DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒。

背景技术

二代测序已在基因组测序中广泛应用，但是二代测序仅能产生短读长。高等真核生物，特别是植物的基因组含有大量重复序列，长度可达数万个碱基，二代测序显然无法应对这样复杂的序列测序。随着PacBio公司的SMRT单分子测序技术和Oxford NanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术的兴起，基因组测序可以直接进行长片段的测序，以获取更好的组装效果。然而，用于长片段单分子测序的酶对与DNA结合的污染物高度敏感，所以对基因组DNA的制备要求更高，要求提取得到高纯度的大片段基因组。

使用有机试剂抽提获取基因组DNA存在几个问题：有机试剂存在毒性、提取操作繁琐、DNA纯度不高等问题。

利用磁珠法提取DNA可部分解决以上问题，且可实现自动化大批量操作。但是利用磁珠法提取的DNA纯度仍然不满足三代测序的需求，仍需进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒。

目前磁珠法主要采用羧基磁珠进行基因组DNA提取，但是对于多糖多酚样本，羧基磁珠在吸附DNA时会吸附大量杂质，使得提取得到的DNA存在粘稠、有色、OD值不合格的问题。如何提取获得高纯度的DNA，满足三代测序的需求，直接影响到测序质量以及测定结果的准确分析。发明人在研究过程中发现：在DNA纯化的过程中，或者在基因组DNA的提取过程中，首先应用氨基磁珠进行处理，可以有效去除DNA中的多糖多酚物质；然后利用羧基磁珠进行处理，可以进一步提高DNA的纯度；由此可以提高所DNA的纯度，获得高纯度的DNA可以满足三代测序的需求。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种DNA纯化方法，包括：(1)利用氨基磁珠对含有DNA的样本进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(2)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。本发明所提供的DNA纯化方法，首先利用氨基磁珠进行第一纯化处理，氨基磁珠上的官能团-NH

根据本发明的实施例，以上所述DNA纯化方法可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，步骤(1)进一步包括：(1-1)在低浓度盐溶液条件下，利用氨基磁珠对所述含有DNA的样本进行第一吸附处理，以便获得第一吸附产物；(1-2)在高浓度盐溶液条件下，对所述第一吸附产物进行第一洗脱处理，以便获得所述第一纯化产物；所述高浓度盐溶液的盐浓度高于所述低浓度盐浓度的盐浓度。在低浓度盐溶液条件下，氨基磁珠可以吸附DNA，仅吸附少量杂质，使得DNA被吸附到氨基磁珠上，以此去除大量杂质；然后利用高浓度的盐溶液对于吸附有DNA的氨基磁珠进行洗脱处理，可以将DNA从氨基磁珠上洗脱下来，方面后续进一步纯化处理。本文中“低浓度盐溶液”和“高浓度盐溶液”是相对而言的，仅表示在进行第一洗脱处理时的盐溶液的浓度要高于在进行第一吸附处理时的盐溶液浓度。

在本发明的一些实施例中，所述高浓度盐溶液的使用浓度至少为1M，优选为2M。由此可以将DNA从氨基磁珠上快速洗脱下来。当然，盐溶液的浓度过高时，洗脱的DNA基本不会发生改变，例如使用3M的盐溶液进行洗脱与使用2M的盐溶液进行洗脱，不会影响到DNA的纯度和得率，所以高浓度盐溶液的使用浓度可以在1M～3M之间，所使用的高浓度盐溶液还不会影响到后续羧基磁珠的纯化过程。

在本发明的一些实施例中，所述低浓度盐溶液的使用浓度不超过0.2M。由此可以使得DNA被吸附到氨基磁珠上，且很少会吸附杂质。

在本发明的一些实施例中，所述高浓度盐溶液为氯化钠溶液。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)进一步包括：(2-1)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二吸附处理，以便获得第二吸附产物；(2-2)利用醇溶液对所述第二吸附产物进行第二洗脱处理，以便获得所述第二纯化产物。通过羧基磁珠进行处理，可以进一步纯化DNA，去除杂质，获得高纯度的DNA。

在本发明的一些实施例中，所述醇溶液的体积浓度为70％～90％，所述醇溶液优选为体积浓度70％～80％的乙醇溶液。由此可以有效去除溶液中的盐。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种基因组DNA的提取方法，包括：(a)将样本和裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶混合，反应，分离获得含有DNA的上清液；(b)利用氨基磁珠对所述含有DNA的上清液进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(c)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。

本发明提供了一种基因组DNA的提取方法，该方法通过利用裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶(RNase酶)对样本进行处理，分离获得含有DNA的上清液；然后利用氨基磁珠进行第一纯化处理，通过吸附DNA，去除大量杂质，获得第一纯化产物；进一步地，利用羧基磁珠对第一纯化产物进行第二纯化处理，获得第二纯化产物。所获得第二纯化产物中的DNA纯度很高，例如DNA的OD260/280在1.85以上，OD260/230在1.95以上。应用该方法可以得到高纯度的大片段基因组DNA，高纯度的DNA可以满足三代测序的需求，有助于提升测序读长和测序质量。

根据本发明的实施例，以上所述基因组DNA的提取方法可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述裂解液包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，焦亚硫酸钠，氯化钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，EDTA和吐温20。由此可以通过裂解细胞，分离获得含有DNA的上清液；而且不会影响到后续氨基磁珠的纯化处理过程。

在本发明的一些实施例中，所述裂解液包括质量浓度为1％～3％的聚乙烯吡咯烷酮，质量浓度为1％～3％的焦亚硫酸钠，0.1～0.5M的氯化钠，80～300mM的三羟甲基氨基甲烷，30～200mM的EDTA和体积浓度为1％～5％的吐温20。由此可以有效裂解组织和细胞。

在本发明的一些实施例中，所述蛋白酶为蛋白酶K，所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A(RNase A)。核糖核酸酶A作为内切核糖核酸酶，可以特异地攻击RNA上嘧啶残基的3’端，切割与相连核苷酸形成的磷酸二酯键，从而可以有效破坏RNA。蛋白酶K作为一种切割活性广泛的丝氨酸蛋白酶，可以有效切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，而且不会影响DNA的完整性。

在本发明的一些实施例中，在50～65摄氏度下进行所述反应，所述反应时间为1～3小时。例如可以将反应物置于水浴锅中在55摄氏度条件下孵育1～3小时，期间颠倒混匀数次。也可以在恒温震荡仪上于55摄氏度孵育1小时，转速可以设置为750～1300rpm。由此裂解组织或者细胞，同时使得蛋白酶和核糖核酸酶消化裂解出的蛋白质和RNA。

在本发明的一些实施例中，所述样本为植物样本。应用该方法对植物样本进行处理，所获得的基因组DNA纯度高，提取量高。

在本发明的一些实施例中，所述第二纯化产物中基因组DNA的OD260/280在1.85以上，所述第二纯化产物中基因组DNA的OD260/230在1.95以上。应用本发明的方法可以获得高纯度的DNA。

在本发明的一些实施例中，步骤(b)进一步包括：(b-1)在低浓度盐溶液条件下，利用氨基磁珠对所述含有DNA的上清液进行第一吸附处理，以便获得第一吸附产物；(b-2)在高浓度盐溶液条件下，对所述第一吸附产物进行第一洗脱处理，以便获得第一纯化产物；所述高浓度盐溶液的盐浓度高于所述低浓度盐溶液的盐浓度。

在本发明的一些实施例中，所述高浓度盐溶液的使用浓度至少为1M，优选为2M。

在本发明的一些实施例中，所述低浓度盐溶液的使用浓度不超过0.2M，优选不超过0.1M。

在本发明的一些实施例中，所述高浓度盐溶液为氯化钠溶液。

在本发明的一些实施例中，步骤(b-1)包括：将所述含有DNA的上清液和PBS缓冲液等体积混合，利用氨基磁珠进行所述第一吸附处理，以便获得第一吸附产物。

在本发明的一些实施例中，步骤(c)进一步包括：(c-1)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二吸附处理，以便获得第二吸附产物；(c-2)利用醇溶液对所述第二吸附产物进行第二洗脱处理，以便获得所述第二纯化产物。

在本发明的一些实施例中，所述醇溶液的体积浓度为70％～90％，所述醇溶液优选为体积浓度为70％～80％的乙醇溶液。由此可以有效去除溶液中的盐。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种测序方法，包括：基于待测样品，根据本发明第一方面任一实施例所述的方法或者根据本发明第二方面所述的方法对所述待测样品进行处理；基于处理产物，建库，测序，以便获得测序结果。利用本发明第一方面任一实施例所述的纯化方法或者利用本发明第二方面任一实施例所述的方法获得基因组DNA，所获得的DNA纯度高，杂质少，可以应用于三代测序中，用于复杂样本的测序分析。

根据本发明的实施例，以上所述测序方法可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述测序为三代测序技术。

在本发明的一些实施例中，所述三代测序技术为SMRT单分子测序技术或者纳米孔单分子测序技术。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种试剂盒，包括：氨基磁珠和羧基磁珠。应用含有氨基磁珠和羧基磁珠的试剂盒，可以用于DNA样本的纯化或者用于基因组DNA的提取，从而获得高纯度的DNA。

根据本发明的实施例，以上所述试剂盒进一步包括下列中的至少一种：裂解液，蛋白酶，核糖核酸酶，盐溶液和醇溶液。

在本发明的一些实施例中，所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A，所述蛋白酶为蛋白酶K。核糖核酸酶A作为内切核糖核酸酶，可以特异地攻击RNA上嘧啶残基的3’端，切割与相连核苷酸形成的磷酸二酯键，从而可以有效破坏RNA。蛋白酶K作为一种切割活性广泛的丝氨酸蛋白酶，可以有效切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，而且不会影响DNA的完整性。在基因组DNA提取过程中，应用核糖核酸酶A处理，可以有效去除RNA；应用蛋白酶K进行处理，可以有效破坏蛋白质，且不会影响DNA的完整性。

在本发明的一些实施例中，试剂盒中所述裂解液包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，焦亚硫酸钠，氯化钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，EDTA和吐温20。由此可以通过裂解细胞，分离获得含有DNA的上清液；而且不会影响到后续氨基磁珠的纯化处理过程。

在本发明的一些实施例中，试剂盒中所述裂解液包括质量浓度为1％～3％的聚乙烯吡咯烷酮，质量浓度为1％～3％的焦亚硫酸钠，0.1～0.5M的氯化钠，80～300mM的三羟甲基氨基甲烷，30～200mM的EDTA和体积浓度为1％～5％的吐温20。由此可以有效裂解组织和细胞。

附图说明

图1是根据本发明的实施例1所提供的花椒叶片DNA胶图，其中M1和M2为DNAladder，标号为1的样本为采用实施例1的实验组的方法所提取的DNA结果图，标号为2的样本为采用实施例1的对照组的方法所提取的DNA的结果图。

图2是根据本发明的实施例1所提供的樱桃叶片DNA胶图，其中M1和M2为DNAladder，标号为1的样本为采用实施例1的实验组的方法所提取的DNA结果图，标号为2的样本为采用实施例1的对照组的方法所提取的DNA的结果图。

具体实施方式

下面参考附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。同时，对于本文中的术语做如下解释和说明，这些解释和说明仅用于方便本领域技术人员理解，而不应看做是对本发明保护范围的限制。

本文中，术语“醇溶液”如无特别说明，是指含有醇的水溶液。例如，所述醇溶液的体积浓度为70％～90％是指含有70％～90％体积的醇的水溶液，也就是70％～90％体积的醇和10％～30％体积的水的混合液。

本文中，术语“低浓度盐溶液”、“高浓度盐溶液”在无特别说明时，并不表示盐溶液的浓度一定要在某一个浓度以上，或者在某一个浓度以下；低浓度盐溶液和高浓度溶液仅用来区分在利用氨基磁珠进行第一吸附处理时，用到的盐溶液的浓度低；在将DNA从氨基磁珠上洗脱下来时，用到的盐溶液的浓度要比吸附时用到的盐溶液的浓度高。也正是如此，发明人发现，在低浓度的盐溶液条件下，利用氨基磁珠进行吸附处理；然后利用高浓度盐溶液将DNA从氨基磁珠上洗脱下来，可以去除大量的杂质，以方便获得高纯度的DNA。这也是本发明的一个重要发现。应用该方法可以方便快速获得高纯度的DNA，具有重大的市场价值。

本文中，“氨基磁珠”是指表面含有丰富的-NH

“羧基磁珠”也是生物磁珠的一种，其表面修饰有丰富的羧基，一般也具有超强的顺磁性和单分散性等。应用氨基磁珠或者羧基磁珠的表面修饰，会帮助去除杂质，用于DNA纯化。但是在实际应用时，特别是在多糖多酚的样本提取中，如果直接利用羧基磁珠进行纯化，羧基磁珠会吸附较多多糖，这可能是由于多糖性质与核酸相似，在高盐脱水环境下容易吸附到羧基磁珠上。本发明应用在中性溶液里DNA带负电而氨基带正电的性质，首先采用氨基磁珠来提取DNA，而其他杂质不容易结合到氨基磁珠上，从而达到提取高纯度DNA的目的。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种DNA纯化方法，包括：(1)利用氨基磁珠对含有DNA的样本进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(2)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。应用该方法可以有效去除样本中的大量杂质，例如多糖多酚类物质等，获得高纯度的DNA。该含有DNA的样本可以是应用裂解液和酶消化处理后的含有DNA的粗提液。

在利用氨基磁珠进行第一纯化处理时，可以在低浓度盐溶液条件下，利用氨基磁珠吸附，使得DNA和少量杂质吸附到氨基磁珠上，通过清洗去除大量的杂质。然后再利用高浓度盐溶液将吸附在氨基磁珠上的DNA洗脱下来，所获得第一纯化产物中仅含有少量的杂质，后续利用羧基磁珠进一步纯化即可以获得高纯度的DNA。在本发明的至少一些实施方式中，高浓度盐溶液的浓度为1M，例如可以为1.5M，2M或者2.5M。在本发明的另一些实施方式中，低浓度盐溶液的浓度不超过0.2M，例如为0.1M～0.15M。在本发明的至少一些实施方式中，该高浓度盐溶液为氯化钠。在本发明的另一些优选实施方式中，该低浓度盐溶液为PBS缓冲液和包括质量浓度为1％～3％的聚乙烯吡咯烷酮，质量浓度为1％～3％的焦亚硫酸钠，0.1～0.5M的氯化钠，80～300mM的三羟甲基氨基甲烷，30～200mM的EDTA和体积浓度1％～5％的吐温20的裂解液等体积的混合液。在低浓度盐溶液条件下，氨基磁珠上-NH

在本发明的另一方面，本发明提供了一种基因组DNA的提取方法，包括：(a)将样本和裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶混合，反应，分离获得含有DNA的上清液；(b)利用氨基磁珠对所述含有DNA的上清液进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(c)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。通过样本和裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶混合反应，使得细胞或者组织中的蛋白质、RNA等分离出来，并破坏其中的蛋白质和RNA，分离获得含有DNA的溶液；然后分别利用氨基磁珠和羧基磁珠进行纯化处理，使得大部分多糖、多酚等杂质被去除，获得高纯度的基因组DNA。

在本发明的至少一些实施方式中，本发明还提供了一种基因组DNA的提取方法，包括：将样本进行液氮研磨，所获得的研磨粉末和裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶混合，在50～65摄氏度条件下反应1～3小时，离心获得含有DNA的上清液；在低浓度盐溶液条件下，利用氨基磁珠对所述含有DNA的上清液进行第一吸附处理，以便获得第一吸附产物；在高浓度盐溶液条件下，对所述第一吸附产物进行第一洗脱处理，以便获得第一纯化产物；利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二吸附处理，以便获得第二吸附产物；利用醇溶液对所述第二吸附产物进行第二洗脱处理，以便获得所述第二纯化产物。在本发明的一些优选实施方式中，所述低浓度盐溶液的使用浓度不超过0.2M，所述高浓度盐溶液的使用浓度至少为1.0M。在本发明的另一些优选实施方式中，利用体积浓度为70％～90％醇溶液进行第二洗脱处理。由此可以获得高纯度的基因组DNA。该方法特别适用于植物基因组DNA的提取。

本发明还提供了一种基因组DNA的测序方法，包括：基于待测样品，根据上述方法获得基因组DNA；基于所述基因组DNA，建库，测序，以便获得测序数据。所称的测序数据通过对待测样品的基因组DNA进行测序文库制备、上机测序获得。在建库时，可以利用测序平台的不同，选择不同的建库方法和测序方法。例如测序方法依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于Illumina公司的Hisq2000/2500测序平台、Life Technologies公司的IonTorrent平台、BGI的BGISEQ平台和单分子测序平台，测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序。当然，由于本发明所获得的基因组DNA的纯度很高，也可以直接应用三代测序技术进行建库、测序，包括但不限于PacBio公司的SMRT单分子测序技术以及OxfordNanopore Technologies纳米孔单分子测序技术。应用三代测序技术对基因组DNA进行测序，可以实现长片段DNA分子的测序，而且高纯度的基因组DNA，不会影响测序结果的准确性。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1提供了利用不同的方法对多种植物样本进行DNA的提取，并比较了不同方法所提取的DNA的结果。实验分为实验组和对照组，其中实验组利用氨基磁珠和羧基磁珠结合的方法进行DNA的提取；对照组仅采用常规磁珠法(即仅利用羧基磁珠)进行DNA的提取。分别如下所示：

(一)实验组：氨基磁珠和羧基磁珠结合

1、组织处理

分别取花椒叶片、樱桃叶片、银杏胚乳、紫金兰叶片、闽楠叶片、马尾松针叶进行液氮研磨。将所获得粉末分别分装于5mL离心管中(空离心管可在液氮中预冷)，每管分装粉末到约1.5mL刻度，每个样品分装2管。

2、细胞裂解

加入4.5mL 65℃预热的裂解液，立刻颠倒混匀，并加入100μl蛋白酶K和40μLRNase A，颠倒混匀。置于水浴锅中55℃孵育1-3h，期间颠倒混匀数次。若液体过于黏稠，可补加裂解液，颠倒混匀。将离心管置于离心机中，8000g离心5min。小心吸取上清到新的15ml离心管中，避免扰动沉淀。

其中裂解液的成分为：质量浓度为1％PVP40，质量浓度为1％焦亚硫酸钠，0.2MNaCl，100mM Tris-HCl，50mM EDTA，体积浓度为2％Tween-20。

3、基因组DNA提取

3.1取适量氨基磁珠，用1xPBS(pH 7.4)清洗两次，并用原体积PBS重悬，充分震荡混匀。其中氨基磁珠大小为1微米左右。

3.2根据离心管刻度估计转移出来的上清液体积，加入1倍体积的PBS。

3.3加入400μl清洗后的氨基磁珠，颠倒混匀后静置5min，期间可颠倒混匀1-2次。

3.4置于15ml磁力架上，直至液体澄清。

3.5保持离心管置于磁力架上，将上清倒到另一个15ml离心管。

3.6重复3.3-3.5一次，得到3管磁珠。

3.7将三个离心管从磁力架取下，分别标记。向离心管中倒入约10ml wash buffer(1/5浓度的裂解液)进行清洗，吹吸液体使磁珠分散。

3.8置于磁力架上直至液体澄清，保持离心管在磁力架上，将上清倒掉。

3.9重复洗涤1-3次，直至上清颜色澄清，最后用1ml wash buffer重悬磁珠，将重悬液全部转移至1.5ml离心管中。

3.10将离心管放在离心管架上，直至液体澄清。

3.11吸掉上清，加入150μl洗脱液(成分为NaCl，浓度为2M)，缓慢吹吸混匀，在液面之上加入10μl 20％SDS溶液，轻弹离心管混匀，室温放置5min。

3.12放于磁力架上，直至液体澄清。

3.13吸取上清至新的离心管中，分别取0.5μl进行Qubit检测。

3.14合并三管洗脱液，如果第一管浓度太低，或后两管浓度高，则第一管弃掉不用，仅合并后两管。

4二次纯化

4.1加等体积的Binding buffer(包括：1M NaCl,体积浓度为20％PEG8000)到3.14的DNA溶液中，并加入总体积的1/18的羧基磁珠(羧基磁珠在使用前经过清洗且使用前涡旋震荡20s)，颠倒混匀20次，室温孵育10min。

其中羧基磁珠为Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified MagneticParticles(Hydrophobic)，购自于GE Healthcare，货号为65152105050250。

4.2简短离心1s。置于磁力架上，直至液体澄清。

4.3弃去上清，从磁力架上取下离心管，加入1mL 80％乙醇进行清洗，吹吸液体使磁珠分散。

4.4重复上述两个步骤1-2次，直至清洗液澄清。

4.5弃去上清，保持离心管在磁力架上，吸去残余液体。简短离心1s，再次吸去残余液体。

4.6室温晾干1min。

4.7加入100-200μL预热到55℃的洗脱缓冲液(也称Elution buffer，成分为Tris-HCl，浓度为10mM，pH为8.0)，用移液器轻轻吹吸重悬磁珠，55℃孵育2min。

4.8将离心管放于磁力架上，直至液体澄清。

4.9吸取上清至新的离心管中。

(二)对照组：常规磁珠法(羧基磁珠进行DNA提取)

1组织处理

取花椒叶片、樱桃叶片进行液氮研磨。分装于5mL离心管中(空离心管可在液氮中预冷)，每管分装粉末到约1.5mL刻度，分装2管。

2细胞裂解

加入4.5mL 65℃预热的裂解液(1％PVP40,1％焦亚硫酸钠，0.2M NaCl，100mMTris-HCl，50mM EDTA，1％SDS)，立刻颠倒混匀，并加入100μl蛋白酶K和40μL RNase A，颠倒混匀。置于水浴锅中55℃孵育1-3h，期间颠倒混匀数次。若液体过于黏稠，可补加裂解液，颠倒混匀。加入1/3裂解液体积的5M醋酸钾溶液，颠倒混匀20次，在4℃或碎冰中孵育10min。在高速冷冻离心机中，4℃下8000g离心5min，吸取上清至新的离心管中。

其中裂解液的成分为：质量浓度为1％PVP40，质量浓度为1％焦亚硫酸钠，0.2MNaCl，100mM Tris-HCl，50mM EDTA，体积浓度为2％Tween-20。

3基因组DNA纯化

3.1开始前将洗脱缓冲液(也称Elusion buffer，成分为Tris-HCl，浓度为10mM，pH为8.0)在50℃预热。

3.2加入与步骤2所获得的上清液等体积的binding buffer(包括：3M NaCl,体积浓度为20％的PEG8000)和总体积的1/18的羧基磁珠(羧基磁珠提前经过清洗且使用前涡旋震荡20s)。颠倒混匀20次，室温孵育10min。

其中羧基磁珠为Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified MagneticParticles(Hydrophobic)，购自于GE Healthcare，货号为65152105050250。

3.3简短离心1s。置于磁力架上，直至液体澄清。

3.4弃去上清，从磁力架上取下离心管，加入与混合液等体积的70％乙醇进行清洗，吹吸液体使磁珠分散。

3.5重复上述两个步骤1-2次，最后加入1ml 70％乙醇重悬磁珠，将重悬液全部转移至1.5ml离心管中。

3.6弃去上清，保持离心管在磁力架上，加入1ml 70％乙醇，30s后弃去上清。

3.7保持离心管在磁力架上，加入1ml 70％乙醇，30s后弃去上清。

3.8简短离心1s，将离心管放回磁力架上，吸取残余液体，重复本步1-2次。

3.9室温晾干30-60s。

3.10加入80-300μL预热到50℃的洗脱缓冲液(也称Elution buffer，成分为Tris-HCl，浓度为10mM，pH为8.0)，轻弹离心管重悬磁珠。如不能完全重悬，则轻轻吹吸数次。

3.11放于磁力架上，直至液体澄清，一般在1-5min内液体澄清，如果液体不易澄清，补充适量Elution buffer混匀后再次用磁力架吸附至澄清。

3.12吸取上清至新的离心管中，保存于-80℃。

分别对通过上述实验组和对照组两种不同的方法所获得的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。

其中图1为花椒叶片的琼脂糖凝胶电泳图，其中M1和M2均为DNA ladder，标号1的样本为采用氨基磁珠和羧基磁珠结合提取的DNA的电泳结果，标号2的样本为采用常规磁珠法所提取的DNA的电泳结果。图2为樱桃叶片的琼脂糖凝胶电泳图，其中M1和M2均为DNAladder，标号1的样本为采用氨基磁珠和羧基磁珠结合提取的DNA的电泳结果，标号2的样本为采用常规磁珠法所提取的DNA的电泳结果。

从图1和图2的结果可以看出，应用两种方法提取得到的DNA完整性均很高。

同时对DNA的提取量以及OD260/280、OD260/230值进行测定，并以花椒叶片和樱桃叶片为例，测定结果如下表1所示：

表1不同样品的测定结果

DNA的纯度可以用OD260/280和OD260/230作为指标进行评估，纯净的DNA的OD260/280为1.8-2.0和OD260/230大于2.0。从表1中的结果可以看出，对比两种提取方法，常规磁珠提取得到的DNA纯度较差，提取总量较低，而本发明实验组采用氨基磁珠和羧基磁珠结合的方法提取得到的DNA纯度高，提取总量较高。

另外，利用银杏胚乳、紫金兰叶片、闽楠叶片、马尾松针叶作为样品，采用本发明的氨基磁珠和羧基磁珠结合的方法提取DNA，所得到的测定结果如下表2所示：

表2不同样品的测定结果

实验结果表明，采用氨基磁珠和羧基磁珠结合的方法对这些样本进行提取，所得到的DNA的纯度纯度均很高，电泳检测结果也表明完整性也很高(未专门示出)。

实施例2

实施例2所提供的DNA提取方法与实施例1的实验组不同的是，实施例2在进行细胞裂解时，所用到的裂解液成分为：质量浓度为1％PVP40，质量浓度为1％焦亚硫酸钠，1MNaCl，100mM Tris-HCl，50mM EDTA，体积浓度为2％Tween-20。所用到的裂解液成分中的NaCl的浓度比实施例1实验组用到的裂解液中的NaCl的浓度要高，实验结果发现细胞裂解之后，在利用氨基磁珠进行吸附时，由于裂解液中盐浓度高，所以使得DNA比较难吸附到氨基磁珠上，影响最后提取获得的DNA的纯度以及得率。

实施例3

实施例3所提供的DNA提取方法与实施例1的实验组不同的是，实施例2在进行细胞裂解时，所用到的裂解液成分为：质量浓度为1％PVP40，质量浓度为1％焦亚硫酸钠，0.2MNaCl，100mM Tris-HCl，50mM EDTA和体积浓度为2％SDS。实验结果发现：细胞裂解之后，利用氨基磁珠进行吸附时，DNA比较难吸附到氨基磁珠上。不受理论限制，一个重要的原因是裂解液中的SDS的存在影响到后续氨基磁珠的吸附，进而影响到最后提取得到的DNA的纯度以及得率。

当然，考虑到节省实验流程以及实验步骤，细胞裂解后的上清液可直接加入PBS，然后进行氨基磁珠的吸附处理。实验过程中，也可以结合实际情况，将细胞裂解后的上清液经由其他处理(例如高速离心或者透析等)，去除之前的裂解液，然后再配制合适的低盐溶液进行氨基磁珠的吸附处理。但这无疑增加了提取的难度，而且所增加的处理过程，也会对DNA造成破坏，影响DNA的得率。

本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。