aattgaacac tcatacaagt gtggtgaagt gattgttttc 120

tagtgacatt ttacactgtc ataaccttct agaaaataaa ttggcagtgt tattgggaga 180

cagaaatatg tctatataat ttatgggaac ttaggctcag aaaatattaa ggaataagaa 240

tgaactttat gaacaaagat gtggagggtt ggaagcaaga ggggggccaa cgcgcacggg 300

gaggaagcat ttgggcagtg actccgcaga cccaggctca ggttgaacta gacaacctcc 360

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attttaacca tttttgcagg gtaccaccaa gtggcattta gtacattcac agtggtgtgc 600

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atgtaatgtt gagtgaaaaa atcagggtgt gaaattttgt gatatgatgt aattagtgaa 780

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catttaaaca ttattcttta tggttttaaa agcaaagaaa aaggtaaaga aacaacaacc 900

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cttatatgac gtttacactc tccagggttc agagagtctg gcagcattgg gagctgcctt 1020

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ttataagact ctatattcaa ggtaatgttt gaaccctgct gagccagtgg catgggtctc 3180

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tttatacata catacacaca tacacaccgt gtgtgattgt gaatgtaagt gtgtgtcctt 4020

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tggtataaag aaagtgattt gcttccaaag ctagcttagg ggaagaaatg cagcagtcct 4380

gccgtactac ttcactttag gagcagaaag tggcactttt aaaaggcaac agaggaggcg 4440

agcaaggatt caggggtcca tgctagcttg ggcaccttat ccaccaggta gttgagcagt 4500

tgcctgctgg tgcctttgtg agcagggtgt tgtcccttga ggcaaatctc tggagggtga 4560

gagttttgta gtgggcatgc tttggtttat aaatcacctg tgaactcagg agttccatct 4620

tgaagcacat acatagttag atgaacttgc cctgcaggga gagtctgatg aaagggaggt 4680

agatgcttgc aatttaatct ataaattacc agataaaatt ttacaagttg actttaaagt 4740

caaacacatt tgaatttagt ggaagccatt caagaaaata tcaaagaaaa tacagagcag 4800

gagaagatta agcaaagagt tttttgggga aattggtgtc tatgtctgtg tgtgtaggga 4860

gtgcagggga tatgaatatt ctatttcagc ccatggaaac taggatgtag atcactgtga 4920

acttattcag caggctacac ccaaaggcta gaacaaactt ctctgccaca ggattaacat 4980

atgttttaat cgacctgggg ggcacattct ctgataagct cttttggaaa gccaggcttt 5040

ctgtggacgt gttatctttc caatgtgtgc tggaatgccc ggggagagga aaaagtttct 5100

tttacagcca tgctcagtga gaagcggaga aacatcttct attcacaaat tgctaagtct 5160

tttacacatg caaatatgca tacacattca cacaccacag tgaggaagaa attctcacac 5220

cattaataaa atacatttac ttcagtagca atatacatct acattttgcc tataatataa 5280

aagtattttt cctattaaaa gatttgttta atgtttcttc accaacaaat aaaccctatt 5340

aaatccccat tgccatatga gccctggagg tgaatcagag aaacaaaagg attgtggaaa 5400

aatcatcagg ttaaaaaaag aaaaattgat tctgttttgg gatatttcct agcaacatga 5460

gctggggagg ggatctcagc agtgatgctc tatgaagcat aataaaatga cacagttaca 5520

ggtaacttag ttaaaggggg aaataaatgg aagtttcctc tttttgaata tcaattgtag 5580

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gcaccttatt aatttattgt gtgttttgaa gtcacactgt gagctataga atttacccaa 5700

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tatgggccta aaatatctat ttctcaatga tattttgata tatctatcaa gtgcttttta 5820

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gagcatatta aattgaggaa ggacaaagtc acagaggtgg ggagcaggtg gactgtggcc 5940

aaggactttg catgaaacag tgagcgtgca tcctcctcct tgccctgccc tcatggtctg 6000

tgtactctca ggaggtcagg acaggccttt ctgagaatga gaatctgttc atctgccttt 6060

ctactggata cttgtcatcg gcatacaaac acatgttctc tgcagtgtgt catctttcag 6120

aacctcccct gaccctgtat tccctagaag tctcgctgct ttcagagcca ggcttctctc 6180

ctgctgccac ccccactgct cttctagtca ctctttaacc cactccatct gcatgtggcc 6240

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ctatcttcat tttattagcc tcttttggcc tctcaccctg tgaaaatcac tacattttgt 6360

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ttcatatcct ccattttttt tttgcttaat ttttgcccaa gatgagaaca taatttagtt 6780

cactttttat ttattcccaa catcatccat gcaccaacat ttttgtaact aaaggaggga 6840

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agagattacc caagtcctgc atgctagaca tgagtggagg agggggaata cctaggtaga 7200

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aaacattgta cttcttgtat tcttaataat gatttgcaat attgtcttta gtatcactgc 7500

aaacctctat aaatatgatt tttaaaaagt atttctttag gttggaatta cttctacgca 7560

ttgacttatc ttcctgggtt tcattagccg tacccgttgt actttcttcc ttaccactgt 7620

ttatctcaaa ctcttgagat taaagtatgg gctcaggagg gagcgaggag cttcaggact 7680

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actggtccct gcccctacta ttcctcactg ggcagagcac agccaccctg gccctgcctg 7800

aacattttag tcagtgttgg ctctgtgctt ctctggggag gaaatccaag agacaaccca 7860

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ctctttcttg tgagctttca cctgctactc ttcaccaggc aaggctcctg gcttgggccc 8040

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ggggtgaagc tcccagaggt gactgaaagt ccttctgcca ctaacactgc agtcatactg 8160

cccttgctgt acttggacta gggaaggaaa aaagatcctg agtgctttac tcacacccca 8220

gtgtgcccca gccaccctat ggaaaagagg ccagtgtgtc atccctgcaa gcaccctgag 8280

gcccctgccc ctgctgcccc caagctgtag agccagaata taaagctggc agaaaaatgt 8340

aaaaaggcta gactggctta gcctcccagc ctacatcttt ctcctgtgct ggatccttcc 8400

tgctcttgaa catcggactc caagttcttc agctgtggga cttggactgt cttccttgct 8460

cctcagattg caggtggcct attatgggac cttgtaatct tgtgagttaa taccacttaa 8520

taagctcccc tttgtgtgag tatatctata tctatagata gatataggta tactcactat 8580

atatacacat atatacatat actctctctc tctctctctc atatatatat atatataatc 8640

tcctattagt tctgtccctc tagagaaccc cgactaatac agattttcat accagaagtg 8700

gttcttgagg aacagaatat taaggatgga attctttcat tggttttggg acttctggtg 8760

ttggctgatt aatatgatta gaccaaaaaa tgctaaggac tctacttcta atagtatgga 8820

gaacactgat agtacttggc ctgaattgtt tagagagtta tgcaaaataa atgcatttga 8880

cactactgat tcatcactta tgagaggcaa ggagtttagt gactctatac ataatacctt 8940

tgactatatg tggagaacca aggaacataa tgaagttggt tgattgctcc taagttctct 9000

ggagaaagag atgaaagaaa atgatgatct caggggatct gtctcccacc ttcagaagca 9060

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ggacactgag tttgtgaact ctgatgaaac ttttttgcca gaagaaacag tttccccatc 9360

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caggcaagat aatgttgatt ctcctcaaga ggcaccccta atgcccctga atgcttctag 9540

acctataact aggctaaatt ccttgcgggc cccagaggtg aggttcagag tgtgacccat 9600

gaggaggtgc attatactct aaaagaactg cttaagcttt ctaatttata ttggcagaaa 9660

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gagttggatc aagctgaatt tattggtttg gccctactaa gtagggattc tgcatttaat 9780

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taatcccagc accttgggag gcgggggcgg gcagatcacg agatcaggag attgagacaa 9900

ttctggctaa aatggtgaaa ccccatctct gctaaaaata caaaaattag ctgggcatgg 9960

tgatgcgtaa ctgtaatctc atctacttgg gaggctgagg caagagaact gcttgaacct 10020

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caagactcca tttccaaaaa aaaaaaaaaa aaagttataa tagtttattt gcttggttag 10140

ctgaaatatg gattaaaaga tggtccaatg ttagtgagct ggaaatgcct tggtttaatg 10200

tagaggaagt gatccaaagg cttagggaga ttaggatggt ggagtggatt agtcacttta 10260

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atagatttgt gagagcagca cctgtatttt tgaagagccc gtaattgctc ttctctgtat 10380

gtcagatcta acagtaggaa ccacagtcac tcaactacaa aatttaaata caatgggaat 10440

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gcataactac cataatagac agcagaggca aagcagccat cagaatagtc tgactcatgt 10560

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tactgtattc ctacttgatt tatataaaca aaaaactgcc aggtagaatg gactaaagac 10680

taatctgaat tataaaaaca gagaatcatg ggccctcaat caatttccag actcgaacct 10740

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actaggctac tgacaactta tgctgttact ctttctccca tccttcccta aggagacctc 10860

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gttccccagt taaagtaggg gcttatggag gttaggtaat taatggagtt ttagctcatt 11040

tctgacttac agtggttcca gtgggtccct ggacttatcc tctggtcatt ttcccagtgc 11100

caaaatgcat aatttgtata gacatactta ttagctggca gaaatgccac attggctccc 11160

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ctctacctag aaaaataaaa aaatcaaaaa caatatccca tccctggagg gactgaagtg 11280

attagtgtca ccatcaagga cttgaaagac gcaggggtgg tgattcccac cacatccctg 11340

ttcaactctc ccatttgacc tgtgcagagg acagatggat cttggaaaat gatggtggat 11400

tattttaagc ttaaccaagt ggtgactcca attgcagctg ctctaccagt tgtggttttg 11460

ttgcttgagc aaattaacac atctcctggt gcctggtatg cagccattgg cttggcaagt 11520

ggctttttct ccattcctgt ccataagacc caccagaagc aatttgcctt cagctgacaa 11580

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cataatctta tttggagaga ccttgctcgc ttttcacttc cacgagatat aacactggtc 11700

cattacattc atgacattat gatgattgga tacagtgagc aagaagtagc aaacacactg 11760

aacttattgg tgagacattt gtatgccaga ggatgggaaa taaatccagc taaaatttag 11820

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caatgcctgg tgggcctatt tggattttgg aggcaacaca ttcctcgttt gggtgtgtta 12000

ctctggccca tttatcgagt gacctgaaag gctgccagat ttaagtgcag tctagaacaa 12060

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gaccccgcag atccaatggt gcttgaggtg tcagtggcag atagggatgc tgtttggagc 12180

ctttggcagg cccccatagg tgaatcacag tggagacctc taggattttg gagcaaggcc 12240

ctgccacttc tgcagataac tactctcctt ttgagagaca gctattggtc tgttattggg 12300

ctttggtggt aactgaacgt ttgactgtgg gtcataaagt caccatgcta cctgaacctg 12360

cctatcatga actggttgct ttctgaccca tctagccatg aagtgggtca gcacagcggc 12420

atttcatcat caaattgaag tggtgtgtat gtgatcgggc ttgagcaggt cctgaaggca 12480

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aggaagggaa gactaaggac tggttcatag atggttctgc acgatatgca ggcaccaccc 12660

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tattatatta ggcataatta tgaccttatt attgtcttta tttgaagatt atgtatgatt 12960

tcaggatgtg tgtatgggtt caagttgaca aggagttgga cttgtgatgg ttaatactgt 13020

caacttgatt ggattgaaag atgcaaagta ttaatctcgg ttatgtctgt gagggtgtgg 13080

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tacacaccat ctaatcaagt tccagtgtgg ccagattgta aagcagggag aaaaatgtga 13200

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tcagcttgca gagggcctgt tgtggaacct tgtgatccgc tgagttaata ctacttaata 13380

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tatataatat atataatata ttatatatta tatataatat atattatata ttatatataa 13500

tatatattat atataatata tattatatat tatatattat atataatata tattatatat 13560

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tacaatttat gtcattaatc tcatttattg atttgtatac attgaaccaa ccttatatcc 13680

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gtatactttg gctaggaatc tctctggtcc aggggttttt ctggtgtagg tttttaatta 13980

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tactgaggat taatggtgat gtgtccaact ttaactctag attagtctat ttctctttta 14220

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ctatccctga gaagtgaagg gctttgcctg cggtgctaga tgcaaaacca tttttctccc 16560

cccattgccc agaaacttaa ggctttggct tttctgagca gtggtctagg gaattgtgca 16620

aggttttcat atttgaccct gacagcccat caccacctac agcttgcagt gccaaatgta 16680

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aagagcttgc acatgagcat agtttctggt gagaagaatt ctgatatgtt aacttcctct 16800

aaacttttaa ataaaatatt tctaagaatt aaataaagtt ctagaatgat atgaatctat 16860

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ctcagagact ttttcctgtt tgtgtcataa atgacttcac atttttttct gttctaagaa 16980

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aactacccaa atgcgtatgt cattaatctt acagtaagca aaacaaggtc caagtaaaat 17220

ttgtcttaga aaaggtgtgc gtcaagctaa cttcttatga ttaaattttt ctcacacata 17280

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tgaggccaca ataatggaaa atcagaatgt ttagacagag tcagcttcaa caacactcac 17460

taaaggtcaa tgtgatcttt accccttgaa attctataat tctaatctcc aattcctgaa 17520

gtgaaggttg tgttggcctt ttctgtcttg gctcacaagt aaatgatatg tgcatatcta 17580

tggaaaggcg aatctatctt tttctatatc tatgtctatt ccaacgggta gaaacaccct 17640

gggtcctgag caccagtggt ctgaaggaat acgggttgcc aggaagagag aagcaaaggc 17700

aggaaggcag atgaaagtaa gaaatgagac agatgctaaa caataaaaag tgcgggaaga 17760

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gaggagggac attggagttt gggattattc aggtggctag gattttctag gcctgctaac 18060

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gaacatcttg ggcattcagt agagacccag gaaaagccat actttaggag tagaattagt 18360

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tagaggtaaa catcaaagtc aagtggctca gctatgcagt atccacagtg tgaggcctaa 18540

atataaaact tgactacaca tagaaacctt ttagtgtgac ccacaagcag gaggaaaatc 18600

agccaataca aacagaccca gaagagacag aaatgattag aatggcataa aaatttgaca 18660

tatcactata taataattga gttctaggat ttaagaaaac atgaatatag aatgcaacag 18720

acaccttatc cagagacagt aagagtataa agagccaaat cgaagaacta ctaagagata 18780

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gccaaattaa attaaagagg tagtataaaa aaagtatgtc ttaattgaaa aaaattactg 46500

tatggccggc tgatcaattt agacgtttca gaggaaaaca ttacccaaca cacaattcta 46560

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tgaagaaaca gtgaaatata aaattaagcg agcctcacag acatgtagga aaatatgaaa 46740

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aaataccgga atcaaggatg gctgataact tttcaattac gaagaacatt aaaaaaaatc 46860

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gtatgtgaat aaacgattcc acaatacaca catcaaaatc cataccagtt attccagaga 60540

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attatctcag tgtttctaag aagcgtttgc tactttagat ttttttttat aataataatc 60660

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gctcaatgga gatgctagag ctcacatagc actgggggat atttgagttc tgaccactca 74640

gaggagagac acctcactga acatcttggg cattcagtag aggtcaaaga aagccataat 74700

ttgggagtag gatcttcgga ttcctagaaa taaggtgact ccagaaacac tccagcaacc 74760

cttcttccaa gccagtctaa aaggatccaa atgatttcca agtaaattaa ctgccttcca 74820

gaaaaaagta aactcaaccc tccttagagg taaggaacga atacaagttt ctcagttata 74880

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tatggcattg gcaagaacat ttaaaatgca cctctgagaa ctgtgtttca ggaaaatgtc 75060

agcaaaagct gaccatgaga gaaatgaatg cataatatca gaaaagaaaa gaattgaaga 75120

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accaattaat caacagagcc tcaaggacat ctaggaaaac atccacacat ttaatatatg 75360

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gacagttgat ctaagaccac agcttaaata tctaggcaag gaaaagcaaa taagacacaa 75660

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aaatacatga gaaaacagtt ttcacaggtt ggacaacaga tatggtaggc ttgagagaac 78660

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gagagaaaca aaagcagaat agcaagagaa aagaaaagaa ccggagagcc aaatgaaaat 79560

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ctctatgatt tactgggata tatcatagtt aagttgcctc aattcaaagc taaaaagaaa 80040

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tgtatttggc agaaggtaga aggagggtat tctgatcctt tctggtacac attgatgttt 80640

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tgtttgcaca tgttgaacag cagacagtac aacctgagat agtttagaaa gggaaacaaa 83640

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ggatataatc tcctggtgtg ccgtttgcta agaccattgg aaaagtgcaa tattagggtg 102720

ggagtgtccc gattttccgg gtacatctgt catggcttcc cttggctagg aaagggaatt 102780

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gtgggctgca cccactgtct gacaagcccc ggtgagatga acccagtacc tcagctggaa 102900

atgcagaaac cacccatctt ctgctttgct catgctggga actgtggact ggagctgttc 102960

ctattcggcc atcttgaaac ctcccctctc tcacgatcac aaggtcccac aataggccgt 103020

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gatgttcaag ggcaggaaac atccagtgcc aaagaaagat gtagaatatt caacattctt 103140

aaagaaaata attttcaacc tagaatttca tatccagcca aactaagctt tataacaaag 103200

gagaagtaaa atcctttaca aacaagcaaa tgctgaggaa ttttgtcaac accaggcctg 103260

ccttacaaga ggtcctgaag aaaacactaa atatggaaag gaaaaaccag taacagctac 103320

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gggcaaaata gccagctagc atcataatga caggatcaaa ttcacacata acaatattaa 103440

ccttaaatgt aaatgggcta aatgccccaa ttaaaagaca cagactggga aattgaataa 103500

agagtcaaga cccattggtt tgctgtgttc agaagaccca tctcagggtg aaaagacata 103560

catgggctca aaataaagaa atgaaggaat atttaccaag caaatggaaa gaaaaaaaaa 103620

gcagcggttg caatcttagt ctttgatgaa acagacttta aaccatcaaa gatcaaaaga 103680

gacaaaggag ggcattacct aatggtaaaa gtatcaatgc aacaagaaga tctgactgtc 103740

ctacttatat atgcacccaa tacaggagca cccagattaa taaagcaagt tcttagagac 103800

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ccatgtttag agggaaattt atagcactaa atgcccacag gagaaagcgg gaaagatcta 104340

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aaagaataat aaaggggata tcaccaatga tgccacagaa atacaaacta ccatcagaga 104640

atactttaaa cacctctatg caaataaaat agaaaatcta aaagaaatgg ataaattcct 104700

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gagggattaa cagtcaaatc ctaacagagg tacaaagaag agctagtact attccttctg 104880

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tccctgatga acatcaatgt gaaaatcctc aataaaatac tggcaaactg aatccagcag 105060

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ttcaacatat tcaaatcaat aaacataatc catcacataa acagaaccaa tgacaaaaac 105180

cgtatgatta tcgcaataga cgcagaaaag gcctttgata aaattcaata cccaatcatg 105240

ctaaaaactc ttaataaact aggtattgat ggagcatgtc tcaaaataat aagagctact 105300

tatgacaaat gcatagccaa tatcatactg aatgagcaga agctggaagc attccctttg 105360

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atttcttcac ataattagaa aaaactactt tcaatttcat atggaataga aaaagggcct 105960

gtatatccaa gacaacctaa gcaaaaagaa caaagctgga ggcatcatgc tatctgactt 106020

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tattggatct ttgacaaact ggacaaaaat aagcaatggg gaaaggattc cctatttaat 106200

aaatggtgtt gggaaaactg gctagccata tgcagaaaac tgaaactgga tcccttcctt 106260

acaccttata cacaaattaa ctcaagatag attaaagaat taaatgtaag acctaaaacc 106320

ataaaaaccc tagaagacac tttgggaggc cgaggtggat ggatcacgag gtcaggagat 106380

cgagaccatc ttggctaaca cagtgaaagc ccatctctac taaaaataca aaaaattagc 106440

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catgagctga ggaggttgag cttgcagcaa gccaagattg tgccactgca ctccagcctg 106560

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agaaaacata ggcaatacca ttcaggacat aggcatggga gaagacttca tgactaaaac 106680

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cactgttggt gggagtgtaa attagttcaa ccattgtgga agacagtgcg gtgattcctc 107160

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aaggattata aatcattcta caataaagac acatgcacac gtatgtttat tgtagcacta 107280

ttcacaatag caaagacttg gaaccaactg aaatgcccat caatgataga ctggataaag 107340

aaaatgtggc acatatacac tgtggaatac tatgcagcca taaaacagga tgagttcatg 107400

tcttttgcag ggacatggat gaagctggaa accatcattc tcagcaaact aacacaagaa 107460

cagaaaacca aacaccatat gttctcactc ataagtgtga gttgaacaat gagaacacat 107520

ggacacagga aggggaacat cacacacagg ggcctgttgg ggagttgagg ctaggggagg 107580

gattggatta ggagaaatac ctaatgtaga tgatgggttg ctgggtgcag caaaccacca 107640

tgacacgtgt atacctatgt aacaaaccca cacattctac acatgtatct cagaacttaa 107700

agtataataa taataagata cagaactgca gaatgaataa gaactcacca accatctgct 107760

gccttcagga gactcattta agacataagg actcacataa acttaaagta aatgggtgga 107820

aataataata agtggtgtca ctgatgtgga ggtagattat aaaactctta tcatatgctg 107880

gtggaagatc aaaatgataa aacgaattaa aaaatcagtc agatggtttc ttaaaaagtt 107940

ccatcaatat gcctctatct tacaaacctg caattctatt cctgaatctt tatcccaagg 108000

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gatcatttac atttcctcca aaagaggaaa aactaatttc tgttgaaaga aaccaatgta 108300

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tgcaggttag taatctgagg attctgacaa gttgggtcaa cgttcctagg aggcatgaat 108720

gggagtgcat tctctaagat ccctccaccc cagggtcctt gctttctgtg cctcttactc 108780

cattgttttc tgactcctct gtagccactc gacctcttca gatcccattg tctacccagc 108840

catcgccctt tatgacttgg gtcccactgt tctttcatct catcctccat tccctcagtt 108900

tcggagtggc tgccgctagc agaggatgga ctgagagcag gagaggtggt cctgcccagg 108960

aacccatcct agagaaatgg catcctgtct gggagctagt tttttagggc aggttttata 109020

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ggctggcctg ggaatggtat catgttggat gttgtttctt ccctgaagta atatatatca 109200

gttacaattt acatgttact gcagagtcct agagagagac acagagaatg agacagatac 109260

caatacattt ttatgtgcat taaaaaaatc taaggccagg cgcagtggct cacacctgta 109320

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ctggctaaca cggtgaaacc ctgtctctac taaaaataca aaaaattagc caggcgtggt 109440

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ggaggcagac cttgcagtga gccgagattg cgccactgca ctccagtctg ggcgacagag 109560

cgagactccg tcacaaaaaa aaaaaaaaat ctaaaatgca ctcttcaaaa tctatgtcat 109620

ttattctgga ggaatgcagt tggcagaagg aggaagatat tccgaatttt tcttgtatac 109680

atttatgtat gatctcagtt tttttatgga tcatagacca attttgatat tttaaaataa 109740

aaattataat ctatcttgga aatttacatg gttctttaga acttgaggac cgtttttgct 109800

tttcggaata ttattgtacc taaaatggga atattacaac gtcacttttt aacactttgt 109860

tataacaaag tttagacagc gctgggtgcc cctgaatttt ttcccgcctc ttgtgacctg 109920

tgttgttttg gaatttgcag tggcctgacc gagaactact gcaggaatcc agattctggg 109980

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agtttctcca aaagttcaat aaatgcactt ttaccctaca aacctgcaat cctgtttgtg 116460

aatatttacc ccacagaaat ggaaacataa gtccacgaag acatctccaa gaatattcat 116520

agcagcttta ttttttataa ccccaaactg tagacaattt caatgtcaat caataagaaa 116580

atgaataaat aatttgtgaa ctagtcatac aatggcatac tgttcagcaa taaaagggag 116640

catgtttttg atactctcaa atagtatgga agatgctcaa aaatattaca ttaaagaaag 116700

atgccagata acaaaaatga acattatgta tgagtctatt gatgtaaggt tccagaaagg 116760

taaaactaat ttctggtgaa agaaaccaat atcatttgcc tctggccatg ggaagagagt 116820

agcagagatt gattgagcag taaaacgaag tttttttctg gggtgatgta aatgtcctgt 116880

attgtgattg aagtgtgagt tacacaagtg tacatgttca tcagaagtca tcaaactaca 116940

tctaagatct gtgcatttga ctatacatga aaatatacct cagttgaaaa tagatcaata 117000

acctccctca tatactatac ttgctaacac agccagctgc ttggagaacc agcttgctgg 117060

aatggagaat ctgggcttga gactgggtca catgtataga gtctctacag agacaatgtt 117120

gcattcccac ggtacataat acatttcaag gtttctcaga cagccacatg tcatgaatgt 117180

gaggattctg agaggttgga gcaacattcc tgggaggaac gaaggggagc acattctcca 117240

agatccccca ccaccggggt cctcaccggc tgtgcttttt tttttttttt tcttgacaga 117300

gtctcgctct gtcgccaggc aggagtgtaa tggcccaatc tcggctgatt gcagcctcca 117360

actccagggt tcaagagatt ctcctgcctc agcttcatga gtagctggga ctacagatgt 117420

gcgccactgc gcccagctaa tttttgtatt tttagtagag acggggtttt gccatgttgg 117480

ccaagatggt ctcgctctgt tgacctcgtg atccacccgc cttggcttcc caaagtgctg 117540

ggattacagg cgtgagccaa agcacccagc ctgtgcctct cacttactca attgtttttc 117600

tgaaccctcc atagctggtg gaccttttca gatcccatag tctagccagc cctctcactt 117660

tatgccttgg gtcccactgt tccttcatct catccccctt ctgtcagtcc cgcagtggct 117720

gtggccagta gaggatggac tgagagtagg agaggaggtt ctgcccagga acccatccta 117780

gagaaacagc atcctgcctg ggacctagtc ttccaggtca gcttttataa gtcttttaga 117840

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tttcactgta aatgcagagc cttttagcta cacgactagt acagagagta agggaggctg 117960

gcctgggaat gatatcatct tggatggcat ttcctccttg gagaaatata tgttagttcc 118020

aactcacatg ttactataca gtcctgtaga aagagataca gagagttaga caggtataga 118080

cgcatttgta tatgcataac aatctataag acacacatca aaatccgtat accggttcct 118140

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atttatgtat gatctcagtt tttatatgga gcattgatag ggtttggcta tgtccccacc 118260

caaaatctca tcttgacttg taatctctat aatcctgata atccccatgt gtcaagggca 118320

ggaccaggtg gaggtaactg gatcatgggg gcagtttctc ccaggctgtt ctcatgacag 118380

tgagagagtc tcctgagatc tgatggtttt gtaagtgtct ggcatttccc ctacttgcac 118440

ttactctgtc ctgccgcctg tgaagaaggt gcctgtttct cccttgcctt ctgccatgac 118500

tgtaaatttc cagaggcctc cccagcaatg tggaactgtg agtcaattaa aactcttttc 118560

tttgtaactt acccagtctg tctcgggtat ttcctcatag caatgtgaga acgggctaat 118620

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tgcacaaatg ggaagttgag gaacatttgt gttgtggcaa ttgtatgata cctttaatgg 118740

gaatatttca aagacacttg ttaagacttt gttagaacaa aatgtagagg gtgctggatg 118800

tccctgaata ttcttccgcc tcctgtaact tgtattgctt tggaatttcc agtggcctga 118860

caatgaacta ctgcaggaat ccagatgccg atacaggccc ttggtgtttt accatggacc 118920

ccagcatcag gtgggagtac tgcaacctga cgcgatgctc agacacagaa gggactgtgg 118980

tcgctcctcc gactgtcatc caggttccaa gcctagggcc tccttctgaa caaggtaaga 119040

agtctgtgtc ttaccttgtc tagcacatac ctctctatgt gcttggacaa cgggatgaaa 119100

agacatgaaa aaccacactg atgcagaagc ctttagtgct acacgggagc tcgagtgttg 119160

gttgaggttc tgccatgacc aaggaagtct cagtgccgtc cctgggaaag ccagagctgt 119220

gatttttggc acaacttgtg ggagtagtga ctttaggact ggcgcaaaac ctccagggtg 119280

ctcaacttaa ccactcacct tattctaaaa tgggttattt cagtgtccca gtcaaattcc 119340

tattctaaca tgctgtcaac tgtgtgatta tttccaagcc aataagcatt tccagtaatt 119400

tcttaaaata gtgttcattg cagtcttcag cgttgtggct cctgagggat gtggcccctg 119460

attctgtcgt cctagagaag cctgacatga ctgcattgat tctgtatcgt cctgggtcta 119520

tgtggctgcc tggctgtctg taatcatctg ttttattttt atttttttct acagactgta 119580

tgtttgggaa tgggaaagga taccggggca agaaggcaac cactgttact gggacgccat 119640

gccaggaatg ggctgcccag gagccccata gacacagcac gttcattcca gggacaaata 119700

aatgggcagg tctggaaaaa aatgtaagcc actttgattt ggactctttt tccctttgct 119760

gacaaatctt ttcaaacaga agaggggcag aggaaaatac tggaaagact tcaggaggct 119820

aagcgtaatt agccttagca tggaaagtgc aagcagcaca ggccagcaaa gccccacgcg 119880

tgtgggggtt ctcaggcctc ttctcttttg acatttcttt actgtttcca ttgttgggtg 119940

ctgtttctcg tttctagtgc ttgtcctcta agccaggggt ccccactcca gtactggtac 120000

tggtactggt actggaactg gtaattatct gtggcctgtt aggaactggg ctgcacagca 120060

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ctctcatagc tgcctgagct ctgccagctg tcagatcaga ggcagcatta gattatcata 120180

gcacaaaccc tattgtgaac tgcacatgtg aggaatctag attgcatgct ccttatgaga 120240

atctaatgcc tgatgatctg tcatgcttcc atcaccccca gatgggacca cctacttgca 120300

ggaaaattag ctcagggctc ccactgattt taccttatgg tgagatgcac atttatttca 120360

ttatatatta caatgtaata ataattgaaa taaagtgcac gataaatgga aggtacttga 120420

gtcatccttt aaccatcgcc ccctcacccc aggtgcacag aaaaattgcc ttttatgaaa 120480

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atgccctcta tgaggcttaa gtcagatttt tctagaaaag atttggatgg gccatcaggt 120600

caccatgaga cttcccttag cctcatgcat tctctgtgat ggtttacttt ggggcctatg 120660

aatagggaag actgagatat aggaaaaacc aaagtgtctg tgttccccca ctctcacacc 120720

catgtaacat aacacttctc acaccagata tggggggatt tctcctcaca ccccaagcga 120780

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gagacagtgt cagatcccac aagttaaggc tcagtcctac aagactgccc cactgcagat 120900

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agccaggtgg aagagatgca cagggcaagg cacgtgggaa ggggctcaga gcctctatgc 121140

cctctccagt gcaccagtcc ccagtaccct aagtgttcag caacccagaa gctctccaag 121200

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gctgaacagt tccaaccctc aagtcacatg gttggttccc ttggcaacca gcccctgggg 121380

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gggatttagg agctctgtgt taagaactgg ggggcagaga cccaatatac atttcttatt 121500

ctatcacaat atcacaggaa gctaaggatg atactgcctt tgtgtgtctt ggctgtggat 121560

ggtgcataat gcatggaagt aagcatttct gaatcaacag caaacaggct ttatcaggta 121620

gaagacccct cagcgcccca gggacaaagc tcatcaatga tgtcccactg tcctctgagg 121680

ctctagctct aagacctcca gtgggtcaag ctcctggaga agtggcacat tctccaaaga 121740

cccttcaggg tcaccacacc ctggttaagg gtgtggcctc ataactcctt ttgactatga 121800

ctgatggctt acagcataga aagaaataac tttgtcaaaa aatataataa tgatagaaag 121860

gaagaaggaa cgctcccttt tgtcttctaa gaatagatgt gaaatgtgtg tgccttagaa 121920

tatcttctcc ctctcctgct ccacgtgagc tggagcttac atgcctgctt gttttcagta 121980

ctgccgtaac cctgatggtg acatcaatgg tccctggtgc tacacaatga atccaagaaa 122040

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actgcttcct taatatggat ttggaaaaaa aaaagcaaaa aaaacagaaa atggcttttg 122160

agctgagtgc ttctggggag gagatggctg ccctctccac cagagcctgc ttttcatcat 122220

ggccaccttg aacctgccct actattggcc ccatttgtta ggaaaacacc cgcccctccc 122280

accacacaca cataaataaa ataaatgtca aattcccaaa gggcaaactt agaggtgatc 122340

taatcagccc gggatagtcc caccgaaccc ttctttgtct agcgtgggat gcatgaaaaa 122400

caaatttaga gtcattatga tgaaaaactg tcctcttctg cagctgagaa gaaaaaaaaa 122460

atacgagcag caggaaacag ctaagcatgt aatgcacatt gtaaacctca gatggccatc 122520

ctaggaaatc aatgaagggt agtgcagctc tttagcccca gatggccttt ctcgtaagat 122580

tactactcat gagtcccatt agcgacattg cttagagact gcttgttagg ttccttcctc 122640

attgctctga gactcttatt gggagtatga ggcttggatc aggggaaggg gaattgacat 122700

tagatcttaa atgattgggg taacaaatcc atgggggaaa aaaagccact tgtacttgtt 122760

ccctattttc ttcctgctga ccaatcaact tgtctgtccg agttacagaa caccaccctg 122820

gacttttctt ttgtgtaatt tggttgcttg tggttgggtc tgccatgtga agggaccttg 122880

agctggggga agaaggttgg cctccaagtc cactgaagac cagcatcctg agattgcctg 122940

gggaggtggt acagggcagt gatgaagatc atgggagcca cactgcccat cgtcacattt 123000

gggccactcc tggggagagc aagagggaag aaggagaggt tagggtgata ggaaagattc 123060

tacttggcca atattattat aatgtggcat tgtggtctct ggatttagtg tgagttgata 123120

gctgactttt ttctcgagtg ggtgcttttg ttctattttg tcggtgctat tgcagaagca 123180

tcttggtggt tcctctacct caaagtctct tgatggggtc agttccagtt ctccgcttct 123240

ggccccatct agtacacgcc actgcctctc actgcctggg ctctctatcc ttgacaggct 123300

gccttgaatt taagcccagt ctgacttacc tgcctcaaac acccacagta gtgcctggga 123360

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tgtcctcacc cacattgagg atgtatgaga atcaggttct tagagattgg agaaagaagg 123480

aagaatggga acaagatttc ttccaatgga ctgtgaggtt ccccacctta ctttgatgta 123540

agacaagtga ggttaacccc aagcctggtg aggagggttc ccatcagaca cttggaaatc 123600

ctgaggactg tttcctgcag aaggatgtgg ttggtgggat attcaggttt gactcatgat 123660

tgagaaagtt agagcctctg gttggagaaa gagtttaata actatttcat ttccaccaac 123720

acattcagta cgaataataa ataagtaaaa ataaatagaa acattcagtt ttattttgaa 123780

tagtaggagt agggtataat ttctgtagtt actcttttag tacaatgatg catgtttact 123840

gtatgtaagg catactagca gaaattgagc tcagcactag aaaagatgat tgcattccat 123900

gccatgcttc ttttttacaa aagacttcta tagatagatt ctcaaaacaa cccacagcaa 123960

atgaaaagtt atttggaaaa ctcaggttcc agattcactg gagtgtagaa tctctggttg 124020

gttggggagg aatttcctct tgcagttgtt attaataatt atatgaataa ttattaacta 124080

tattaatatt tatagttttg aagaccttga agggctggag acaacagaga agcatttttg 124140

aacaccctct gtagcccctg cactgttgta ggcattgatg ggtggtacca aagatgggac 124200

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aagaagaata gaggcacatg tgtgtaaatt acccccacag cagtcagtta gtcatgggag 124320

gctccccaga agaactgtcc tgaagctggc tgagagaagg caacatttca acataggaca 124380

gttatccttg ctacataaaa tcacatacac acatgcacat atgtccacac acagagactc 124440

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atttccttga aaggagagtg tcctttgttg tttactacca ctttttaaac ttagaaagaa 124560

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gtgcttggaa ttcgtcctga attaaacgac acaattgcta acttggactc aaatgcgact 124680

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ccatgtaagc cccacaaaac ccttctacat ttacacagaa cccacacagc tgatgcatca 124920

atacctgcct ctctgttttc tgaaggagga aaaaatatag aaaaattaaa aaaagttata 124980

ttattatagg ttctctactt ggaaaatagc caaaatacaa atctttttct tgatctgggc 125040

agttccatca aaatctgtag gcacagtgat ttgcaccaag ttccaatact tttggaaaat 125100

attgaagatg ctctgagggt ttctatggat atccattgtc tcactgtcag atgaaaagaa 125160

agggaagttt ttagaaatgt gacactttgc agtgagggag gacaagagca aacttaccta 125220

cagtctatca caggcacaga ttttttttta cacttttgtg aatcattgaa ttcaatgccg 125280

aggctattca tctattcaca aacacatgaa caaattatgg gttgtgatcc ccataaatga 125340

agagtaatca gtccgaaccc acagaacctg gacattttgg gtatcgtttc agtggaacat 125400

gcaattcgta agttcagttt gcttgggtgt ctcttaggaa gaacacatag gacacagacc 125460

catctgcctg catgttttgc ttcctcatct cctttctaca ccagggcacc tgtgctcaat 125520

tgctgttctc ctctaaagag acttccttct gtaagtttgt gaaatgccat cgacaaacct 125580

gatcgcatcg catttcactc tgctgttgag ttgatttttc tttactttat cgtttgtaac 125640

ttcttgctct acagagcttt caccttccac atatttcaga ttcattcttt cctaaactgt 125700

gtggtggtct atgtcctcac tgactatcaa catactgcca tcatgcactt cctatctcta 125760

ttcctcttcg ttgcaatctg gctccaagtg gctcacacca ttattctgat ctatcaactg 125820

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agtgaccttg catagatctt gtcataaaaa atgaaagaga ccttgggaag gtcttgggct 126000

ggtcactttt gtcagagtcc agggctgtgg ggtgaaagcc acagctatag agcttcattc 126060

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tttctactat cctgacgttg ggcggtagtc ctttgctttg ggaatatgaa catgatcaaa 126240

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gaccaaagcc ttggcatgtt ttctttctag gtttggaaag cacttctgtg gaggcacctt 126360

aatatcccca gagtgggtgc tgactgctgc tcactgcttg aagaagtacg tttaagggaa 126420

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tgctctagag caatatctga ggctgaataa tttataaaga aaagagttta attggcacat 126780

gtttctgcag gctttacagg aagcaggatg ctgtcatctc ctctgcttct gtgtgggcct 126840

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caggagcaag agacagagag agatggggtg ggggtgctgc acaataccaa atgaccagac 126960

tttgcaagaa ctaagagtga gagctcactg atcaccatga agatgtggcc caagccattc 127020

aagagggatg cacctctatg atccaaaccc ctttcacagg ccatagctcc atcactgggg 127080

actacagttg aacacgagat ttaggtgggg acaaatatac aaactatatc acagtctctg 127140

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cttgccactc ataagtcact gattctgggt ggccgagggt gtcagaggga cagcgccaag 127260

ttcatggcac agaggatacc tgaaggggct ggaccatatt tttctcttga catcctcatc 127320

ttttctaggt cctcaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 127380

aacctcgaat ctcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacaa 127440

gcagatattg ccttgctaaa gctaagcagg tactcgctca cctgtggtct tcaccccacg 127500

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tcaagttaag ggtgttagat tatttttcat gtgaaattag acagactgcg tttctaaaca 130080

tggtgcaaaa cagtaacgac aaaagttgta attaaactat tcttcttccc aaatacccac 130140

atgtctaatg tgtgtgtgag ggtgttaggc aggggacctg aagctggggg agaggcagac 130200

agttcccatg gccccaagtc taggatggca tttggtattg gttgatgggt gagagcaaga 130260

gagggaatat ttttgtgcat gatgtggtat cagcacctgt actacatttt atggattcct 130320

tcttctcttt gcggtatgcc ctgacaataa ttatatccgt cagccttacc cccttggcag 130380

taggaaaact gaaactgtct taaagtctca gctctacttt ctcagaggtg caggcaaggg 130440

cactgggagt ctggggccct ggaaaactgt tctgactctg ccacttgcca gatagacctg 130500

aactagacac gttacctctt tgtaccactt ggctctaatc ccttatctgt aaaaccagca 130560

ttttcaaatg gtgctttgca catcagcctt ttgcataagc tttgatttga taaaatgttt 130620

tttgtgtttt taaaaagatt aaaaaccaca ggtttagata atttcaaagt aggcttccct 130680

ttttctgtca ttttcctatt atttttaaaa cctcacctcc ttgactcctt gttccctttt 130740

tctgcactgc tgagtctggg agcactgagg ccaggtaaaa ggaaacttgg caaatgaggg 130800

gcacctatgg gtgtgggagg ctgctcctgg tgtttgcata ttttaaaatt taaatgctac 130860

aaaccactgt gagttaggta ttattgttcc tattttacca ttgaggaagc tggggctcag 130920

agaaggtgga gggtggtaca gacaaacctg aattggaacc ctggctcctg cctatgggct 130980

gtcaggactt agaaaagtcg tgagctctcg ctgattgttt cctcagctga tgtgggctgc 131040

agggctgtta tgggggaaat aataagaaag tgcatcaagt gctgagcaca tcctaagcac 131100

tccatcatgg cagctcctac tactaataaa gaatagaatt atatctaaca tgattctttc 131160

ttgcaagtga cagaaaatcc aactcaaatt ggattaagca aaacaaggga aattcttagt 131220

gagctgcaaa gttttcaggc tcacatgatg gccccaaatc ccaggtcctc ccaatcatgg 131280

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gtggctgtac cgggaaagaa taagaaaggc cactctccca attatgtgaa caatagtctg 131400

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tctgacctgc accaattgtt ccatgttgga ggtgaaggca agaccccact aatacccata 131520

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gggcagccag aaagcaaaca gagcctctat gatacctcaa ctgatgaaag catgaagcta 131640

aaatcataag gatctgggtg tgagttctgg ctctcccatc ttccatgtga cattgggcag 131700

ttatttaatc tcttttagcc tccgctttct catcttacat atgagataat tgtgaggatt 131760

aagattacac ataatcatca tcatcaccgt ccaccactac caccatcatc cccatcaaca 131820

tcatcgccac cactatcatc attcttactg gcactaccat caccatcacc accattccac 131880

caccatcacc aatatcatca ctgtcaacat cattaccacc atcaccatca ccaccaccat 131940

catcattact accactacca ctactaccac catcaccatc accaccattc caccaccatc 132000

accaatatca tcactctcaa catcatcacc atcaccatca ccaccaccat catcatcatt 132060

actaccacta ccactactac caccatcacc atcaccactg tcccactact atcagcatga 132120

catcaccatc accaccacca tcatcattac caccgctact accaacatca ccatcaccac 132180

aattctactg ccatcaccat taacattacc accaccatca tcactatcac catcaccacc 132240

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ccatcatcac aatgatcact gtaaccatca ttactaccca ccaccatcac cactactcca 132480

ccaccatcac cattatcatt accatcacca ttatcaccac catcatcatc accagcacca 132540

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gtttaatcat caccaccatc atcataaata aacatcacat aaccagggtg tagctgggtg 132660

ttgaccccag agcccactca ctgtttcctc tctcccaccc ccatccacac atttctaacc 132720

accatcctgc actgggctcc cagtctcctc tggtctcacc cacatgtcca ctgagaaaag 132780

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aactttctac atgttaataa tgacatcaga tcaatgggtg ttctcagctt ctcagaagga 132900

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aaatattttg agaagggtgc ccctttacac atctgtgcag tccaggtgat gcatcccatg 133320

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aaattgaata tcacaagggt gaggcaaagt aattgttttc cagtgacatt ttccactgtc 133860

acaccctttt agagaataat ttggcaatgt tactgtgaga tagaaatatg tctatataat 133920

tatgggaact gagacttcag aaagtaataa ggaataagaa tgaaatttat gaacaaacat 133980

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cactgagtgg cattcagtac attcacaatg gtgtgcaacc gtcaccatat ttccaggaca 134340

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cactttaatg ggtcagagag tccagtggca ttgggagctg ccttgtgttc tgcagcctca 134760

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